王冰潔，張佳光，楊婧

三峽大學第三臨床醫(yī)學院國藥葛洲壩中心醫(yī)院感染性疾病科，湖北 宜昌 443002

我國原發(fā)性肝癌(primary hepatocellular carcinoma，PHC)發(fā)病原因以病毒性肝炎多見，乙型肝炎病毒(HBV)感染相關性肝癌尤為嚴重，酒精、黃曲霉素等也是我國PHC 發(fā)病的重要原因。肥胖、糖尿病、代謝綜合征及非酒精性脂肪肝等導致肝癌發(fā)生的風險也日益增加。肝癌發(fā)病隱匿、進展迅速，患者就診時往往已在中晚期，甚至失去手術根治切除機會，因此，對肝癌的早發(fā)現、早診斷可以很大程度上提高肝癌患者的生存期。

1 肝細胞癌流行現狀

根據2018年全球癌癥統計報告數據，全球新增肝癌占全球癌癥發(fā)病和死亡的4.7%和8.2%，男性患病明顯高于女性，肝癌的發(fā)病率和死亡率分居全球癌癥發(fā)病和死亡的第6 位和第4 位，居中國癌癥發(fā)病和死亡的第4位和第3位[1]。

肝硬化、肝炎病毒感染、嗜酒、黃曲霉素暴露是肝癌發(fā)生的主要危險因素，HBV感染仍是我國肝癌發(fā)生的主要原因。HBV感染具有直接致癌的作用，其機制包括病毒載量、病毒的持續(xù)感染、隱匿HBV 感染等，HBV與HIV或HCV的聯合感染也會增加罹患肝癌的危險性。非酒精性脂肪肝、糖尿病、肥胖等致病因素也日益突出，其實際風險尚不明確[2]。目前主張對肝癌高危人群進行每6 個月一次甲胎蛋白(AFP)檢測及肝臟超聲，但超聲結果受操作者水平及患者體型的影響，對于直徑小于1 cm的小肝癌容易漏診；另一方面，存在30%～40%肝癌人群AFP陰性，達不到肝癌診斷標準[3]。因此，為探索出更適合肝癌篩查的血清腫瘤標志物及方案成為國內外廣泛關注的問題。

2 AFP陰性肝癌

AFP是一種分子量約為70 kDa的糖蛋白，由卵黃囊和肝臟產生。肝細胞發(fā)生癌變后，由于低甲基化作用使AFP 基因激活并表達，表現為AFP 陽性肝癌。AFP基因的表達受不同因素調控，有時會導致部分肝癌患者AFP 不表達或直到晚期也始終保持低水平(血清AFP 濃度<200 ng/mL)，稱之為AFP 陰性肝癌。臨床表現多以右上腹痛為主，肝功能損害較輕，全身衰竭較晚，乙肝表面抗原陽性率及合并肝硬化者較少。通過比較AFP 陰性與陽性肝癌組織mRNA 表達譜的差異性，AFP陰性肝癌高表達基因主要參與細胞凋亡和程序性死亡，而AFP陽性的高表達基因則主要參與有絲分裂和細胞周期等過程[4]。這提示在不同AFP水平的肝癌在發(fā)生和發(fā)展存在不同的分子機制，在分子領域的深入研究有助于發(fā)現AFP 陰性肝癌早期診斷的分子標志物和肝癌治療的新靶點。

