嚴進紅，韓克躍，夏 杰，胡涵帥

貴州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，凱里 556000

紫杉醇是一種臨床應(yīng)用較為廣泛的抗癌藥物，被應(yīng)用于多種類型的實體瘤的治療。其中，紫杉醇極易導(dǎo)致痛覺過敏和痛覺超敏的毒副反應(yīng)，稱作化療導(dǎo)致的神經(jīng)病理性疼痛(NP)。這種疼痛屬于劑量依賴性的難治性疼痛，臨床較難治愈，往往影響化療進程，嚴重者可遷延數(shù)月甚至數(shù)年，嚴重影響患者的生存質(zhì)量及后續(xù)治療[1,2]。目前，對于NP的治療尚未建立有效的預(yù)防策略，西醫(yī)多采用鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜藥、抗抑郁藥、抗癲癇藥、抗氧化劑、激素類等進行治療，療效不佳。槲皮素(Que)是多酚類黃酮中的一種，現(xiàn)代藥理研究表明，其具有顯著的細胞保護作用、抗血小板、抗氧化、抗血栓形成和抗癌等生物活性[4]。有動物實驗研究表明，槲皮素可顯著減輕慢性神經(jīng)病理性疼痛，然而有關(guān)其是否對紫杉醇誘導(dǎo)的神經(jīng)痛具有緩解效應(yīng)，目前尚不明確。本研究中成功復(fù)制紫杉醇誘導(dǎo)的神經(jīng)病理學(xué)疼痛模型，并采用槲皮素進行治療，旨在明確槲皮素對紫杉醇致神經(jīng)病理學(xué)疼痛大鼠的改善作用并探索相關(guān)的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠50 只，8～12 周齡，體重200～250 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，許可證號：SCXK(滬)2016- 0007。所有大鼠飼養(yǎng)于SPF環(huán)境的動物實驗中心，溫度為22～24 °C，12 h晝/12 h夜日常節(jié)律，自由飲食、飲水，所有大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進入本實驗。

1.2 試驗試劑

槲皮素(純度98.5%，北京索萊寶科技有效公司)。紫杉醇(規(guī)格：30 mg/支；廠家：?？谑兄扑帍S有限公司；批號：161103)。2390 型Electronic Von Frey 觸覺測痛儀，II T336 型甩尾足底測試儀 (廠家：美國II TC公司)；鼠 抗 Wnt3α、β- catenin 、β- actin 鼠抗單克隆抗體、HRP羊抗鼠二抗(廠家：英國Abcam公司)；TNF-α，IL- 1βELISA 試劑盒(廠家：武漢博士德生物有限公司)；BCA 蛋白濃度測定試劑盒(廠家：南通碧云天生物有限公司)。

1.3 實驗動物分組及處理

采用隨機數(shù)字表法，將50只大鼠隨機分為5組：對照組、Paclitaxel組、Paclitaxel+Que 30、 Paclitaxel+Que 50組及Paclitaxel+Que 100組，每組各10只。除對照組外，其余各組大鼠均建立大鼠化療NP模型，分別于實驗的第 1、3、5及7 天采用腹腔注射的方式灌注2 mg/kg的紫杉醇溶液。同時，Paclitaxel+Que 30、50及100 組每天灌胃30、50及100 mg/kg的槲皮素溶液，連續(xù)7天。對照組及Paclitaxel組灌服等體積生理鹽水，連續(xù)7天。實驗設(shè)計經(jīng)動物保護委員會同意，動物使用和處理遵照美國國立衛(wèi)生署頒布的“實驗動物關(guān)護和使用指南”。

1.4 觀察指標

1.4.1 Von Frey試驗

在第一次給藥之前和第2、4、6和8 天使用Von Frey試驗評估機械性異常性疼痛。在給藥前及第2、4和6 天按照文獻報道的方法[7]將每只大鼠置于具有金屬絲網(wǎng)地板的透明塑料盒(20×17×13 cm)中進行實驗，并通過改良的上下法確定縮爪閾值[7]。

