史建偉，惠逸帆，蔣寶平，李建萍，余 黎

心臟損傷基本功能與結(jié)構(gòu)單位發(fā)生改變并伴隨心肌細(xì)胞損害、流失、凋亡甚至壞死。臨床通過(guò)β受體阻滯劑等藥物及經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈支架植入術(shù)、冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)等方式延緩損傷、恢復(fù)正常血供是主要治療方法。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為這類(lèi)疾病是由于心失所養(yǎng)、心氣不足、氣滯血瘀、心脈痹阻直至心陽(yáng)虧虛，從而引起“心悸”“胸痹”“心衰”等各類(lèi)心系疾病。臨床治療采用補(bǔ)益心肺、活血化瘀、益氣溫陽(yáng)利水方法調(diào)暢氣血保護(hù)心臟。關(guān)于心肌細(xì)胞再生途徑、改善心臟病預(yù)后是這類(lèi)疾病研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，現(xiàn)綜述心肌細(xì)胞再生的研究現(xiàn)狀及相關(guān)動(dòng)物模型，并探討中醫(yī)藥在心肌細(xì)胞再生的應(yīng)用和可能發(fā)揮的作用。

1 心肌細(xì)胞再生的可行性

傳統(tǒng)理論認(rèn)為，心肌細(xì)胞在人類(lèi)與大部分哺乳動(dòng)物成年后處于終末分化狀態(tài)，無(wú)法對(duì)損傷進(jìn)行自我修復(fù)。有研究表明心肌細(xì)胞再生有可能實(shí)現(xiàn)，包括人類(lèi)在內(nèi)的哺乳動(dòng)物心臟在正常衰老與疾病進(jìn)程的損傷中具有一定程度的再生能力[1]。由于14C可結(jié)合分裂細(xì)胞DNA，有研究利用核爆后大氣中產(chǎn)生的14C整合至植物內(nèi)，被人類(lèi)以食物鏈方式攝入，跟蹤標(biāo)記14C的DNA，在檢測(cè)尸體中14C標(biāo)記的心肌細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，人類(lèi)心肌細(xì)胞自我更新率隨年齡遞減，一生中再生的心肌達(dá)45%，體現(xiàn)了人類(lèi)心肌自我更新的巨大潛能[2]。Ieda等[3]通過(guò)心臟轉(zhuǎn)錄因子組合GMT(Gat、Mef2c與Tbx5)共轉(zhuǎn)染成功使心臟和皮膚中成纖維細(xì)胞重新分化為心肌細(xì)胞。有關(guān)新生兒心肌梗死[4]與胎兒心臟矯正手術(shù)[5]研究表明，新生兒心臟損傷后可實(shí)現(xiàn)功能性恢復(fù)并具有較高的再生潛能。人類(lèi)心肌細(xì)胞的分化再生并非難以實(shí)現(xiàn)，在年齡與外界因素等影響下導(dǎo)致其生長(zhǎng)更新速度相對(duì)緩慢，短期難以彌補(bǔ)心肌損傷導(dǎo)致的心功能不全，但在某些疾病的長(zhǎng)期康復(fù)過(guò)程中具有現(xiàn)實(shí)意義。除再生進(jìn)程緩慢外，纖維化、過(guò)度炎癥反應(yīng)和血管再生不足是再生過(guò)程的三大障礙[6]。

2 心肌再生的常用動(dòng)物模型

通過(guò)生物模型模擬人類(lèi)心臟功能是可行的方法，其過(guò)程需綜合考慮動(dòng)物來(lái)源、價(jià)格、操作、實(shí)驗(yàn)要求及與人類(lèi)心肌分化生長(zhǎng)方式相仿程度等因素。以心肌細(xì)胞壞死為主要病理表現(xiàn)的心肌梗死為例，大鼠是相關(guān)研究中應(yīng)用最廣泛的動(dòng)物模型，其次是兔、雜種犬與小鼠[7]。斑馬魚(yú)與蠑螈作為脊椎動(dòng)物，其卓越的再生本領(lǐng)為人類(lèi)心肌再生提供了研究平臺(tái)；同時(shí)，斑馬魚(yú)作為已有15年心肌再生研究歷史的載體，具有通量高、價(jià)格適中、易于養(yǎng)殖、研究周期短、易操作等優(yōu)點(diǎn)，在相應(yīng)的研究中發(fā)揮了巨大的作用?，F(xiàn)將不同種類(lèi)的動(dòng)物模型基礎(chǔ)研究進(jìn)行概述。

