李佳興，李慧梁，周良云，黃 蕾，楊 健，張衛(wèi)東*，郭蘭萍*

1中國中醫(yī)科學院中藥資源中心 道地藥材國家重點實驗室，北京100700；2第二軍醫(yī)大學藥學院，上海 200433

藥用植物在生長過程中經(jīng)常遭受環(huán)境中物理、化學、生物等不利因素的影響，這種環(huán)境脅迫影響可引起植物次生代謝產(chǎn)物的變化并啟動體內防御機制，從而降低或避免自身受到傷害，使植物呈現(xiàn)一定的抗逆性。如歐洲花楸(Sorbusaucuparia)等蘋果亞科(Pyrinae)植物感染火疫病后，在病灶周圍可產(chǎn)生聯(lián)苯類化合物，抑制火疫病歐文氏菌的進一步增殖[1,2]。最近，我們還發(fā)現(xiàn)以酵母提取物(yeast extract,YE)作為生物誘導子，刺激花楸樹懸浮細胞(S.pohuashanensissuspension cell，SPSC)一定時間后，會誘導聯(lián)苯類植保素(phytoalexin)noraucuparin和2′- hydroxyaucuparin從頭合成[3]。另一方面，藥用植物次生代謝產(chǎn)物通常是其有效成分，對于環(huán)境脅迫和藥用植物有效成分的形成，存在一個廣泛認同的結論，即環(huán)境脅迫下，植物次生代謝產(chǎn)物的數(shù)量會增加，從而導致植物有效成分積累[4]。

歐洲花楸(S.aucuparia)為薔薇科(Rosaceae)蘋果亞科(Pyrinae)花楸屬喬木或小喬木，原產(chǎn)于歐洲和亞洲西部，在我國北方部分地區(qū)生長[5,6]。該植物富含黃酮、花青素、雙聯(lián)苯酚、類山梨酸苷、生氰苷等化學成分；具有抗氧化、抗癌、抗炎、降血糖、利尿和擴張血管等生物活性和藥理作用[6]。其果實、枝葉及莖皮皆可入藥，用于治療腎病、痛風、風濕和感冒等疾病[7]。作為藥用植物，歐洲花楸需要生長一定時間后方可入藥，且植株藥用成分含量低，產(chǎn)量及質量不穩(wěn)定。用植物細胞培養(yǎng)技術來生產(chǎn)藥用次生代謝產(chǎn)物，具有產(chǎn)生速度快，生長條件易控的特點，目前已成為生物技術重要的研究與發(fā)展領域。為研究歐洲花楸細胞在環(huán)境脅迫條件下的活性代謝產(chǎn)物，我們利用前期研究建立的歐洲花楸懸浮細胞(S.aucupariasuspension cell，SASC)培養(yǎng)體系[3,8,9]，選擇能迅速引起SASC次生代謝響應的YE作為外加誘導子[8]，形成真菌次生代謝產(chǎn)物對歐洲花楸細胞的化學脅迫，并對懸浮細胞富集培養(yǎng)，進一步從中分離鑒定出13個化合物，分別為eriobofuran(1)、4,5- dihydroxy- 3- methoxybiphenyl(2)、2′- hydroxyaucuparin(3)、aucuparin(4)、trans- cinnamic acid(5)、citrostadienol(6)、β- 谷甾醇(7)、uvaol(8)、白樺脂酸(9)、tormentic acid(10)、alphitolic acid methyl ester(11)、fupenzic acid(12)、亞油酸(13)。選擇化合物1～3、5、8和12對15種植物病原真菌進行抑菌活性測試，其中聯(lián)苯類化合物1和2對蘋果輪紋菌具有顯著的抑制活性，MIC分別為3.13和6.25 μg/mL。

1 儀器和材料

1.1 儀器與試劑

核磁共振光譜儀(Bruker AV- 400 MHz，AV- 500 MHz和Avance Ⅲ 600)；ZF- 1型紫外檢測儀(力辰儀器科技有限公司生產(chǎn))；RE52C型旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；SHB- 3型循環(huán)式多用真空泵(鄭州長城儀器有限公司)；FA1604A型電子分析天平(河南恒信儀器設備有限公司)；柱層析正相硅膠(200～300目，青島海浪硅膠干燥劑有限公司)；半制備型HPLC(AS20005,Dubhe C18column,10 μm,20 × 250 mm，江蘇漢邦科技有限公司)；Sephadex LH- 20(Amersham Biosciences,Sweden)；超高效液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質譜(UPLC- Q- TOF- MS,Acquity UPLC- I- Class串聯(lián)Xevo- G2- S Q- TOF系統(tǒng),Waters公司)；高溫滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)；SW- CJ- 2FBC超凈工作臺(蘇州智凈凈化儀器有限公司)；HNY- 211B恒溫搖床(天津歐諾儀器股份有限公司)；恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設備有限公司)；酮康唑(阿達瑪斯試劑有限公司)；甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚、二甲基亞砜(成都市科龍化學品有限公司)；氘代氯仿、氘代吡啶(美國Cambridge Isotope Laboratories 公司)。