1.4.2 巨噬細胞遷移

將大鼠采用異氟烷麻醉后通過4%多聚甲醛(PFA)進行灌注固定，在第2、4或8天取出腰椎L4- 6背部神經(jīng)節(jié)，并依次浸入4%PFA中，通過10%、20%和30%蔗糖緩沖液。使用最佳切割溫度化合物制備DRG冷凍塊，在低溫恒溫器上切割DRG冷凍切片(厚度：10 μm)，使用4%PFA固定15 min，并在5%脫脂乳中封閉1 h，然后在4 ℃下與抗CD68抗體(美國Abcam公司)孵育過夜。然后將DRG切片與AlexaFluor?488- 結(jié)合的抗小鼠IgG一起孵育2小時，通過80%甘油進行防猝滅后在熒光顯微鏡下觀察(德國蔡司公司)。通過使用圖像分析軟件Image J 測量的巨噬細胞(CD68陽性細胞)數(shù)并除以DRG細胞面積來計算巨噬細胞遷移。

1.4.3 神經(jīng)突起生長

如上述1.2所述，取出腰椎L4- 6 背部神經(jīng)節(jié)制備DRG細胞。DRG細胞采用美國Invitrogen公司生產(chǎn)的NG培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。將DRG細胞接種到24 孔板上并培養(yǎng)一周以使神經(jīng)突延伸。將兩種細胞類型暴露于紫杉醇(10 ng/mL)和槲皮素(0、25或50 μM)24或168 h。在與紫杉醇和槲皮素一起孵育后，用臺盼藍(美國Gibco公司)染色死細胞。通過相差顯微鏡監(jiān)測細胞，并通過分析軟件Image J測量活細胞中的神經(jīng)突長度。

1.4.4 酶聯(lián)免疫吸附法檢測炎癥因子水平

在戊巴比妥鈉(100 mg/kg)深度麻醉下，每只大鼠的L4- L6脊髓在實驗的第8 天被快速分離并分成幾個部分。部分脊髓用含苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA緩沖液中在4 °C下勻漿。在4 ° C下4 000 rpm離心15 min后，通過BCA法測定上清液蛋白濃度。平衡后，將樣品用于ELISA。根據(jù)制造商的說明，通過大鼠特異性ELISA試劑盒(中國康為生物公司)測量促炎因子的表達。

1.4.5 Western blotting

采用上述不同分組DRG細胞的蛋白分離后，采用Western blotting檢測Wnt通路相關(guān)因子Wnt3α、β- catenin的表達。Western- blot方法簡述如下：細胞蛋白采用SDS- PAGE膠電泳進行分析并轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。將PVDF膜采用5%的脫脂牛奶封閉后，采用anti-β- catenin單克隆抗體進行孵育，采用GAPDH單克隆抗體作為內(nèi)參。蛋白采用化學(xué)發(fā)光法進行檢查。將獲得的蛋白條帶采用Image J軟件進行定量后，分析蛋白水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差(Means ± SD)表示，分別采用非配對t檢驗(雙尾)和Two- way ANOVA 方法比較兩組和多組之間的差異。P< 0.05 認為是具有統(tǒng)計學(xué)意義。所有統(tǒng)計學(xué)方法均采用GraphPad Prism 6.0和 SPSS 18.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素處理對紫杉醇致神經(jīng)病理學(xué)疼痛大鼠機械縮足閾值的影響

在第4、6和8天，紫杉醇(4 mg/kg，腹膜內(nèi)注射)與溶劑DMSO相比顯著降低了縮爪閾值(P<0.05，圖1及表1)。重復(fù)給予槲皮素灌胃顯著抑制紫杉醇誘導(dǎo)的機械縮足閾值降低(P<0.05，圖1及表1)。

表1 不同組間機械縮足閾值的變化

注：Paclitaxel組vs Paclitaxel+Que 30 mg/kg組，*P<0.05；Paclitaxel組vs Paclitaxel+Que 50 mg/kg組，#P<0.05；Paclitaxel組vs Paclitaxel+Que 100 mg/kg組，+P<0.05。下文與此相同。

Note:Paclitaxel groupvsPaclitaxel+Que 30 mg/kg group,*P<0.05;Paclitaxel groupvsPaclitaxel+Que 50 mg/kg group,#P<0.05;Paclitaxel groupvsPaclitaxel+Que 100 mg/kg group,+P<0.05.The same as below.

