戴旭鋒,保金華,陳曉萍,李文炯,黃海笑,陳 浩

0 引言

失重狀態(tài)下液體懸浮無沉降，航天員體內的流體靜壓消失，血液和其他體液不像重力條件下那樣慣常地流向下身。相反，約有2000mL血液由下身轉移到胸腔和頭部，其中20%左右重分布到頭面部，可引起宇航員面部浮腫、頭脹、頸部靜脈曲張和鼻咽部堵塞等改變[1-3]。血液重新分布后，頭部灌流壓增高20～30mmHg[4-6]。近年來國外航天醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)，航天員在太空失重環(huán)境下，出現(xiàn)了不同程度的視覺功能和解剖學的改變，包括視盤水腫、眼球變扁、視網膜皺褶、遠視以及眼內壓升高等；這些改變有的人是短暫的，有些人要持續(xù)較長的時間。初步研究結果提示，可能與航天員頭部(尤其是眼球)血液重新分布有關[2-3,7]。至于失重對眼球尤其是視網膜的影響有多大，能否恢復，是否會造成視網膜永久性損害等，這些問題目前尚不清楚。文獻報道一些嚙齒類動物在地面，通過改變體位的方式，可以模擬失重狀態(tài)下體液重分布[8-9]，本研究選擇小鼠進行實驗。在觀察指標方面，閃光視網膜電圖(electroretinogram,ERG)能客觀反映視網膜整體功能，其中振蕩電位(oscillatory potentials,OPs)還能敏感地反映視網膜中內層的血液循環(huán)狀態(tài)[10-11]。本研究通過以上功能學檢測，并結合一些相關的形態(tài)學研究，來初步探討模擬失重對小鼠視網膜的影響。

1 材料和方法

1.1材料健康雄性2月齡清潔級C57BL/6J小鼠36只，體質量23±3g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SCXK(蘇)2016-0003。小鼠飼養(yǎng)于12h明/12h暗交替環(huán)境中，實驗動物飼養(yǎng)及操作，均在溫州醫(yī)科大學眼視光學院動物實驗中心進行。小鼠的喂養(yǎng)和使用，符合浙江省實驗動物管理的有關規(guī)定和條例。10%熒光素鈉注射液購自美國愛爾康公司；小鼠源抗Rhodopsin抗體(一抗)購自美國Millipore公司，兔源抗紅/綠視錐細胞視蛋白(Opsin)抗體(一抗)、兔源抗藍視錐細胞Opsin抗體(一抗)和Cy3標記的山羊抗兔IgG(二抗)均購自德國Merck Millipore公司，Alexa Fluor 488標記的山羊抗小鼠IgG(二抗)購自美國Thermo Fisher Scientific公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Roche公司。

1.2方法

1.2.1動物模型的制備和分組按隨機原則，將動物分為3個實驗組和3個相應的對照組，最終每組6只小鼠。實驗組參照Morey-Holton大鼠尾部懸吊法[8]，稍加改進，使之更適合建立小鼠模擬失重模型。實驗動物單籠飼養(yǎng)，尾部懸吊于籠頂，后肢自然懸空不受力，軀干長軸與籠底水平約呈30°角。前肢可正常抓地，小鼠能在籠底一定范圍自由活動，但始終保持頭低位，造成腹部和后肢的體液頭向重分布。期間，動物能順利進食和飲水。對照組小鼠也單籠飼養(yǎng)，尾部裝置同實驗組，但軀干長軸與籠底水平可呈0°角。對照組小鼠的攝食量，與相應的實驗組前1d的攝入量相同。具體分組如下：實驗1組(尾懸15d)，實驗2組(尾懸30d)，實驗3組(懸吊30d后恢復體位30d)；對照1組(正常飼養(yǎng)15d)，對照2組(正常飼養(yǎng)30d)，對照3組(正常飼養(yǎng)60d)。作為對照的3組小鼠不改變正常體位，分別飼養(yǎng)15、30和60d，然后同樣進行視網膜檢測。

