梁昊岳，程雪蓮，楊晚竹，于文穎，李長虹，董樹旭，趙軾軒，茹永新

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所)，實驗血液學(xué)國家重點實驗室，國家血液病臨床學(xué)研究中心，天津 300020

引 言

白血病(acute leukemia, ALs)是一種惡性克隆疾病[1]，其中多種類型預(yù)后不佳[2]。急性髓細胞白血病(acute myeloid leukemia, AML)是成人中最常見的白血病，它是造血細胞在骨髓中異常增殖和分化的結(jié)果[3]。白血病的分類主要包括法-美-英國(FAB)和世界衛(wèi)生組織(WHO)分類[4-5]。

目前，拉曼光譜已被用作快速和無標(biāo)記方法來分析和分類具有位置特異性的細胞[6-7]。它是一種振動光譜技術(shù)，提供關(guān)于細胞和組織的分子組成信息[8]。它也適用于白血病領(lǐng)域的分類。Ilin等[9]應(yīng)用偏最小二乘判別分析法(PLS-DA)，區(qū)分長、短周期造血干細胞、粒細胞和淋巴細胞。Happillon等建立了區(qū)分CLL和正常淋巴細胞光譜的分類模型[10]。Vanna等從AML和MDS患者樣本中區(qū)分原始粒細胞，早幼粒細胞，異常早幼粒細胞和成紅細胞，并且發(fā)現(xiàn)MPO是重要的標(biāo)志物[11]。但是沒有來自使用具有高度分化潛能的胚胎干細胞分析白血病的項目，并發(fā)現(xiàn)干細胞和白血病細胞之間的差異。

實驗應(yīng)用拉曼光譜技術(shù)對三種不同分化階段白血病相關(guān)細胞進行研究，獲取特征光譜數(shù)據(jù)，通過數(shù)學(xué)模型分析建立鑒別模型，建立以拉曼光譜技術(shù)為基礎(chǔ)的區(qū)分不同分化階段白血病相關(guān)細胞的新方法。同時，結(jié)合白血病相關(guān)細胞的超微結(jié)構(gòu)，對拉曼光譜特征進行探討，以期為研究白血病細胞分化并進行早期鑒別提供一種新方法。

1 實驗部分

1.1 人胚胎干細胞和急性早幼粒細胞白血病細胞系的培養(yǎng)與傳代

人胚胎干細胞株H1培養(yǎng)于培養(yǎng)板中，培養(yǎng)基為mTeSR(STEM CELL Technologies)。H1細胞克隆傳代，在37 ℃孵箱中孵育6～8 min，加入DMEM/F12培養(yǎng)基洗3次，收集細胞懸液，1 000 r·min-1離心5 min。mTeSR培養(yǎng)基重懸后，平均分入培養(yǎng)皿中。H1單細胞傳代，使用1 mg·mL-1Accutase、37 ℃消化細胞3 min。DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細胞懸液，1 000 r·min-1離心5 min。

急性早幼粒細胞白血病細胞系NB4用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。

1.2 標(biāo)本收集

選取天津血液病醫(yī)院2016年急性早幼粒細胞白血病患者，主要為2016年1月到6月在我院住院的患者，其中男2例，女2例，年齡最小4歲，最大46歲，中位年齡43.5歲。經(jīng)骨髓穿刺，并進行細胞形態(tài)學(xué)、流式細胞術(shù)和電子顯微鏡等檢查，主要以細胞形態(tài)和組化為依據(jù)，根據(jù)FAB確診。

1.3 電鏡檢測

淋巴細胞分離液分離有核細胞，部分細胞做常規(guī)電鏡觀察，其余部分做髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)染色。然后鋨酸固定、脫水、浸透、包埋、切片和染色。日立H-600(日本)透射電鏡觀察。根據(jù)細胞結(jié)構(gòu)分析，按FAB形成電鏡診斷。

