陳怡雪，牛閃閃，李紅萍，于 斐，吳擁軍，劉利娥*

1. 鄭州大學公共衛(wèi)生學院，河南 鄭州 450001 2. 鄭州大學化工與能源學院，河南 鄭州 450001

引 言

DNMT1是人體內含量最多、最重要的甲基轉移酶，它是以病灶為靶點負責將親代DNA甲基化信息遺傳至子代細胞，是維持DNA甲基化遺傳穩(wěn)定性的關鍵酶[1]。研究表明，其表達水平和活性變化與胃腸癌、肺癌、食管癌等多種腫瘤的發(fā)病機制密切相關，是癌癥發(fā)生發(fā)展重要的分子標志[2-4]。目前，DNMTs的檢測方法有很多，如比色法[5]，高效液相色譜法[6]，化學發(fā)光分析法[7]及電化學分析法[8]等。但這些方法大多是以原核細胞的甲基化轉移酶如DNA adenine methylation (Dam) MTase，M.SssI為測量對象，只有少數著眼于人類基因的DNMT1，并局限于實驗室研究，未應用于實際樣品的檢測。因此，建立一種快速、靈敏度高的DNMT1定量新方法具有重要的癌癥早篩及臨床應用價值。

熒光免疫分析法具備熒光法靈敏度高、線性范圍寬、選擇性良好等優(yōu)點的同時，還具備免疫法的高特異性，在許多領域中應用廣泛。磁性Fe3O4納米顆粒是將高分子材料與無機Fe3O4粒子結合起來的一種復合微球，比表面積大，能夠提供更多空間使抗原抗體充分結合，同時兼具良好的生物相容性與磁分離性能，通常在生物樣品混合物的分離中被用作載體。

本研究用Fe3O4磁性納米球代替聚苯乙烯板作為固相載體，負載DNMT1單克隆抗體作為捕獲探針，捕獲并富集復雜基質中的目標物。磁分離具有分離速度快、不影響待測物的活性，能夠簡化操作流程并減少復雜樣品中基質對測定的干擾[9]。在此基礎上，捕獲探針與抗原及熒光檢測探針形成“三明治”夾心結構，建立熒光免疫分析法，并將其用于血清樣品中DNMT1含量的高靈敏檢測。

1 實驗部分

1.1 試劑及儀器

DNMT1抗原(OriGene公司)； DNMT1小鼠單克隆抗體(McAbDNMT1，abcam公司)； DNMT1兔多克隆抗體(PcAbDNMT1，abcam公司)； 5-羧基四甲基羅丹明琥珀酰亞胺酯熒光染料(5-TAMRA，淄博昀輝生物化工技術有限公司)； DNMT1商品化ELISA試劑盒(武漢云克隆科技有限公司)； 羧基化磁性Fe3O4納米球(50 mg·mL-1，百運納米科技有限公司)； N-羥基硫代琥珀酰亞胺鈉鹽(Sulfo-NHS，分析純，阿拉丁公司)； 碳二亞胺鹽酸鹽(EDC，分析純，阿拉丁公司)； Millipore超純水(18.2 MΩ·cm)； PBS磷酸鹽緩沖液(0.01 mol·L-1，pH 7.4)； PBST緩沖液(0.05%Tween20)。

納米粒度及Zeta電位分析儀(Zetasizer Nano-zs 90，英國Malvern)，紅外光譜儀(PE-1710，德國PE)，熒光分光光度計(F-4500，日本日立)，紫外-可見分光光度計(UV-1601，日本島津)，磁分離板(百運納米科技有限公司)。

1.2 磁性Fe3O4免疫捕獲探針的制備

取100 μL Fe3O4溶液，磁分離，用PBS清洗3次； 加入100 μL McAbDNMT1(0.1 mg·mL-1)混勻，分別加入100 μL Sulfo-NHS和EDC，渦旋20 min，于25 ℃偶聯(lián)2 h； 磁分離，取上清用于計算偶聯(lián)效率，用PBS清洗2次。加入300 μL PBS(含0.5%BSA)震蕩30 min封閉未活化基團，分散于300 μL PBS中，4 ℃保存。

1.3 免疫熒光檢測探針的制備

取100 μL PcAbDNMT1(0.25 mg·mL-1)于裝有1.0 mL PBS的離心管中，混勻后加入5.0 μL 5-TAMRA稀釋液(27.4 nmol)，渦旋3 h偶聯(lián)。取400 μL偶聯(lián)物于預冷的超濾管(30KDa)中離心，最后將超濾管倒置于離心管中，離心回收檢測探針。