1.2.2 ERG小鼠暗適應過夜后，用復方托吡卡胺眼藥水充分散瞳。氯胺酮(72mg/kg)和賽拉嗪(4mg/kg)混合液腹腔注射，動物全身麻醉后在角膜緣放置環(huán)狀細金絲電極，作為記錄電極；雙耳正中頭皮下插入的針狀電極作為參考電極，尾根部皮下插入的針狀電極作為地電極。全視野球形刺激器(Ganzfeld Q450)，標準白色閃光強度為3.0(cd·s)/m2，誘導暗適應ERG。記錄混合反應時，通頻帶設為0.2～500Hz；記錄OPs時，通頻帶設為65～300Hz[12]，單次閃光刺激持續(xù)時間為2ms，對相關反應波的幅值進行測量并分析。

1.2.3熒光素眼底血管造影應用小動物視網膜影像系統(tǒng)(Micron IV)，對小鼠行熒光素眼底血管造影(fluorescein fundus angiography,FFA)檢查。小鼠全身麻醉后置于專用的小動物臺上，使用人工淚液防止角膜干燥及屈光間質混濁，被檢眼充分散瞳。調整小鼠眼位，鏡頭向角膜緩慢推進，不斷調焦直至眼底清晰可見，且視乳頭基本居中。然后，動物腹腔注射熒光素鈉(0.001mL/g)。藍光照射下，循環(huán)至眼底血管的熒光素被激發(fā)出黃綠色熒光，對視網膜微血管的循環(huán)情況進行拍照[13]。

1.2.4免疫組化檢測感光細胞視色素或視蛋白的表達取材、固定和脫水：小鼠處死后馬上取眼球，在1×PBS中快速剪除角膜，將眼球即刻浸泡在4%多聚甲醛溶液中固定過夜(pH=7.4，4℃)，固定好的眼球在30%蔗糖中脫水4h。冰凍切片制備：眼球標本在包埋劑中浸2h，-80℃包埋然后冰凍切片，片厚12μm，切片方向與視軸平行。貼片于載玻片，在室溫下干燥30min。免疫熒光染色：冰凍切片置于穿透液(0.3% Triton X-100)中30min，增強細胞膜的通透性。常溫下，在5%牛血清白蛋白(工作液)中封閉1h。滴加一抗孵育過夜(4℃)，常溫下二抗孵育2h(避光)。用到的一抗有小鼠源抗Rhodopsin抗體(1∶300)、兔源抗兩種視錐細胞Opsin抗體(1∶400)，合適的二抗有山羊抗小鼠IgG(1∶400)和山羊抗兔IgG-Cy3(1∶1000)。1×PBS清洗，滴加DAPI染細胞核，免疫熒光顯微鏡(Zeiss)檢查。

1.2.5視網膜組織細胞凋亡檢測TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)細胞凋亡試劑盒是用來檢測組織細胞在凋亡早期過程中細胞核DNA的斷裂情況[14]。小鼠視網膜冰凍切片在0.2%的Triton X-100中處理，然后浸洗干凈。將50μL的TdT和450μL熒光素標記的dUTP液混勻，制備成TUNEL反應混合液。TUNEL技術常常造成假陰性或假陽性，因此有陽性對照和陰性對照可更準確地對結果進行分析。陽性對照先加100μL的DNaseⅠ液，反應控制在15℃～25℃，持續(xù)時間為10min，然后再加50μL的反應混合液；陰性對照僅加50μL熒光素標記的dUTP液。本實驗懸吊組和相應的對照組視網膜標本，直接加50μL的反應混合液；切片在暗濕盒中反應1h(37℃)，漂洗干凈后蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡(激發(fā)光的波長為488nm)下觀察。

圖1 模擬失重組和對照組小鼠暗適應閃光ERG A：混合反應;B：OPs。

圖2 模擬失重組和對照組小鼠FFA圖 熒光素注射后5min進行拍照，在距離視乳頭3PD的區(qū)域，比較各組視網膜的微循環(huán)狀態(tài)。實驗1組視網膜微血管網，較其他組更加密集，呈迂曲、擴張的表現(xiàn)。A：對照1組；B：實驗1組；C：實驗2組；D：實驗3組。