1.4 拉曼光譜檢測

將分離液分離的有核細胞或培養(yǎng)的細胞系細胞通過甩片機Cytospin4(Thermo Fisher Scientific，美國)均勻涂于石英玻片上。本研究采用共聚焦拉曼光譜儀XploRA Raman microscope(HORIBA Scientfic，法國)對目的細胞檢測。以785 nm激光作為激發(fā)光，功率為40 mW，記錄波數(shù)范圍為600～1 800 cm-1，通過鏡下觀察，隨機選取一個目的細胞，在掃描拍攝中通過×40 0.75 NA尼康鏡頭將約40 mW激發(fā)激光束聚焦到樣品上2 μm×2 μm的光斑大小尺寸上。每種白血病患者檢測20～30個細胞，每個細胞標(biāo)本區(qū)域掃描累積時間為250 s，分辨率為1 cm-1。應(yīng)用Labspec6軟件(BC Cancer Research Center，加拿大)，平滑系數(shù)為1，消除噪聲信號、去除熒光背景并對光譜進行平滑，并在整個光譜區(qū)域校正多點基線。所有光譜以各自的1 450 cm-1拉曼峰進行歸一化。

1.5 拉曼光譜數(shù)據(jù)分析及鑒別模型建立

采用SPSS Statistics 20(IBM，USA)軟件處理數(shù)據(jù)，對人胚胎干細胞系、急性早幼粒細胞白血病細胞系(NB4)和急性早幼粒細胞白血病患者(M3)骨髓白血病細胞進行主成分分析、判別分析和聚類分析。應(yīng)用主成分分析(principle component analysis，PCA)法對獲得的拉曼光譜數(shù)據(jù)進行PCA。應(yīng)用判別函數(shù)分析(discrimination function analysis，DFA)對獲取的主成分數(shù)據(jù)進行分析，建立鑒別模型對ESCs，NB4和M3患者白血病細胞的光譜數(shù)據(jù)進行鑒別，應(yīng)用交互驗證(cross-validation)的方法對鑒別模型進行驗證。采用SIMCA-P (Ver 14.1，Umetrics，Umea，Sweden)軟件對三組細胞進行偏最小二乘判別分析(partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)。所有數(shù)據(jù)操作使用Origin(OriginLab，Northampton，MA)、Graphpad Prism5(Graphpad Software，USA)和Volocity(Perkin Elmer，USA)軟件進行。

2 結(jié)果與討論

2.1 三組細胞瑞氏-吉姆薩染色光學(xué)顯微鏡成像與電子顯微鏡成像結(jié)果

從圖1(a)吉姆薩染色的病理圖中可以看出M3細胞核不規(guī)則，胞漿含大量顆粒。圖1(b)中NB4細胞胞漿少，核質(zhì)比大，細胞核規(guī)則，核仁不明顯。圖1(c)中ES細胞胞漿稀少，異染色質(zhì)多，核仁不明顯，無致密顆粒。圖1(d)的電鏡結(jié)果顯示M3細胞富含顆粒，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張。圖1(e)中NB4細胞顆粒少，細胞核輕度不規(guī)則。圖1(f)中ES細胞核仁明顯，無顆粒。M3細胞胞漿內(nèi)所含顆粒主要為MPO顆粒。為了確認拉曼數(shù)據(jù)，從形態(tài)學(xué)成像計算細胞核質(zhì)比例。我們從圖1(a)—(c)選取20～24個細胞計算核質(zhì)比例。M3，NB4和ES細胞的平均比例依次上升[圖1(g)]。通過形態(tài)學(xué)成像獲得的數(shù)據(jù)與通過拉曼顯微鏡獲得的數(shù)據(jù)一致。然后通過TEM圖像分析MPO含量。在TEM圖像中清楚地顯示了含有亞細胞水平的MPO顆粒的分布[圖1(d)—(f)]。M3細胞顯示強烈的MPO活性[圖1(d)]。NB4細胞含有一些顯示細胞質(zhì)中MPO活性較弱的細顆粒[圖1(e)]。ES細胞中MPO的分布非常少[圖1(f)]。三種不同分化階段白血病相關(guān)細胞中MPO含量的變化趨勢與MPO帶(1 581 cm-1)收集的拉曼數(shù)據(jù)一致。