1.4 建立檢測DNMT1的FLISA方法

在黑色96孔板中加入300 μL封閉液，37 ℃溫育90 min后用PBST洗板3次； 每孔加入Fe3O4@McAbDNMT1稀釋液100 μL(1∶40)，磁分離后PBST洗3次。加入100 μL 0.05，0.1，0.25，0.5，1，5，10，20，40和80 ng·mL-1DNMT1抗原，37 ℃溫育90 min，PBST洗板3次。加入100 μL 稀釋20倍的5-TAMRA@PcAbDNMT1溶液，37 ℃溫育90 min，PBST洗板5次。加入200 μL PBST，測定96孔板中各孔的相對熒光強度(RFU)，以濃度為橫坐標，檢測信號為縱坐標，繪制標準曲線。

1.5 建立ELISA與MELISA方法

在參考文獻[10]的基礎上分別建立檢測DNMT1的ELISA方法和MELISA方法。

1.6 方法學評價

精密度： 取一塊96孔板，分別配制低、中、高濃度的樣品，每個水平平行6份，按照1.4節(jié)的方法進行實驗，根據測定結果計算板內精密度； 同上，取不同的96孔板，計算板間精密度。

準確度： 配制三個濃度的DNMT1標準品，按照1.4節(jié)中步驟進行測定，將所得結果與加標濃度進行比較，計算方法準確度。

特異性： 選取與DNMT1性質相似的DNA甲基轉移酶DNMT3a和DNMT3b為檢測對象，在與測DNMT1相同的條件下測定RFU，考察方法的特異性。

方法學比較： 用所建立的FLISA檢測DNMT1含量，并與MELISA和ELISA進行比較。

1.7 樣品分析

血清樣本來自鄭州大學第一附屬醫(yī)院呼吸與重癥科室。取15例肺癌患者的血清樣品，用FLISA方法檢測DNMT1含量，并將檢測結果與商品化ELISA試劑盒進行比較。

2 結果與討論

2.1 FLISA檢測DNMT1的實驗原理

FLISA測定DNMT1的原理見圖1。采用EDC/Sulfo-NHS鍵合法，羧基功能化的Fe3O4磁珠為固相載體，與McAbDNMT1偶聯(lián)制備免疫捕獲探針，加入DNMT1標準品或待測樣品，待測目標物被探針捕獲并富集，磁分離后加入標記有熒光檢測探針5-TAMRA@PcAbDNMT1，此時形成雙抗體夾心的“三明治”結構，磁分離。用200 μL PBST對磁性復合物進行懸浮，于555 nm激發(fā)光照射下檢測580 nm處的熒光強度，根據熒光強度和目標物濃度的關系進行定量分析。

圖1 FLISA法檢測DNMT1原理

2.2 Fe3O4@McAbDNMT1的表征

2.2.1 Fe3O4@McAbDNMT1的紅外光譜

按照1.2節(jié)中實驗方法測定偶聯(lián)效率，F(xiàn)e3O4和McAbDNMT1的偶聯(lián)效率為76.3%。

圖2 Fe3O4@McAbDNMT1和Fe3O4紅外吸收光譜

2.2.2 Fe3O4@McAbDNMT1的Zeta電位

捕獲探針的Zeta電位分析結果見圖3(a)。從圖3(a)數據可以看出，羧基化的Fe3O4的Zeta電位-10.8 mV，F(xiàn)e3O4@McAbDNMT1的Zeta電位-8.45 mV，McAbDNMT1的Zeta電位-4.47 mV，羧基Fe3O4與抗體偶聯(lián)引起電位發(fā)生變化，提示McAbDNMT1成功偶聯(lián)到Fe3O4上。

圖3 偶聯(lián)物的Zeta電位

2.2.3 Fe3O4@McAbDNMT1免疫活性

用ELISA檢測Fe3O4@McAbDNMT1的免疫活性的實驗結果見圖4。圖中顯示Fe3O4@McAbDNMT1稀釋比相同的情況下，隨著抗原濃度的增加吸光度逐漸增大； 在抗原濃度相同的情況下，隨著Fe3O4@McAbDNMT1稀釋比的增大吸光度逐漸減小，表明在羧基化Fe3O4表面成功修飾了McAbDNMT1，并保持了抗體的活性。