2.1 哺乳動(dòng)物的基礎(chǔ)研究 19世紀(jì)60年代，有學(xué)者在出生后的鼠類(lèi)動(dòng)物心肌細(xì)胞中觀(guān)察到較低程度的有絲分裂現(xiàn)象[8]。目前認(rèn)為，哺乳動(dòng)物發(fā)育過(guò)程及心肌損傷后的干細(xì)胞與原有心肌細(xì)胞是較確切的心肌來(lái)源，有研究者曾成功將體外分離的鼠源性胚胎干細(xì)胞(mouse embryonic stem cells，mESCs)分化為竇房結(jié)細(xì)胞、心房細(xì)胞、浦肯野細(xì)胞等不同的心肌細(xì)胞[9]。Porrello等[10]切除出生1 d的小鼠約15%的左室心尖后，發(fā)現(xiàn)小鼠心臟基本功能在8周內(nèi)完全恢復(fù)，然而同樣的損傷模型在出生1周小鼠無(wú)法誘導(dǎo)出相同的結(jié)果。有研究認(rèn)為，新生乳鼠心室部分切除后再生能力有限且主要以纖維化瘢痕形成為主，認(rèn)為不同范圍的心尖損傷可能造成心臟再生差異[11]。由此可見(jiàn)，哺乳動(dòng)物出生前后心肌分化作用最強(qiáng)，之后若通過(guò)人為干預(yù)可實(shí)現(xiàn)心肌再生能力的提高。

通過(guò)結(jié)扎某些哺乳動(dòng)物冠狀動(dòng)脈以阻斷血流可誘導(dǎo)相應(yīng)區(qū)域的心肌細(xì)胞缺血缺氧壞死，此時(shí)哺乳動(dòng)物心臟組織以纖維瘢痕形成為主的炎癥免疫反應(yīng)和人類(lèi)心肌損傷過(guò)程中的表現(xiàn)類(lèi)似，研究者可進(jìn)行直觀(guān)比較。

2.2 斑馬魚(yú)的基礎(chǔ)研究 Poss等[12]首先發(fā)現(xiàn)成年斑馬魚(yú)的心臟再生能力。斑馬魚(yú)心臟雖然是兩腔室，但在細(xì)胞分子生物學(xué)方面與哺乳動(dòng)物具有諸多相似之處，其基因組與人類(lèi)基因組有高達(dá)87%的同源性，較多與人類(lèi)基因功能相似的同源基因[13]。易于操作的遺傳分子及全生命周期的心肌再生能力使斑馬魚(yú)成為目前研究心臟再生的優(yōu)秀模型。

小鼠幼體心臟大范圍損傷后，心臟組織特異性因子失活而較快死亡，而切除20%左心室后的成年斑馬魚(yú)心臟損傷部位并非由瘢痕組織替代，首先出現(xiàn)血凝塊之后發(fā)生纖維沉積，心尖切除7 d后可在損傷區(qū)域檢測(cè)到增殖的心肌細(xì)胞，新生的心肌細(xì)胞逐漸生長(zhǎng)并于14 d達(dá)到峰值，最終在60 d后達(dá)到心臟完全再生水平，心肌功能得到恢復(fù)[14]。斑馬魚(yú)心臟再生過(guò)程是心肌早期激活并發(fā)育的過(guò)程，斑馬魚(yú)的心肌再生能力有助于較好地了解和探索哺乳動(dòng)物心臟再生機(jī)制。