2.2 三組細胞平均拉曼光譜的外形比較

本研究共獲得不同分化階段白血病相關(guān)細胞拉曼光譜181例，其中ES細胞特征光譜29例，NB4細胞特征光譜25例，M3細胞特征光譜127例(圖2)。細胞拉曼光譜的分子結(jié)構(gòu)和峰位歸屬見表1。在600～1 800 cm-1的范圍內(nèi)可見三種不同分化階段白血病相關(guān)細胞拉曼光譜呈現(xiàn)多個譜峰，形態(tài)相近。通過對比平均光譜，獲得差異性光譜，顯示不同種細胞間的拉曼光譜存在一定差異(圖3)。在M3細胞和NB4細胞差異光譜中，M3細胞在754，781，852，1 003，1 033，1 121，1 157，1 215，1 340，1 551，1 581 cm-1等處對應(yīng)的譜峰明顯強于NB4細胞，其中852，1 003，1 033，1 157和1 551 cm-1反映樣本細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及含量，781，1 340，1 581 cm-1與核酸相關(guān)，在這些波數(shù)處譜峰強度的變化表明M3細胞中的DNA，RNA和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的含量明顯高于NB4細胞。M3細胞在754，1 003，1 121，1 157，1 173，1 215，1 340，1 551和1 581 cm-1等處的譜峰強于ES細胞，表明前者核酸、蛋白質(zhì)、脂類等物質(zhì)的含量較高。NB4細胞和ES細胞拉曼光譜的比較顯示，前者在622，643，781，852，934，1 003，1 340和1 581 cm-1譜峰明顯高于ES細胞，其中622，643，852，934和1 003 cm-1與蛋白質(zhì)有關(guān)，781，1 340和1 581 cm-1與核酸組分有關(guān)，提示NB4細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸等物質(zhì)與ES細胞存在較大差異。上述結(jié)果顯示白血病細胞的整體活躍程度高于相對原始的胚胎干細胞，這與PI3K/Aku/mTOR通路有密切關(guān)系。例如mTOR復(fù)合物1(mTORC1)通過調(diào)控RNA翻譯、線粒體基因轉(zhuǎn)錄、磷酸化線粒體蛋白、參與糖酵解等方式，控制線粒體活性和生物合成。mTORC1也可促進磷酸戊糖途徑相關(guān)基因表達來促進核酸生成。mTORC1也可通過調(diào)節(jié)核糖體合成(mTORC1-S6K-S6通路)和mRNA的轉(zhuǎn)錄起始來調(diào)控蛋白質(zhì)合成。此外，mTORC1可通過激活脂肪合成基因的調(diào)控分子SREBP來促進脂肪生成。更為重要的是，mTOR可以抑制細胞的過度自噬。上述生物學(xué)過程解釋了白血病細胞光譜在核酸、蛋白質(zhì)及脂類等物質(zhì)譜峰強度高于ES細胞的原因。電鏡下觀察到M3細胞胞漿中存在大量MPO顆粒，數(shù)量明顯高于NB4、ES細胞。MPO是一種含血紅素輔基的血紅素蛋白酶。因此三組白血病相關(guān)細胞平均光譜在754，1 121，1 215和1 581 cm-1峰位上存在明顯的差異，這對通過拉曼光譜鑒別三種白血病相關(guān)細胞具有潛在的應(yīng)用價值。

圖1 三組細胞形態(tài)學(xué)分析結(jié)果

(a)—(c): M3, NB4, ES細胞瑞氏-吉姆薩染色結(jié)果； (d)—(f): M3, NB4, ES細胞透射電鏡結(jié)果； (g): 數(shù)字化圖像中M3, NB4, ES細胞核質(zhì)比率計算結(jié)果； (h): M3, NB4, ES細胞MPO含量和核質(zhì)比率平均值比較(**p<0.01)