1.2 實驗材料

SASC(中國科學院植物研究所葉和春研究員實驗室)；15株病原真菌(河南農(nóng)業(yè)大學麻兵繼教授實驗室)；馬鈴薯葡萄糖肉湯(PDB，北京奧博星生物技術有限責任公司)。

2 YE誘導SASC培養(yǎng)與富集

YE誘導SASC培養(yǎng)實驗采用課題組前期建立的方法[9]。SASC培養(yǎng)于200 mL MS固體培養(yǎng)基的500 mL廣口瓶中，每7～10天繼代一次，25 ℃搖床轉速120 r/min暗培養(yǎng)。實驗中將減壓過濾后的3.5 g(70 g/L)懸浮細胞接種于含有50 mL MS液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，培養(yǎng)5天后給予YE誘導處理。用蒸餾水溶YE粉末，處理終濃度為3 g/L；處理時間分別設置為：處理后6、12、24、48 h。對照組加入與處理組等體積的蒸餾水，未處理細胞同為對照，記作：0 h。每個處理3個重復。收取細胞樣品用于檢測YE誘導前后SASC代謝物的變化情況。經(jīng)UPLC- Q- TOF- MS檢測，其結果與課題組前期研究報道基本一致[9]，即與對照組相比，YE誘導后，SASC中聯(lián)苯類植保素出現(xiàn)一定程度的積累，并且當YE誘導SASC 48 h[9]時，聯(lián)苯類植保素的積累整體處于較高水平。為分離包括聯(lián)苯類的次生代謝產(chǎn)物，擴大SASC培養(yǎng)體系至300 L，接種新鮮SASC(70 g/L)，培養(yǎng)至第7天，進行YE誘導，選擇誘導48 h時收集細胞，烘干，用于化合物分離。

3 提取與分離

取干燥的花楸懸浮細胞1 kg，用甲醇在室溫條件下冷浸提取3次，每次72 h，合并提取液，減壓濃縮得到浸膏約0.3 kg。所得浸膏經(jīng)正相硅膠柱色譜粗分，先用石油醚洗脫，后用二氯甲烷/甲醇溶劑系統(tǒng)(100∶0→0∶100)梯度洗脫得到組分A～K。組分A(石油醚洗脫組分)經(jīng)硅膠和Sephadex LH- 20凝膠柱色譜分離，得到1(3 mg)和5(2 mg)。組分C(二氯甲烷/甲醇99∶1洗脫組分)經(jīng)正相硅膠和Sephadex LH- 20柱層析分離，得到化合物6(3 mg)、7(50 mg)和13(3 mg)。組分D(98∶2洗脫組分)經(jīng)正相硅膠和Sephadex LH- 20柱色譜純化，得到化合物8(6 mg)和9(15 mg)。組分E(97∶3洗脫組分)經(jīng)正相硅膠、Sephadex LH- 20柱層析和Semi- Prep.HPLC分離，得到化合物2(2 mg)、4(2 mg)和11(2 mg)。組分F(95∶5洗脫組分)經(jīng)正相硅膠和C- 18柱色譜分離，得到化合物3(2 mg)、10(3 mg)和12(5 mg)。

4 結構鑒定

化合物1無色晶體(CHCl3)；1H NMR(CDCl3，600 MHz)δ：7.82(1H，d，J= 7.6 Hz，H- 9)，7.55(1H，d，J= 7.6 Hz，H- 6)，7.37(1H，td，J= 7.5，1.3 Hz，H- 7)，7.30(1H，d，J= 7.8 Hz，H- 8)，7.11(1H，s，H- 1)，5.83(1H，s，3- OH)，4.27(3H，s，4- OCH3)，4.01(3H，s，2- OCH3)；13C NMR(CDCl3，150 MHz)δ：156.1(C- 5a)，144.7(C- 2)，142.6(C- 4a)，137.5(C- 3)，132.5(C- 4)，125.6(C- 7)，124.7(C- 9a)，122.6(C- 8)，119.6(C- 9)，116.0(C- 9b)，111.5(C- 6)，96.2(C- 1)，60.9(4- OCH3)，56.7(2- OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[10]對照基本一致，故化合物1鑒定為eriobofuran。