2.2.1 心外膜研究 Cai等[15]發(fā)現(xiàn)T-box家族中tbx18標(biāo)記的心外膜干細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為心肌細(xì)胞。Kikuchi等[16]在電耦合切除斑馬魚(yú)心室壁后發(fā)現(xiàn)，再生過(guò)程中具備分裂能力的心肌細(xì)胞大量表達(dá)鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，而鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子受T-box家族轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，支持來(lái)自斑馬魚(yú)心肌再生研究中心外膜在修復(fù)心肌損傷中起到的作用。與小鼠類(lèi)似，斑馬魚(yú)新生心臟中發(fā)現(xiàn)的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)標(biāo)記基因snail及twist，體現(xiàn)了斑馬魚(yú)損傷后新生心臟中心外膜來(lái)源細(xì)胞通過(guò)EMT形成冠狀動(dòng)脈血管的過(guò)程[17]?？傊?，心外膜激活后可能不直接誘導(dǎo)心肌再生，而是以促進(jìn)新生血管生長(zhǎng)等方式間接發(fā)揮作用。

2.2.2 心內(nèi)膜研究 心肌再生過(guò)程中，毗鄰心肌層的心內(nèi)膜與心外膜同時(shí)被激活。切除斑馬魚(yú)心尖1～3 h后，原有的貼壁扁平細(xì)胞從心肌層脫落，轉(zhuǎn)化為圓形細(xì)胞并開(kāi)始表達(dá)視黃醛脫氫酶2(retinal dehydrogenase 2，raldh2)，這種變化首先出現(xiàn)于全心，1 d后主要局限于損傷區(qū)域并持續(xù)約14 d，而心外膜raldh2的表達(dá)遲于心內(nèi)膜[18]。有研究表明，炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷可增加心內(nèi)膜細(xì)胞的滲透性，在raldh2作用下維A酸表達(dá)增加，切斷維A酸表達(dá)途徑后心肌無(wú)法再生[18]。有研究表明，心內(nèi)膜在嵌入心肌層或離心培養(yǎng)后具有分化為冠狀血管內(nèi)皮細(xì)胞的潛能[19]，值得持續(xù)關(guān)注。

3 心肌再生的相關(guān)機(jī)制

心肌再生受到多種因素與復(fù)雜機(jī)制的影響。目前研究方向雖然較多集中于干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，但同時(shí)開(kāi)始拓展到其他方面。

3.1 干細(xì)胞的研究 有研究證實(shí)，通過(guò)干細(xì)胞移植與誘導(dǎo)分化提高心肌再生水平和心臟功能治療心臟疾病是可行且充滿(mǎn)前景的途徑[20-21]。其中，多能干細(xì)胞(pluripotent stem cells，PSCs)包括誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)和胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)，骨髓源干細(xì)胞包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)、心臟干細(xì)胞(cardiac stem cells，CSCs)等均在體外分化為心肌細(xì)胞[22-23]。利用干細(xì)胞進(jìn)行心肌再生途徑主要包括經(jīng)典的外源性干細(xì)胞注射導(dǎo)入局部損傷區(qū)域和采取局部刺激以誘導(dǎo)自身內(nèi)源性心臟干細(xì)胞生長(zhǎng)兩種方式。

3.2 細(xì)胞因子的調(diào)控 干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化主要在各類(lèi)細(xì)胞因子及通路信號(hào)調(diào)控中完成。抗壞血酸(ascorbic acid，AA)誘導(dǎo)iPSCs向心肌細(xì)胞分化的作用強(qiáng)大[24]；在胎肝、腎臟和骨髓分化活躍的造血細(xì)胞中常有較高水平的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)，而TGF-βⅡ可促進(jìn)ESCs轉(zhuǎn)化為心肌細(xì)胞[25]；存在于心腦血管中的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子可調(diào)控細(xì)胞增殖、分化并激活心肌細(xì)胞，在BMSCs向心肌轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮重要作用[26]?？聜チ嫉萚27]分離出人外周血中的內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，培養(yǎng)3 d后與大鼠心肌細(xì)胞共同培養(yǎng)，在血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等外源性細(xì)胞因子動(dòng)員下，6 d后EPCs表現(xiàn)出心肌細(xì)胞特征與功能。一些與干細(xì)胞轉(zhuǎn)移分化有關(guān)的細(xì)胞生長(zhǎng)因子如TGF-β、VEGF、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子等均可激活與調(diào)控心臟干細(xì)胞生成心肌細(xì)胞[28-29]。