圖4 Fe3O4@McAbDNMT1的免疫活性

2.3 5-TAMRA@PcAbDNMT1的表征

2.3.1 5-TAMRA@PcAbDNMT1的紫外-可見吸收光譜

分別繪制5-TAMRA，PcAbDNMT1及5-TAMRA@PcAbDNMT1的紫外-可見吸收光譜，如圖5所示。從圖5中可以看出，5-TAMRA的最大吸收峰為551 nm，PcAbDNMT1在280 nm處有最大吸收峰，5-TAMRA@PcAbDNMT1在280 nm處和在555 nm均有吸收峰，表明偶聯(lián)成功。

圖5 5-TAMRA@PcAbDNMT1的紫外-可見吸收光譜

2.3.2 5-TAMRA@PcAbDNMT1的Zeta電位

檢測探針的Zeta電位測量結果見圖3(b)。從圖3(b)可以看出，5-TAMRA，PcAbDNMT1和5-TAMRA@PcAbDNMT1的Zeta電位分別為-1.950，1.320和-0.968 mV。5-TAMRA與抗體偶聯(lián)后形成了偶聯(lián)物導致Zeta電位發(fā)生變化，提示PcAbDNMT1與5-TAMRA偶聯(lián)成功。

2.3.3 5-TAMRA@PcAbDNMT1的激發(fā)光譜與發(fā)射光譜

5-TAMRA@PcAbDNMT1的激發(fā)光譜與發(fā)射光譜分別見圖6(a)和(b)。由圖6(a)可知，5-TAMRA及其偶聯(lián)物的最大激發(fā)波長為555 nm。由于5-TAMRA在偶聯(lián)的過程中有損失，所以偶聯(lián)物的熒光強度與5-TAMRA相比有所減弱。由圖6(b)可知，5-TAMRA的最大發(fā)射波長是575 nm，而偶聯(lián)物的最大發(fā)射波長為580 nm，發(fā)生了紅移，表明5-TAMRA與PcAbDNMT1生成了新的偶聯(lián)產物。

圖6 (a) 5-TAMRA@PcAbDNMT1的激發(fā)光譜;(b) 5-TAMRA@PcAbDNMT1的發(fā)射光譜

2.3.4 5-TAMRA@PcAbDNMT1的免疫活性

利用抗原抗體的特異性結合進行免疫活性分析，結果見圖7，隨著抗原濃度的逐漸增加，熒光強度隨之增大，表明5-TAMRA與PcAbDNMT1形成了偶聯(lián)物，并保持了抗體的免疫活性。

圖7 5-TAMRA@PcAbDNMT1的免疫活性

2.4 方法學的評價與比較

2.4.1 FLISA標準曲線

方法的標準曲線如圖8所示。

圖8 DNMT1的標準曲線

2.4.2 FLISA檢出限、精密度、準確度及方法學比較

FLISA，MELISA和ELISA檢測DNMT1的方法學見表1、所需時間見表2。從表1數據可以看出，F(xiàn)LISA方法的檢出限最低，板內與板間精密度好、準確度符合要求。表2數據顯示，不同分析方法所需分析時間從短到長的順序為： FLISA

表1 三種分析方法的線性范圍、相關系數和檢出限

表2 三種分析方法的反應時間

2.4.3 特異性評價

特異性分析結果見圖9。圖9顯示： 在DNMT1，DNMT3a和DNMT 3b濃度相同時，測定DNMT3b的信號值約為DNMT1的1/7，DNMT3a的信號值更低，方法的特異性良好。

圖9 FLISA方法檢測DNMTs的特異性

2.4 樣品分析

分別用FLISA和商品化ELISA試劑盒檢測了15例人血清中DNMT1含量，并用配對t檢驗對兩種分析方法的測定結果進行了相關分析(t=1.906，p>0.05)，差異無統(tǒng)計學意義。相關性分析結果見圖10所示，說明所建立的FLISA法可以用于檢測人血清樣品中DNMT1的含量。

圖10 FLISA與ELISA測定結果的相關性分析

3 結 論

以比表面積大的Fe3O4納米顆粒為固相載體固定DNMT1單克隆抗體，克服了常規(guī)ELISA分析中包被的抗原(或抗體)易脫落，固液接觸面積小，反應速度慢，分析時間長等不足； 結合納米技術、磁分離技術以及免疫分析技術，建立基于免疫磁性納米顆粒的熒光免疫分析(FLISA)法，用于人血清中DNMT1含量分析。與ELISA和MELISA法比較，F(xiàn)LISA法檢出限低，靈敏度高，特異性強，操作簡單，有望應用于高通量、大樣本的檢測，可考慮進一步制成試劑盒，提高檢測效率。