3 主要肝細胞癌診斷相關血清標志物

3.1 AFP 異質體(AFP-L3)及與血清總的AFP 比值(AFP-L3%) 1970 年Parves 發(fā)現PHC 患者血清中唾液酸含量不同，從而提出AFP異質體(AFP-L3)的概念。AFP 不同的糖殘基(AFP-L1、AFP-L2、AFP-L3)決定了它們與凝集素的結合能力，當肝細胞發(fā)生癌變時，AFP 的糖殘基發(fā)生巖澡糖基化，表現出與小扁豆凝集素(lens culinaris agglutinin，LCA)不同程度的親和性，以AFP-L3 親和性最強。AFP-L3 僅由肝癌細胞產生，其水平升高僅見于PHC患者[5]。AFP-L3與血清總的AFP比值(AFP-L3%)是小肝癌和早期肝癌診斷的高特異性指標，還可以反映肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的惡性特征，如門脈浸潤和腫瘤低分化等[6]。FDA 早在2005 年批準檢測AFP-L3 應用于肝癌診斷，并把AFP-L3%≥10%作為診斷肝細胞癌的陽性界定[7]。AFP-L3%是獨立于AFP 的肝癌診斷因子，不受血清總AFP水平和半衰期影響，在AFP不升高的情況下，有34.3%的原發(fā)性肝癌患者在確診1 年前即出現AFP-L3%升高[8]。AFP-L3%也是肝癌復發(fā)的獨立預測指標，術前AFP-L3%>10%、術后AFP-L3 持續(xù)陽性或由陰性轉為陽性的患者復發(fā)較早且總生存率更低[6]?，F階段國內檢測AFP-L3 的方法主要為親和吸附離心法，需手工操作，步驟繁瑣、耗時、成本高且重復性較差；微流控免疫熒光法實現了自動化檢測，但國內應用較少，尚缺乏足夠的臨床經驗和數據[7]。

3.2 異常凝血酶原(DCP/PIVKAⅡ) LIEBMAN于1984 年首次證實PHC 患者血中含有較高的異常凝血酶原(des-γ-carboxyprothrombin，DCP)，現也稱維生素K 缺乏或拮抗劑Ⅱ誘導的蛋白質(PIVKAⅡ)[9]。在正常人體內，凝血酶原前體形成具有正常凝血功能的凝血酶原被認為是其谷氨酸殘基(Glu)羧化成為γ-羧化谷氨酸(Gla)的過程，少于10 個Glu 未轉化為Gla 的凝血酶原前體即成為DCP 從而失去正常凝血功能[9]。研究發(fā)現DCP 通過激活DCP-Met-JAK1-STAT3 信號傳導途徑刺激HCC生長；通過激活基質金屬蛋白酶和ERK1/2MAPK 通路增加HCC 的侵襲和轉移；并具有促進血管生成的作用，有望成為一種新的血管生成因子[9]。 日本肝病學會(Japan Society of Hepatology，JSH)制定的肝癌診療指南中建議，將AFP、AFP-L3 和DCP 同時作為肝癌篩查的標志物[3]。有研究顯示在HCC 患者中DCP 水平顯著升高，有利于區(qū)分慢性肝病、肝硬化等良性疾病[10]。DCP與AFP作用機制相互獨立，在診斷肝癌上存在差異，對AFP 陰性肝癌靈敏度高[11]。其優(yōu)點包括高于AFP 的特異性；在體內的半衰期更短能更及時反映治療效果因此可用于HCC 術后復發(fā)的監(jiān)測。但DCP水平與腫瘤直徑呈正相關，不推薦作為肝癌篩查和診斷的獨立指標，需與其他腫瘤標志物聯合檢測[12]。在特定因素(如VitK 缺乏的膽管病、華法林攝入、長期阻塞性黃斑及一些抗生素等)下DCP的值也會升高，干擾了DCP對原發(fā)性肝癌的診斷。

3.3 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 (Glypicans-3，GPC3) GPC3是蛋白聚糖家族成員之一，通常在胎兒及HCC 患者肝臟組織中檢出，而健康成人、肝炎及肝硬化患者血清及組織中無明顯表達[13]。GPC3 通過乙酰肝素鏈(HS鏈)穩(wěn)定和促進Wnt及其受體Frizzled間的相互作用，并與FGF2受體結合促進FGF信號傳導，調節(jié)肝癌的發(fā)生和生長；另外，GPC3可能通過對上皮-間質轉化(TAM)功能的影響促進HCC發(fā)展和轉移，其過表達將導致侵襲的發(fā)生，提示預后不良[14]。有研究提示GPC3 對于直徑小于2 cm 的肝癌、AFP 陰性肝癌靈敏度較高[12]。但一項薈萃分析指出GPC3在肝硬化和肝癌患者中特異性不如AFP，靈敏度相似，推薦兩者聯合檢測[15]。隨著靶向GPC3 分子成像技術的發(fā)展，有望應用于肝癌治療前的定位與分期、術中手術切緣的確定以及術后療效監(jiān)測。近年來GPC3的單克隆抗體、肽疫苗和DNA疫苗的研發(fā)為肝癌靶向治療提供精確靶點；相關的免疫毒素治療利用抗體誘導的細胞信號失活和毒素誘導的蛋白質合成抑制以促進腫瘤細胞的消亡，大大提高了肝癌化療的安全性和功效性[16]，在肝癌治療上具有更好前景。