3.3 涉及的相關(guān)信號(hào)通路 Hippo-Yap信號(hào)通路對(duì)胚胎時(shí)期組織器官發(fā)育起著重要的作用，成年小鼠心肌細(xì)胞損傷時(shí)，通過(guò)Hippo-Yap通路再激活可使心肌細(xì)胞進(jìn)入新的細(xì)胞周期，促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖，且不會(huì)對(duì)心臟功能造成有害影響[30]。有研究顯示，心臟發(fā)育過(guò)程中的Notch信號(hào)發(fā)揮促進(jìn)心臟干細(xì)胞增殖分化與心肌修復(fù)再生作用，激活Notch信號(hào)通路可促進(jìn)CSCs分化為心肌細(xì)胞，而Notch通路被阻斷后原有基礎(chǔ)心臟病病人極易并發(fā)擴(kuò)張型心肌病[31]。此外，Wnt、骨形態(tài)形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)等通路均不同程度參與心肌細(xì)胞的分化過(guò)程。除基因因素，心肌細(xì)胞修復(fù)與再生還受低氧環(huán)境、力學(xué)刺激等其他因素的影響。

4 中醫(yī)藥在心肌組織再生領(lǐng)域中作用的研究

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中各種原發(fā)性或繼發(fā)性心臟病在急性發(fā)作期或終末期歸屬于中醫(yī)學(xué)“心衰”范疇，病因分為先天不足(如先心病或遺傳性心臟病)、久病體衰(如老年病人心臟的退行性病變)、感受外邪(如病毒性心肌炎、感染性心內(nèi)膜炎)、飲食起居(如糖尿病心臟病)、七情所傷(如高血壓心臟病)、勞倦內(nèi)傷(如機(jī)體免疫力下降)等，這些因素相互影響夾雜，最終導(dǎo)致心臟損傷。治療各類(lèi)心臟疾病除了應(yīng)用藥物治療以外，消除危險(xiǎn)因素、接受健康教育與調(diào)節(jié)飲食起居同樣重要，中醫(yī)藥治療在這些方面發(fā)揮了一定的作用。

4.1 針灸的作用 手少陰心經(jīng)分布于兩臂上肢掌側(cè)面的尺側(cè)緣與小指的橈側(cè)端，起于極泉止于少?zèng)_，通過(guò)針灸手少陰心經(jīng)發(fā)揮治療心胸疾病的作用。李夢(mèng)等[32]建立大鼠心肌梗死模型后發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的心肌壞死組織過(guò)量表達(dá)CD40配體與基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metallo proteinase-9，MMP-9)，其中CD40配體導(dǎo)致MMP-9過(guò)表達(dá)，從而誘發(fā)急性冠脈綜合征，針刺預(yù)處理或治療性模擬針刺大鼠“內(nèi)關(guān)”“心俞”后可降低CD40表達(dá)。已有大量臨床研究證實(shí)針灸治療心臟病的確切療效，可作為心肌梗死的輔助治療，但在疾病過(guò)程中減少心肌壞死、促進(jìn)心肌再生作用的具體機(jī)制尚不明確。

4.2 中藥的研究 目前，中藥及其復(fù)方的藥理作用機(jī)制復(fù)雜，對(duì)促進(jìn)心肌細(xì)胞分化具體作用靶點(diǎn)的認(rèn)識(shí)不全面，傳統(tǒng)的養(yǎng)心方藥用于心臟損傷類(lèi)疾病的治療和恢復(fù)具有悠久的歷史，積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，可能從中尋找合適的藥物?，F(xiàn)對(duì)部分相關(guān)中藥的研究進(jìn)行概述并對(duì)其作用靶點(diǎn)進(jìn)行討論。

4.2.1 調(diào)控T-box家族亞型的表達(dá) Brachyury(T)基因作為一類(lèi)獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄因子于1927年首次被人們發(fā)現(xiàn)，T-box家族是一類(lèi)具有同源DNA結(jié)構(gòu)域的基因匯總，其中tbx1、tbx2、tbx3、tbx5、tbx18與tbx20這6個(gè)亞型均參與心肌分化[33]。較成熟的tbx5在早期心臟發(fā)育過(guò)程中主要表達(dá)于胚胎中層，在心房、心室發(fā)育及心傳導(dǎo)系統(tǒng)的形成中發(fā)揮重要的作用。一定濃度的女貞子提取物齊墩果酸可增加tbx20的表達(dá)并降低氧化型低密度脂蛋白對(duì)細(xì)胞的損傷，對(duì)心肌再生作用有明顯影響[34]。中藥對(duì)T-box這類(lèi)重要的心臟發(fā)育調(diào)控因子的研究值得深入開(kāi)展。