圖1 槲皮素處理對紫杉醇致神經(jīng)病理學(xué)疼痛大鼠機械縮足閾值的影響Fig.1 Effect of quercetin treatment on the mechanical withdrawal threshold of paclitaxel- induced neuropathic pain in rats

2.2 槲皮素處理對紫杉醇致巨噬細胞組大鼠背部神經(jīng)節(jié)細胞上遷移影響

紫杉醇給藥后，巨噬細胞在大鼠背部神經(jīng)節(jié)細胞周圍增加(圖2及表2)。在第8天，巨噬細胞遷移顯著增加(P<0.05，圖2及表2)。槲皮素處理能夠在第4天和第8天以濃度依賴的方式抑制紫杉醇誘導(dǎo)的巨噬細胞遷移增加(P<0.05，圖2及表2)。

2.3 槲皮素處理對紫杉醇誘導(dǎo)大鼠脊髓炎癥因子TNF- α及IL- 1β的影響

紫杉醇處理能夠顯著升高大鼠脊髓中炎癥因子TNF-α及IL- 1β的水平(P<0.05；圖3及表3)，而槲皮素處理能夠以濃度依賴的方式顯著降低由紫杉醇處理引起的大鼠脊髓中炎癥因子TNF-α及IL- 1β的水平升高的情況(P<0.05；見圖3、表3)。

表2 各組細胞遷移比例

圖2 槲皮素處理對紫杉醇致巨噬細胞組大鼠背部神經(jīng)節(jié)細胞上遷移影響Fig.2 Effect of quercetin treatment on migration of dorsal ganglion cells in paclitaxel- induced macrophage rats

2.4 槲皮素處理對紫杉醇誘導(dǎo)大鼠背部神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元突起退化的影響

我們進一步考察了紫杉醇處理對大鼠背部神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元突起退化的影響，結(jié)果如圖4及表4所示，從圖中可見，紫杉醇處理能夠顯著增加神經(jīng)元突起退化，而槲皮素處理能夠以劑量依賴的方式抑制由紫杉醇引起的大鼠背部神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元突起退化。

2.5 槲皮素處理對紫杉醇誘導(dǎo)大鼠背部神經(jīng)節(jié)Wnt通路的影響

我們進一步對槲皮素處理的作用機制進行了研究，結(jié)果如圖5所示，從圖中可見，紫杉醇處理能夠顯著增加Wnt通路關(guān)鍵分子Wnt3a和β- catenin的水平變化，而槲皮素處理能夠以劑量依賴的方式抑制由紫杉醇引起的大鼠背部神經(jīng)節(jié)細胞中Wnt通路關(guān)鍵分子Wnt3a和β- catenin的水平增加。

表3 各組TNF- α及IL- 1β的水平

圖3 槲皮素處理對紫杉醇誘導(dǎo)大鼠脊髓炎癥因子TNF- α及IL- 1β的影響Fig.3 Effect of quercetin treatment on paclitaxel- induced inflammatory factors TNF- α and IL- 1β in rats

表4 各組背部神經(jīng)節(jié)突起長度

圖4 槲皮素處理對紫杉醇誘導(dǎo)大鼠背部神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元突起退化的影響Fig.4 Effect of quercetin treatment on paclitaxel- induced degeneration of rat dorsal ganglion neurons

圖5 槲皮素處理對紫杉醇誘導(dǎo)大鼠背部神經(jīng)節(jié)Wnt通路的影響Fig.5 Effect of quercetin treatment on paclitaxel- induced Wnt pathway in the dorsal ganglion of rats

3 討論

在本文中，我們通過建立紫杉醇誘導(dǎo)的神經(jīng)痛模型并采用槲皮素進行處理來明確槲皮素對紫杉醇致神經(jīng)病理學(xué)疼痛大鼠的改善作用并探索相關(guān)的機制。我們的結(jié)果顯示槲皮素治療組相較于模型能夠以劑量依賴的方式的顯著升高大鼠的縮抓閾值；并且能夠以劑量依賴的方式顯著降低巨噬細胞的遷移。槲皮素處理能夠以濃度依賴的方式顯著降低由紫杉醇處理引起的大鼠脊髓中炎癥因子TNF-α及IL- 1β的水平升高。槲皮素處理能夠以劑量依賴的方式抑制由紫杉醇引起的大鼠背部神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元突起退化。另外，蛋白檢測結(jié)果顯示槲皮素能夠以劑量依賴的方式抑制Wnt信號通路的關(guān)鍵分子Wnt3α和β- catenin的水平。

紫杉醇是一種常用的化學(xué)治療藥物，能夠通過阻止有絲分裂來阻止腫瘤細胞的分裂。由于該藥物的非選擇性特性，在化學(xué)療法期間經(jīng)常發(fā)生不希望的副作用，例如痛覺過敏和異常性疼痛。紫杉醇引起的劑量依賴性神經(jīng)性疼痛的特征是麻木，刺痛，燒灼感和其他癥狀，這些癥狀嚴重限制了紫杉醇的臨床應(yīng)用[8]。迄今為止，已經(jīng)開發(fā)出很少的有效藥物來解決這個問題。