化合物2白色粉末(CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ：7.53(2H，d，J= 7.5 Hz，H- 2′，H- 6′)，7.41(2H，t，J= 7.6 Hz，H- 3′，H- 5′)，7.32(1H，t，J= 7.3 Hz，H- 4′)，6.87(1H，s，H- 2)，6.70(1H，s，H- 6)，5.54(2H，brs，4- OH，5- OH)，3.98(3H，s，3- OCH3)；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.51(2H，d，J= 7.4 Hz，H- 2′，H- 6′)，7.35(2H，t，J= 7.6 Hz，H- 3′，H- 5′)，7.23(1H，t，J= 7.3 Hz，H- 4′)，6.72(2H，m，H- 2，H- 6)，3.88(s，3H)。以上數(shù)據(jù)與文獻[3]對照基本一致，故化合物2鑒定為4,5- dihydroxy- 3- methoxybiphenyl。

化合物3白色粉末(CHCl3)；1H NMR(CDCl3，600 MHz)δ：7.28～7.22(2H，m，H- 4′，H- 6′)，7.01～6.96(2H，m，H- 3′，H- 5′)，6.66(2H，s，H- 2，H- 6)，5.62(1H，s，- OH)，5.37(1H，s，- OH)，3.91(6H，s，3- OCH3，5- OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[3]對照基本一致，故化合物3鑒定為2′- hydroxyaucuparin。

化合物4白色粉末(CHCl3)；1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ：7.54(2H，d，J= 7.4 Hz，H- 2′，H- 6′)，7.43(2H，t，J= 7.4 Hz，H- 3′，H- 5′)，7.33(1H，t，J= 7.4 Hz，H- 4′)，6.80(2H，s，H- 2，H- 6)，5.54(1H，brs，4- OH)，3.96(6H，s，3- OCH3，5- OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[11]對照基本一致，故化合物4鑒定為aucuparin。

化合物5無色針晶(CHCl3)；1H NMR(CDCl3，600 MHz)δ：7.81(1H，d，J= 16.1 Hz，H- 3)，7.58(2H，m，H- 3′，5′)，7.42(3H，m，H- 2′，4′，6′)，6.47(1H，d，J= 16.1 Hz，H- 2)；13C NMR(CDCl3，150 MHz)δ：172.1(C=O)，147.1(C- 3)，134.0(C- 1′)，130.7(C- 4′)，128.9(C- 6′)，128.9(C- 2′)，128.4(C- 3′)，128.4(C- 5′)，117.2(C- 2)。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]對照基本一致，故化合物5的結構鑒定為trans- cinnamic acid。

化合物6白色粉末(CHCl3)；1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ：5.18(1H，brd，J= 4.4 Hz，H- 7)，5.11(1H，q，J= 6.7 Hz，H- 28)，3.12(1H，td，J= 10.5，4.4 Hz，H- 3)，2.83(1H，m，H- 25)，1.59(3H，d，J= 6.8 Hz，CH3- 29)，0.95(3H，d，J= 6.8 Hz，CH3- 21)，0.97(6H，d，J= 6.6 Hz，H3- 26，CH3- 27)，0.98(3H，d，J= 6.5 Hz，4- CH3)，0.83(3H，s，CH3- 19)，0.54(3H，s，CH3- 18)；13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ：145.8(C- 24)，139.1(C- 8)，117.4(C- 7)，116.4(C- 28)，76.2(C- 3)，56.0(C- 17)，54.9(C- 14)，49.6(C- 9)，46.6(C- 5)，43.3(C- 13)，40.2(C- 4)，39.5(C- 12)，37.0(C- 1)，36.5(C- 20)，35.9(C- 22)，34.8(C- 10)，30.9(C- 2)，28.6(C- 25)，28.0(C- 16)，27.9(C- 23)，26.6(C- 6)，22.9(C- 15)，21.3(C- 11)，21.0(C- 27)，21.0(C- 26)，18.9(C- 21)，15.1(4- CH3)，14.1(C- 19)，12.7(C- 29)，11.8(C- 18)。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]對照基本一致，故化合物6鑒定為citrostadienol。