4.2.2 影響TGF-β的表達(dá) TGF-β是一類(lèi)具有生物活性的多肽，傳統(tǒng)認(rèn)為T(mén)GF-β在心肌細(xì)胞纖維化、肥大與心臟重構(gòu)過(guò)程中均發(fā)揮了作用。TGF-β1與TGF-β3均具有較強(qiáng)的致纖維化作用，而TGF-β2證實(shí)參與誘導(dǎo)心肌再生，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和造血祖細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用僅為前兩者的1%左右，且致纖維化作用不強(qiáng)。臨床研究表明，具有溫陽(yáng)益氣活血的中藥與制劑可抑制甚至逆轉(zhuǎn)心肌纖維化。有研究將黃芪、丹參、三七、降香組成的芪參益氣滴丸以10-3g/L濃度干預(yù)心肌梗死大鼠發(fā)現(xiàn)，該制劑通過(guò)抑制TGF-β1激活的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)通路，下調(diào)磷酸化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(phospho-extracellular regulated kinase，p-ERK1/2)水平，從而抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，但對(duì)經(jīng)典Smad通路影響不大[35]。巴戟天寡糖可上調(diào)TGF-β2表達(dá)，誘導(dǎo)成肌細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化，其作用受劑量影響呈雙向調(diào)節(jié)[36]。早期心肌梗死過(guò)程中TGF-β具有一定的保護(hù)作用，通過(guò)中藥多靶點(diǎn)作用針對(duì)性地調(diào)控TGF-β，在心肌保護(hù)與再生方面具有重要作用。

4.2.3 刺激VEGF的分泌 VEGF可促進(jìn)心肌微血管生成，為心肌再生提供物質(zhì)基礎(chǔ)，中藥對(duì)VEGF的作用是多方面的。全反式維A酸作為維A酸的一類(lèi)活性形式，不僅參與調(diào)控VEGF，并且減少大鼠成熟心肌母細(xì)胞株H9C2凋亡[37-38]。瓜蔞薤白半夏湯加入黃芪后具有化痰補(bǔ)氣之功效，通過(guò)增加心肌VEGF 蛋白與mRNA表達(dá)可明顯改善心肌壞死區(qū)供血[39]。有研究者將濃度為10-7mol/L的淫羊藿苷(Icariin，ICA)與MSCs體外共同培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，該濃度ICA不僅引起MSCs高度表達(dá)心肌細(xì)胞分化過(guò)程中需要的一些特定基因，還可增加新生血管VEGF的分泌[40]。

4.2.4 活血化瘀療法 冠心病屬心肌缺血類(lèi)疾病，中國(guó)古代多稱(chēng)為“胸痹”，《諸病源候論》將其描述為“傷之而痛者，則朝發(fā)夕死，夕發(fā)朝死”，針對(duì)這類(lèi)疾病中醫(yī)常采用活血化瘀療法[41]。

5 小 結(jié)

心肌細(xì)胞再生具有可行性與復(fù)雜性兼?zhèn)涞奶攸c(diǎn)：心肌細(xì)胞再生存在與功能不同步的矛盾性，不同生物個(gè)體之間心臟結(jié)構(gòu)與成分的差異性，時(shí)間與損傷部位不同步，具體機(jī)制的變化性等。心肌細(xì)胞再生效率有限，如何將損傷后的炎癥反應(yīng)限制在可控范圍，減少瘢痕生成或逆轉(zhuǎn)瘢痕，提高心肌再生率等問(wèn)題是目前研究的難點(diǎn)?！暗雷枨议L(zhǎng)，行則將至”，心肌再生應(yīng)用前景廣闊，將中醫(yī)藥與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)進(jìn)行有機(jī)結(jié)合，多角度、深層次探索，以期為心肌細(xì)胞丟失的心臟病病人尋找有效的治療途徑。