表1 模擬失重組和對照組小鼠暗適應閃光ERG的b波和O2波幅值比較

統(tǒng)計學分析：采用統(tǒng)計學軟件SPSS17.0分析數(shù)據，所有定量資料均滿足正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差表示。懸吊組與相應天數(shù)的對照組之間，數(shù)據比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1模擬失重對小鼠ERG的影響閃光ERG的混合反應和OPs，都是在3.0(cd·s)/m2的強光刺激下，由視網膜產生的生物電信號?；旌戏磻猙波幅值，實驗1組較對照1組升高，且差異有統(tǒng)計學意義(t=2.860,P<0.05，圖1A，表1)。實驗2、3組的b波幅值，與對照2、3組相比，差異均無統(tǒng)計學意義(t=1.350、-0.487,均P>0.05，表1)。同混合反應不同，OPs是在較窄通頻帶(本實驗設為65～300Hz)條件下記錄到的一組節(jié)律性小波，后者不受b波影響。小鼠OPs一般含有3～6個子波，各子波間隔時間約為10ms，其中第二子波(O2)相對比較穩(wěn)定。實驗1組O2幅值為197±33μV，對照1組O2的幅值為336±47μV，兩者差異有統(tǒng)計學意義(t=-5.938,P<0.001，圖1B，表1)。實驗2、3組的O2幅值，與對照2、3組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(t=-1.887、1.023,均P>0.05，表1)。

2.2模擬失重對小鼠視網膜血液循環(huán)的影響10%熒光素鈉在1s內被快速注射完畢，然后開始計時。注射后3～5s，視乳頭及視網膜動脈開始顯影，然后各級血管相繼快速充盈；至5min時，視網膜毛細血管已充盈；5min后脈絡膜的背景熒光開始逐漸變亮。在熒光素注射后5min時，對距離視乳頭相同距離的后極部視網膜，進行觀察并比較微循環(huán)狀態(tài)。結果顯示，實驗1組視網膜微血管網較其他組更加密集，呈迂曲擴張的表現(xiàn)，而視網膜大血管管徑、走行未見明顯異常(圖2B)。實驗2、3組，微循環(huán)均未顯示明顯異常，與相應的對照組沒有區(qū)別(圖2C、D)。

2.3各組感光細胞視色素或視蛋白的表達以及TUNEL染色情況模擬失重的實驗組中，感光細胞視色素或視蛋白的表達未見明顯異常(圖3)。在此基礎上，我們還進行TUNEL細胞凋亡檢測，觀察模擬失重是否造成視網膜中內層神經細胞的損傷。根據特殊的熒光素標記，TUNEL試劑盒能準確地定位正在凋亡的組織細胞。本實驗結果顯示，模擬失重的3個懸吊組小鼠，視網膜各層組織細胞均未見明顯的凋亡(圖4)，與相應的對照組沒有區(qū)別。

3 討論

太空失重狀態(tài)與人類生存的地球環(huán)境完全不同，失重對已適應地球重力作用的哺乳動物的影響，已成為空間生命科學研究的熱點之一。國際公認的在地面模擬失重效應(體液頭向重分布)的方法，包括適用于人[15]和獼猴的頭低位臥床實驗[16]，以及適用于小型嚙齒類動物的尾懸吊實驗[9]。以小鼠為例，體位改變后身體軀干與水平面的夾角越大，腹部和后肢體液發(fā)生頭向轉移的量越多。但夾角過大時，正常的進食進水會受到嚴重影響，將導致動物體質量銳減，存活期普遍很短(≤1wk)，造模反而不能成功。

圖3 模擬失重組和對照組小鼠視網膜感光細胞視色素或視蛋白的表達(免疫熒光染色×200)視桿細胞感光色素(Rhodopsin)染成綠色，視錐細胞視蛋白(Opsin)染成紅色，細胞核染成藍色。A：對照1組；B：實驗1組；C：實驗2組；D：實驗3組。

圖4 模擬失重組和對照組小鼠視網膜組織細胞凋亡檢測(TUNEL染色×200)凋亡細胞中斷裂DNA會結合特異性的基團，并產生顯色反應。A：陽性對照；B：對照1組；C：實驗1組；D：實驗2組；E：實驗3組。ONL：外核層；INL：內核層；GCL：神經節(jié)細胞層。