Fig.1Morphologicalanalysisofthreegroupsofcells

(a)—(c): Wright-Giemsa staining result of M3, NB4, ES cell； (d)—(f): TEM result of M3, NB4, ES cell； (g): Calculation of nucleocytoplasmic ratio of M3, NB4, ES cell in digitization images； (h): Comparison of averaged intensity of MPO content and nucleocytoplasmic ratio of M3, NB4, ES cell (**p<0.01)

圖2 三組細胞平均拉曼光譜

2.3 三組細胞拉曼光譜的主成分分析-判別分析結(jié)果

通過對ES，NB4和M3患者骨髓白血病細胞的光譜數(shù)據(jù)進行PCA分析，從每張光譜1211個數(shù)據(jù)點提出79個主成分，累積變異性97%。將提取出的181張光譜數(shù)據(jù)的主成分進行DFA分析，建立鑒別模型。在DFA鑒別分類過程中，ES鑒別準(zhǔn)確率為100%(29/29)，NB4鑒別準(zhǔn)確率為100%(25/25)，M3鑒別準(zhǔn)確率為100%(127/127)，總體鑒別準(zhǔn)確率達100%(181/181)。本研究采用交互驗證的方法對鑒別模型進行檢驗，ES鑒別準(zhǔn)確率為100%(29/29)，NB4鑒別準(zhǔn)確率為96%(24/25)，M3鑒別準(zhǔn)確率為99.2%(126/127)，而通過交互驗證檢驗后鑒別模型的總體準(zhǔn)確率達98.9%(179/181)，表明鑒別模型預(yù)測能力良好(表2)。本文從3類細胞拉曼光譜結(jié)果中隨機抽取30張?zhí)卣鞴庾V(每類10張)，組成三組數(shù)據(jù)。圖4顯示3組數(shù)據(jù)的二維分布和三維分布，表明應(yīng)用PCA-DFA方法可以很好地鑒別ES，NB4和M3患者骨髓白血病細胞的光譜數(shù)據(jù)。

圖3 三組細胞的平均和差異譜

表1 細胞拉曼光譜的分子結(jié)構(gòu)和峰位歸屬

續(xù)表1

1 215MPO1 240Amide Ⅲ1 250Amide Ⅲ1 300CH2 deformation1 313CH3CH2 twistingCH3CH2 twisting1 336Polynucleotide chain1 340Polynucleotide chain1 361MPO1 415A, G21 437CH2 deformation1 450CH2 binding1 545～1 600MPO1 581MPOPyrimidine ring1 596MPO1 658Amide ⅠCC deformation

圖4 主成分分析結(jié)果

2.4 系統(tǒng)聚類分析

系統(tǒng)聚類法是目前最常用的一種聚類方法。使用前文所述方法從3類細胞拉曼光譜結(jié)果中隨機抽取30張?zhí)卣鞴庾V(每類10張)，組成三組數(shù)據(jù)。由圖5可知，該方法能很好地將ES細胞(1～10)、NB4(11～20)和M3細胞(21～30)拉曼光譜區(qū)分為三大類。

表2 基于PCA-DFA的三組細胞分類和交互驗證結(jié)果

Table 2 Classification and cross-validation result of the three groups based on PCA-DFAClassification Resultsa,c

a: 100.0% of original grouped cases correctly classified; b: Cross validation is done only for those cases in the analysis. In cross validation, each case is classified by the functions derived from all cases other than that case; c: 98.9% of cross-validated grouped cases correctly classified.

2.5 三組細胞拉曼光譜的偏最小二乘判別分析結(jié)果

為了更好的區(qū)分ES，NB4和M3細胞的拉曼光譜差異，區(qū)分這三種細胞的特異性生物標(biāo)志物，在PCA分析結(jié)果的基礎(chǔ)上對數(shù)據(jù)進一步運用有監(jiān)督的模式識別方法——偏最小二乘判別分析(PLS-DA)對樣本數(shù)據(jù)進行分析比較。如圖6所示，使用前文所述分組方法，三種細胞被成功區(qū)分。模型質(zhì)量參數(shù)R2X=0.684，R2Y=0.979，Q2=0.937，模型質(zhì)量參數(shù)表示該模型概括了第一主成分(t[1])和第二主成分(t[2])兩種整體信息的68.4%，能解釋因變量97.9%的變異信息，模型可預(yù)測準(zhǔn)確程度為93.7%。三種細胞中起主要區(qū)分作用的峰位在于MPO相關(guān)峰(754，1 121，1 215和1 581 cm-1)、蛋白質(zhì)相關(guān)峰(934，1 003和1 450 cm-1)以及核酸相關(guān)峰(826和1 340 cm-1)。