化合物7無色針晶(CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ：5.34(1H，m，H- 6)，3.52(1H，m，H- 3)，1.00(3H，s，CH3- 19)，0.91(3H，d，J= 6.4 Hz，CH3- 21)，0.79～0.87(9H，m，CH3- 26，CH3- 27，CH3- 29)，0.67(3H，s，CH3- 18)。以上數(shù)據(jù)與文獻[14]對照基本一致，故化合物7鑒定為β- 谷甾醇。

化合物8白色粉末(CH3OH)；1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ：5.12(1H，t，J= 3.5 Hz，H- 12)，3.51(1H，d，J= 10.8 Hz，H- 28β)，3.21(1H，m，H- 3)，3.16(1H，d，J= 11.3 Hz，H- 28α)，1.08(3H，s)，0.97(3H，s)，0.93(3H，s)，0.91(3H，d，J= 5.8 Hz)，0.84(3H，d，J= 5.8 Hz)，0.77(3H，s)，0.73(3H，d，J= 8.9 Hz)；13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ：138.6(C- 13)，124.9(C- 12)，78.9(C- 3)，69.8(C- 28)，55.1(C- 5)，53.9(C- 18)，47.6(C- 9)，42.0(C- 14)，39.9(C- 8)，39.4(C- 19)，39.3(C- 20)，38.7(C- 1)，37.9(C- 4)，36.8(C- 10)，36.8(C- 17)，35.1(C- 22)，32.7(C- 7)，30.6(C- 21)，28.1(C- 23)，27.2(C- 2)，25.9(C- 15)，23.3(C- 11)，23.3(C- 16)，23.2(C- 27)，21.3(C- 30)，18.3(C- 6)，17.3(C- 29)，16.7(C- 26)，15.6(C- 24)，15.6(C- 25)。以上數(shù)據(jù)與文獻[15]對照基本一致，故化合物8的結構鑒定為uvaol。

化合物9白色粉末(CH3OH)；1H NMR(pyridine-d5，400 MHz)δ：4.94(1H，s，H- 29a)，4.77(1H，s，H- 29b)，3.43- 3.54(2H，m，H- 3，H- 22b)，1.79(3H，s)，1.22(3H，s)，1.07(3H，s)，1.05(3H，s)，1.01(3H，s)，0.82(3H，s)。以上數(shù)據(jù)與文獻[16]對照基本一致，故化合物9鑒定為白樺脂酸。

化合物10無色晶體(CHCl3)；1H NMR(pyridine-d5，500 MHz)δ：0.99(3H，s，CH3- 25)，1.07(3H，s，CH3- 24)，1.09(3H，s，CH3- 26)，1.10(3H，d，J= 6.5 Hz，CH3- 30)，1.25(3H，s，CH3- 23)，1.42(3H，s，CH3- 29)，1.70(3H，s，CH3- 27)，3.04(1H，s，H- 18)，3.38(1H，d，J= 9.2 Hz，H- 3)，4.10(1H，ddd，J= 10.5，9.5，4.1 Hz，H- 2)，5.57(1H，brs，H- 12)。以上數(shù)據(jù)與文獻[17]對照基本一致，故化合物10鑒定為tormentic acid。

化合物11白色粉末(CHCl3)；1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ：4.73(1H，s，H- 29a)，4.60(1H，s，H- 29b)，3.66(3H，s，- OCH3)，3.65(1H，m，H- 2)，2.98(1H d，J= 9.2 Hz，H- 3)，1.68(3H，s，CH3- 30)，1.00(3H，s)，0.96(3H，s)，0.91(3H，s)，0.89(3H，s)，0.79(3H，s)；13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ：176.7(C- 28)，150.4(C- 20)，109.7(C- 30)，83.9(C- 3)，69.3(C- 2)，56.5(C- 17)，55.4(C- 5)，51.3(- OCH3)，50.5(C- 9)，49.4(C- 19)，47.0(C- 1)，46.7(C- 18)，42.4(C- 14)，40.7(C- 8)，39.2(C- 4)，38.6(C- 13)，38.2(C- 10)，36.9(C- 22)，34.2(C- 7)，32.2(C- 16)，30.6(C- 15)，29.6(C- 21)，28.4(C- 23)，25.4(C- 12)，21.0(C- 11)，19.4(C- 29)，18.3(C- 6)，17.4(C- 26)，16.5(C- 25)，16.0(C- 24)，14.7(C- 27)。以上數(shù)據(jù)與文獻[18，19]對照基本一致，故化合物11鑒定為alphitolic acid methyl ester。