3.4 高爾基體糖蛋白(GP73) 在正常肝臟中GP73 幾乎只少量表達于匯管區(qū)的膽管上皮，當發(fā)生肝臟疾患如病毒性肝炎、自身免疫性肝病、肝硬化及肝癌時可特異性表達，尤以結締組織周圍及肝硬化結節(jié)處最強。Marrero 通過蛋白質印跡技術分析352 例肝癌患者血清，發(fā)現GP73 診斷肝癌的靈敏度 與 特 異 度 均 超 過70%( 約 為AFP 的2.5 倍)，在AFP<20 ng /L 的肝癌患者中，超過半數人群GP73 明顯升高，這提示GP73 在AFP 水平升高不明顯或不升高的情況下更有價值[17]。我國學者毛一雷的一項包含4 217 名研究對象的多中心研究同樣證實了這一觀點，并提出與AFP 聯合檢測能大大提高肝癌檢出率[18]。但近些年GP73 用于診斷肝癌存在爭議，研究指出血清GP73 可以反映急慢性肝病炎癥壞死程度，與肝纖維化分期更密切[19]。LIU 等[20]的研究發(fā)現合并肝硬化的肝癌患者血清GP73 水平升高，而無肝硬化的肝癌患者不升高；在根治性切除腫瘤組織后血清AFP 水平下降而GP73 水平保持穩(wěn)定，從而提出GP73主要表達于肝硬化組織中而與HCC無關，不適合肝癌的診斷。此外，GP73 可反映肝細胞惡性轉化過程中的動態(tài)變化，隨肝組織形態(tài)學的改變，肝組織及血清GP73 呈上升趨勢，其表達水平與肝癌分期平行，表達水平越高患者總生存期越短[21]。血清GP73水平變化與肝損傷嚴重程度正相關，是識別肝臟損傷的敏感指標，在多種良性肝病中存在不同程度升高，因此在鑒別肝臟良惡性病變上作用有限。

3.5 α-L-巖藻糖苷酶(α-l-fucosidase，AFU) AFU是一種水解巖藻糖蛋白的溶酶體酶，存在于所有哺乳動物細胞中。DEUGNIER 首次報道了AFU 在原發(fā)性肝癌患者血清中過表達，提示AFU可能是肝癌早期診斷的潛在標志物，診斷的敏感性為70.7%～94.0%，特異性為37.0%～84.0%[12]，其活性明顯高于繼發(fā)性肝癌及肝硬化患者。另外，血清AFU水平與肝癌細胞直徑呈正相關，在小肝癌或AFP陰性肝癌中表達更加突出，且與AFP 陽性率無明顯相關性[22]，可作為AFP 診斷早期肝癌的有效補充。但在糖尿病、胰腺炎、甲狀腺功能減低癥時也會有一定程度的升高[23]，因此特異性不高，一般需要與其他標志物聯合檢測。有研究表明原發(fā)性肝癌患者術后血清AFU水平明顯下降[24]，這提示AFU還可用于肝癌術后的療效監(jiān)測，是獨立的預后指標。

3.6 骨橋蛋白(osteopontin，OPN) 骨橋蛋白是一種具有多種生物活性的分泌型鈣結合磷酸化糖蛋白，主要參與整合素介導的細胞信號轉導，在結腸癌、胰腺癌和乳腺癌等多種腫瘤細胞的致癌過程中發(fā)揮重要作用[25]。OPN 的表達水平與HCC 臨床病理特點密切相關，如包膜浸潤、血管侵犯、淋巴結轉移及臨床分期。一些針對不同國家的大樣本病例對照研究顯示OPN單獨或聯合AFP診斷HCC的結果可能存在地區(qū)差異，需要更多前瞻性研究驗證OPN作為肝癌血清標志物的可行性[12]。研究表明HCC 患者中OPN 水平明顯高于肝炎或肝硬化患者，且OPN對病毒性肝炎相關HCC具有較高診斷價值，因此更適合應用于我國肝癌人群[26]。血清OPN 在直徑小于2 cm 及AFP 陰性肝癌患者中顯著升高[27]。另外，OPN可能在預測肝癌患者預后方面的優(yōu)勢更突出，其表達可能與腫瘤包膜的完整性有關，促進肝內浸潤、肝外轉移及肝癌復發(fā)，但具體機制尚未明確[27]。一項大樣本Meta 分析指出OPN 與腫瘤大小、分期呈正相關，其高水平表達往往提示預后不良，總生存時間和無病生存期更短[28]。聯合血管內皮生長因子可作為預測肝癌術后復發(fā)轉移的潛在指標[27]。