圖5 三組細胞聚類分析樹狀圖

2.6 三種細胞兩兩組合進行偏最小二乘判別分析結(jié)果和潛在變量負荷

為了進一步客觀地驗證三種細胞的拉曼譜峰差別，在差異譜的基礎(chǔ)上將三種細胞兩兩組合進行PLS-DA并分析載荷表征情況。如圖7(a)—(c)所示，三種細胞被兩兩成功區(qū)分，PLS擬合參數(shù)如下： (a)R2X(cum)=0.634，R2Y(cum)= 0.99和Q2(cum)=0.966，(b)R2X(cum)=0.581，R2Y(cum)=0.991和Q2(cum)=0.941，(c)R2X(cum)=0.496，R2Y(cum)=0.99和Q2(cum)=0.945。表明大部分方差由模型解釋，PLS-DA得分圖模型參數(shù)良好，并且擬合程度良好。使用這種方法，我們清楚地將其他三種不同分化階段細胞區(qū)分開。通過載荷分析，ES細胞在核酸峰(781，826和1 340 cm-1)高于M3細胞，這與影像學(xué)觀察到的ES細胞具有較高的細胞核與細胞質(zhì)比率一致，符合處于分化早期的原始細胞的一般特征。MPO相關(guān)峰(754，1 121，1 215和1 581 cm-1)是區(qū)分三種細胞的主要因素之一，在M3，NB4和ES細胞中的含量依次減少，這一現(xiàn)象與三種細胞超微結(jié)構(gòu)觀察到的顆粒依次減少相符。其余蛋白相關(guān)峰(622，643，852，934，1 003，1 450和1 551 cm-1)反映了三種細胞的活躍程度和增值代謝依M3，NB4和ES順序逐漸遞減，這與它們所處的分化階段有關(guān)，也與拉曼差異譜反映的信息一致，但并非如MPO和細胞核質(zhì)比率具有較高的特異性。

3 結(jié) 論

該研究證明了拉曼光譜作為基于內(nèi)在分子指紋的臨床工具來研究不同分化階段白血病相關(guān)細胞的潛力[12]。據(jù)我們所知，這是有關(guān)人胚胎干細胞和早幼粒細胞白血病之間的第一個研究。我們已經(jīng)證明，ES細胞、NB4細胞和M3細胞中主要的區(qū)別光譜特征是由于不同的MPO含量和核胞質(zhì)比率。這些分子變化可以用作光譜標(biāo)記以區(qū)分不同分化階段早幼粒細胞白血病相關(guān)細胞。證明了利用拉曼光譜和PLS-DA來識別白血病相關(guān)細胞的譜系特異性分化階段的可行性。這表明微小的變化可以在拉曼光譜的PLS-DA模型中捕獲并用于鑒定細胞譜系。本研究通過PCA-DFA建立的鑒別模型總體準(zhǔn)確率為100%，交互驗證后準(zhǔn)確率為98.9%，表明該模型預(yù)測性較好。系統(tǒng)聚類對不同種白血病細胞具有理想的甄別能力。

圖6 三種細胞的PLS-DA分析結(jié)果

圖7 三種細胞兩兩組合PLS-DA模型中的分類散點圖和潛在變量負荷

顯微拉曼光譜技術(shù)與PCA-DFA、系統(tǒng)聚類、PLS-DA等分析方法相結(jié)合，不僅可以識別胚胎干細胞和急性早幼粒細胞白血病細胞內(nèi)化學(xué)成分的差別，并可以根據(jù)這些差異鑒別處于不同分化階段的白血病相關(guān)細胞，探索細胞命運，具有廣闊的科學(xué)研究價值。