目前已經(jīng)采用了幾種嚙齒動物模型來研究紫杉醇引起的機械性異常性疼痛和熱痛覺過敏的癥狀和潛在機制[9,10]，因為大鼠中紫杉醇誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)病變具有與人類相似的特征[11]。在本動物模型中，紫杉醇在第一次注射紫杉醇后第5天開始誘導(dǎo)大鼠超敏反應(yīng)，有趣的是，大鼠在注射后幾乎立即表現(xiàn)出神經(jīng)性疼痛癥狀。注射紫杉醇的大鼠和小鼠被證明表現(xiàn)出典型的熱痛覺過敏和機械性異常性疼痛。以前的證據(jù)表明，紫杉醇誘導(dǎo)的大鼠周圍神經(jīng)病變可持續(xù)35天[12]。單劑量的16或32 mg/kg紫杉醇也會在大鼠中引起短期傷害性神經(jīng)病變[13]。目前的研究表明，長期用槲皮素治療緩解了紫杉醇誘導(dǎo)的大鼠慢性神經(jīng)性疼痛，如槲皮素增強熱痛覺過敏和機械性異常性疼痛的閾值所示。此外，短期遞送槲皮素減輕了紫杉醇在大鼠中產(chǎn)生的急性神經(jīng)性疼痛。

研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)的炎性損傷可誘發(fā)巨噬細胞的遷移，導(dǎo)致巨噬細胞進入炎性損傷的中心區(qū)域，從而促進炎癥細胞的招募，促進TNF-α及IL- 1β等炎癥介質(zhì)的釋放，加重神經(jīng)組織的病理損傷。我們發(fā)現(xiàn)，槲皮素抑制了紫杉醇誘導(dǎo)的巨噬細胞遷移增加。由于促炎細胞因子誘導(dǎo)的NF- κB活化[14]，它還可以抑制大鼠DRG中紫杉醇誘導(dǎo)的炎性細胞因子。此外，已報道鞘內(nèi)IL- 1受體拮抗劑和編碼IL- 10的質(zhì)粒DNA逆轉(zhuǎn)紫杉醇誘導(dǎo)的大鼠機械性異常性疼痛[3]，表明炎性細胞因子參與紫杉醇誘導(dǎo)的神經(jīng)病變。最近，據(jù)報道減輕炎癥糖尿病大鼠的周圍神經(jīng)病變[15]。有研究還發(fā)現(xiàn)，通過抑制炎性細胞因子，如鋅通過誘導(dǎo)鋅指蛋白A20與TNF受體相關(guān)因子(TRAFs)結(jié)合，能夠抑制Iκ激酶-α(IKK-α)/NF- κB，并抑制NF- κB的激活[14]。此外，據(jù)報道，趨化因子如CCL3和CX3CL- 1參與紫杉醇誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)病變[16- 18]。這些趨化因子也受NF- κB控制。因此，這些趨化因子可被降低炎癥進行抑制。總之，炎癥相關(guān)的 NF- κB信號傳導(dǎo)的抑制可以抑制神經(jīng)元抗炎反應(yīng)和紫杉醇誘導(dǎo)的機械性異常性疼痛的發(fā)展。

Wnt信號傳導(dǎo)對于背根神經(jīng)節(jié)的感覺神經(jīng)元的初始神經(jīng)細胞的分化和突觸形成是至關(guān)重要的。該信號傳導(dǎo)途徑在成人感覺神經(jīng)元中也具有活性，并調(diào)節(jié)對傷害性刺激的敏感性[19]。先前的研究還表明，F(xiàn)ZD3編碼Wnt受體，其在神經(jīng)突向外生長中具有促進生長的作用[20]。我們在這里的結(jié)果顯示槲皮素能夠以劑量依賴的方式抑制紫杉醇誘導(dǎo)的神經(jīng)痛模型Wnt信號通路的關(guān)鍵分子Wnt3α和β- catenin的水平的升高。提示槲皮素可能通過調(diào)控Wnt/β- catenin信號通路來發(fā)揮作用的。

綜上所述，槲皮素通過調(diào)控Wnt/β- catenin信號通路，影響脊髓中炎癥因子的水平并降低炎癥細胞的遷移對紫杉醇致神經(jīng)病理學(xué)疼痛大鼠的發(fā)揮改善效應(yīng)。