3.7 分泌型糖蛋白(DKK1) DKK1 是一種分泌型蛋白，能在血清中檢測到，通過結合細胞表面受體從而抑制經典Wnt信號通路，而這一信號通路是包括肝癌在內的大多數腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機制[29]。DKK1 在不同腫瘤組織中存在差異性表達，尤其在肝癌、肺癌、宮頸癌等腫瘤中表達顯著[30]。對早期和直徑<2 cm 的小肝癌診斷優(yōu)于AFP，在AFP 陰性肝癌中其診斷的特異性為90%、敏感性為70.4%，與AFP聯合檢測可將敏感性提高到88%[31]。說明DKK1 可以降低早期肝癌、小肝癌及AFP陰性肝癌的漏診率，同時，較高的特異性對鑒別肝臟良惡性病變幫助很大；利用DKK1進行聯合檢測可以作為AFP的有效補充。

3.8 微循環(huán)RNA (miRNA) 微循環(huán)RNA (miRNA)是一種小型非編碼RNA，以外泌體、蛋白結合微粒和凋亡小體的方式存在人體體液循環(huán)中，其主要功能是降解目的基因的mRNA，從而調控靶向基因的表達，在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中存在多種miRNA 的異常表達。已知文獻報道中，與肝癌有關的異常表達的miRNAs 就有200 余種，其中miR-1、miR-16、let-7f、miR-21、miR-24-3p、miR-122、miR-139、miR-215、miR-221、miR-222這10種miRNA可以作為肝癌早期診斷的生物標志物，以miR21與miR-122的潛能最大[32]。研究表明miR-122表達降低可導致肝纖維化失代償，增加肝癌發(fā)生風險，其表達變化與乙型肝炎病毒DNA水平顯著相關，提示miR-122不僅有利于我國肝癌的早期診斷也可以作為肝癌治療的有效靶點[33]。有文獻指出miRNA 在血液中不容易被內源性RNA 酶降解，能穩(wěn)定存在于血液中[34]，這一特性表明miRNA具有成為生物標記物可能，且miRNA 獲取方便，幾乎可以在人體所有體液(唾液、尿液、血液等)中分離得到，患者接受度高[33]。但是miRNA調控基因表達上復雜多樣，一種miRNA參與多種基因的表達，每一種目的基因的表達又受到一種或多種miRNA的靶向調控，其交叉調控機制使得尋找與肝癌相關的特異性miRNA 極具挑戰(zhàn)。目前miRNA 與肝癌作用關系及機制尚未完全闡明，聯合多種miRNA 能增加肝癌診斷能力，但需要選擇合適的組合，仍需大量研究數據。

4 結語

綜上所述，血清學標志物檢測費用相對低廉，便于篩查及重復檢測，尋找能夠替代或有效補充AFP早期診斷原發(fā)性肝癌的血清學標志物仍是目前研究主流。但仍存在這些問題：(1)未新發(fā)現可單獨用于篩查PHC 的血清學標志物，需依賴多項標志物聯合檢測，但究竟怎樣的組合作為篩查指標仍沒有定論；(2)目前我國的研究多是小樣本、單中心的研究，缺乏更多的數據支持及臨床驗證；(3)一些標志物存在特定的檢測閾值，而不同的檢測試劑和方法對檢測結果存在偏倚；(4)由于國家在肝炎防治上的有效舉措，現階段我國病毒性肝炎發(fā)病率逐年下降，但肝癌發(fā)生的危險因素越來越多，需要更多基礎研究指導臨床標志物的選擇。除血清學標志物外，我國在免疫組化、miRNA 方面的研究也逐步深入并取得有效成果，相信隨著蛋白組學、基因組學、分子病理流行病學及信息工程等的發(fā)展，更加經濟、方便且準確性高的篩查方案能更早應用于臨床。