化合物12白色粉末(CHCl3)；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.35(1H，s，H- 1)，5.97(1H，s，- OH)，5.38(1H，t- like，H- 12)，2.52(1H，s，H- 18)，2.13(1H，m，H- 11a)，2.22(1H，m，H- 11b)，1.25(3H，s，CH3- 27)，1.23(3H，s，CH3- 25)，1.21(each 3H，s，CH3- 23，CH3- 29)，1.09(3H，s，CH3- 24)，0.94(3H，d，J= 6.6 Hz，CH3- 30)，0.80(3H，s，CH3- 26)；13C NMR(CDCl3，150 MHz)δ：201.1(C- 3)，184.2(C- 28)，143.7(C- 2)，138.4(C- 13)，128.6(C- 1)，128.1(C- 12)，73.0(C- 19)，53.7(C- 5)，52.9(18)，47.8(C- 17)，43.9(C- 4)，42.6(C- 9)，41.5(C- 10)，41.1(C- 20)，40.6(C- 18)，38.4(C- 8)，37.4(C- 22)，32.5(C- 7)，28.1(C- 15)，27.4(C- 23)，27.1(C- 29)，25.9(C- 21)，25.2(C- 16)，24.5(C- 27)，23.6(C- 11)，21.8(C- 24)，19.6(C- 25)，18.7(C- 6)，17.3(C- 30)，16.1(C- 26)。以上數(shù)據(jù)與文獻[20，21]對照基本一致，故化合物12鑒定為fupenzic acid。

化合物13無色油狀物(CHCl3)；1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ：5.34(4H，m，H- 9，H- 10，H- 12，H- 13)，2.77(2H，m，CH2- 11)，2.34(2H，t，J= 7.5 Hz，CH2- 2)，2.04(4H，m，CH2- 8，CH2- 14)，1.63(2H，m，CH2- 3)，1.25(14H，m，7×CH2)，0.87(3H，t，J= 6.9 Hz，CH3- 18)。以上數(shù)據(jù)與文獻[22]對照基本一致，故化合物13鑒定為亞油酸。

5 抗菌活性測定

選取15株植物病原真菌(見表1)，采用二倍稀釋法[23]測定6個單體化合物(1～3、5、8和12)的抗真菌活性。

配制抗菌活性所需的PDB培養(yǎng)基，分裝至錐形瓶中，每瓶裝入100 mL，高壓蒸汽滅菌后晾涼，取保存于4 ℃斜面中的植物病原真菌接種至PDB培養(yǎng)基中，28 ℃，160 rpm振搖培養(yǎng)2天。在超凈工作臺中操作，取培養(yǎng)好的真菌1 mL加入100 mL PDB培養(yǎng)基中稀釋100倍。在96孔板的第一排加入198 μL稀釋后的菌液，第二至八排中加入100 μL稀釋后的菌液。第一排孔中分別加入樣品，陰性對照(二甲基亞砜)，陽性對照(酮康唑)2 μL，移液槍抽吸混合均勻后吸取100 μL混合液至第二排，將其混合均勻后吸取100 μL混合液至第三排，后幾排操作同上，最后一排吸出的混合液棄去。

結果觀察：將處理好的96孔板置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、60 h后觀察活性結果，將最后一排澄清的孔所對應的樣品濃度定為該化合物的最小抑菌濃度，結果見表1。

表1 化合物1～3、5、8和12的抗真菌活性(MIC，μM)

6 結論

多種物理、化學、生物脅迫會引起植物體內次生代謝產(chǎn)物積累的增加。利用生物技術手段建立藥用植物細胞培養(yǎng)體系并形成生長脅迫環(huán)境，有助于從中挖掘更多結構特異、活性顯著的抑菌化合物，對藥用植物資源深度開發(fā)具有重要意義。我們利用前期研究建立的SASC培養(yǎng)體系，以YE作為外加誘導子，形成真菌次生代謝產(chǎn)物對SASC的化學脅迫，并對SASC進行化學成分與抑菌活性研究。從中分離得到13個化合物，包括4個特征性聯(lián)苯(1～4)，1個苯丙酸(5)，2個甾體(6和7)，5個三萜(8～12)和1個脂肪酸(13)。其中，化合物5～13為首次從SASC中分離得到。選取15株植物病原真菌，采用二倍稀釋法測定了6個單體化合物(1～3、5、8和12)的抗菌活性，發(fā)現(xiàn)聯(lián)苯類化合物eriobofuran(1)和4,5- dihydroxy- 3- methoxybiphenyl(2)對蘋果輪紋菌具有顯著的抑制活性，MIC分別為3.13和6.25 μg/mL。以上研究結果為SASC在抑菌方面的應用提供了理論依據(jù)。