當身體軀干與水平面的夾角減至30°時[9]，動物正常的進食和飲水量基本不受影響，除造模容易成功外，實驗的干擾因素也最少。

哺乳動物的外層視網膜組織，基本上都含有兩種感光細胞，分別為視桿和視錐細胞。視桿細胞感光色素(Rhodopsin)和視錐細胞特異性Opsin的表達情況，與視網膜的生理功能和ERG結果密切相關。閃光ERG能夠客觀、敏感地反映全視網膜的整體功能。ERG混合反應的b波上升支，通常有一組規(guī)律的振蕩小波(OPs)，后者被認為起源于視網膜中內層神經網絡的抑制性反饋回路[10-11]。我們以小鼠作為研究對象，動物改變體位后短期內OPs幅值下降。OPs幅值的變化同b波不一致，提示前者可能是模擬失重狀態(tài)下，體液重新分布所導致的特異性改變。從ERG混合反應以及感光細胞視色素或視蛋白的表達情況來分析，視網膜外層的神經細胞(光感受器)并未受到較大的影響。模擬失重狀態(tài)下體液重新分布，可能主要影響視網膜中內層的功能。本研究發(fā)現(xiàn)，視網膜OPs的變化規(guī)律，可以用來驗證動物造模是否成功。

根據本研究中幾個時間點的ERG數(shù)據，我們發(fā)現(xiàn)視網膜功能變化呈如下趨勢：(1)模擬失重短期內(尾懸15d)，視網膜中內層呈現(xiàn)功能下降，小鼠OPs幅值約為正常水平的60%。(2)模擬失重時間延長(尾懸30d)，可能隨著動物自身調節(jié)機制的啟動，視網膜相關功能又出現(xiàn)回升，此時OPs幅值達到正常水平的85%左右。(3)尾懸30d小鼠恢復正常體位1mo后，視網膜中內層功能基本上能完全恢復至正常水平。除了小鼠之外，人體在地面模擬失重的實驗，也發(fā)現(xiàn)OPs在一定范圍內發(fā)生波動[17]。

臨床上發(fā)現(xiàn)，OPs對視網膜中內層的血液循環(huán)狀態(tài)比較敏感。比如糖尿病視網膜病變和視網膜靜脈阻塞的早期，由于視網膜循環(huán)發(fā)生阻滯和靜脈淤血，OPs幅值可顯著降低[10-11]。本研究中小鼠尾懸15d發(fā)生OPs異常，進一步行FFA檢測，也發(fā)現(xiàn)該時間點視網膜微血管網呈迂曲、擴張的特點。以上可能與小鼠腹部及后肢的血液大量回流到頭部，導致暫時的視網膜微循環(huán)異常有關。人體頭低足高位臥床，模擬失重狀態(tài)下血液重新分配，短期內也會造成頭面部供血增加，同時引起眼部血液循環(huán)改變，這種改變對視功能可能造成影響[7]。

小鼠尾懸30d組，動物機體可能已經對模擬失重(體液頭向重分布)狀態(tài)產生適應，此時視網膜微循環(huán)和神經生物電反應出現(xiàn)恢復。人體模擬失重早期，視網膜在表現(xiàn)為功能的下降后；隨著自身調節(jié)機制的啟動，視網膜功能也會出現(xiàn)反應性升高，甚至超出正常水平；隨著不斷地自身調節(jié)，最終也能恢復到正常水平[17]。小鼠模擬失重短期內，形態(tài)學上除了視網膜微循環(huán)發(fā)生暫時性改變外，TUNEL染色未見視網膜組織細胞的結構性損傷。

從航天員經歷過的短、中期在軌飛行情況來看[7]，失重對眼球的影響并不大且基本上能完全恢復。這與本研究中，動物實驗的一些形態(tài)和功能檢查結果基本一致。隨著懸吊時間延長，視網膜微循環(huán)的異常狀態(tài)發(fā)生改善，提示動物機體可能存在某種神經血管的調節(jié)機制。然而航天員長期在太空工作和生活后，視網膜及其功能出現(xiàn)紊亂，除了失重狀態(tài)下全身體液重分布外，可能也和其他因素有關，如宇宙輻射，航天器內空氣組成和濕度異常，特殊航空食譜，以及航天員生物節(jié)律異常等[18-19]。

小鼠尾懸短期內ERG-OPs異常，可能與視網膜中內層的微循環(huán)狀態(tài)改變有關。相關的視覺電生理檢測，不僅可以用來驗證動物體液頭向重分布的造模是否成功外；將來還可能適用于失重狀態(tài)下，對宇航員的視網膜功能進行無創(chuàng)性監(jiān)測。