王冰潔，張佳光，楊婧

三峽大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院國藥葛洲壩中心醫(yī)院感染性疾病科，湖北 宜昌 443002

我國原發(fā)性肝癌(primary hepatocellular carcinoma，PHC)發(fā)病原因以病毒性肝炎多見，乙型肝炎病毒(HBV)感染相關(guān)性肝癌尤為嚴(yán)重，酒精、黃曲霉素等也是我國PHC 發(fā)病的重要原因。肥胖、糖尿病、代謝綜合征及非酒精性脂肪肝等導(dǎo)致肝癌發(fā)生的風(fēng)險也日益增加。肝癌發(fā)病隱匿、進(jìn)展迅速，患者就診時往往已在中晚期，甚至失去手術(shù)根治切除機(jī)會，因此，對肝癌的早發(fā)現(xiàn)、早診斷可以很大程度上提高肝癌患者的生存期。

1 肝細(xì)胞癌流行現(xiàn)狀

根據(jù)2018年全球癌癥統(tǒng)計報告數(shù)據(jù)，全球新增肝癌占全球癌癥發(fā)病和死亡的4.7%和8.2%，男性患病明顯高于女性，肝癌的發(fā)病率和死亡率分居全球癌癥發(fā)病和死亡的第6 位和第4 位，居中國癌癥發(fā)病和死亡的第4位和第3位[1]。

肝硬化、肝炎病毒感染、嗜酒、黃曲霉素暴露是肝癌發(fā)生的主要危險因素，HBV感染仍是我國肝癌發(fā)生的主要原因。HBV感染具有直接致癌的作用，其機(jī)制包括病毒載量、病毒的持續(xù)感染、隱匿HBV 感染等，HBV與HIV或HCV的聯(lián)合感染也會增加罹患肝癌的危險性。非酒精性脂肪肝、糖尿病、肥胖等致病因素也日益突出，其實際風(fēng)險尚不明確[2]。目前主張對肝癌高危人群進(jìn)行每6 個月一次甲胎蛋白(AFP)檢測及肝臟超聲，但超聲結(jié)果受操作者水平及患者體型的影響，對于直徑小于1 cm的小肝癌容易漏診；另一方面，存在30%～40%肝癌人群AFP陰性，達(dá)不到肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。因此，為探索出更適合肝癌篩查的血清腫瘤標(biāo)志物及方案成為國內(nèi)外廣泛關(guān)注的問題。

2 AFP陰性肝癌

AFP是一種分子量約為70 kDa的糖蛋白，由卵黃囊和肝臟產(chǎn)生。肝細(xì)胞發(fā)生癌變后，由于低甲基化作用使AFP 基因激活并表達(dá)，表現(xiàn)為AFP 陽性肝癌。AFP基因的表達(dá)受不同因素調(diào)控，有時會導(dǎo)致部分肝癌患者AFP 不表達(dá)或直到晚期也始終保持低水平(血清AFP 濃度<200 ng/mL)，稱之為AFP 陰性肝癌。臨床表現(xiàn)多以右上腹痛為主，肝功能損害較輕，全身衰竭較晚，乙肝表面抗原陽性率及合并肝硬化者較少。通過比較AFP 陰性與陽性肝癌組織mRNA 表達(dá)譜的差異性，AFP陰性肝癌高表達(dá)基因主要參與細(xì)胞凋亡和程序性死亡，而AFP陽性的高表達(dá)基因則主要參與有絲分裂和細(xì)胞周期等過程[4]。這提示在不同AFP水平的肝癌在發(fā)生和發(fā)展存在不同的分子機(jī)制，在分子領(lǐng)域的深入研究有助于發(fā)現(xiàn)AFP 陰性肝癌早期診斷的分子標(biāo)志物和肝癌治療的新靶點。

3 主要肝細(xì)胞癌診斷相關(guān)血清標(biāo)志物

3.1 AFP 異質(zhì)體(AFP-L3)及與血清總的AFP 比值(AFP-L3%) 1970 年P(guān)arves 發(fā)現(xiàn)PHC 患者血清中唾液酸含量不同，從而提出AFP異質(zhì)體(AFP-L3)的概念。AFP 不同的糖殘基(AFP-L1、AFP-L2、AFP-L3)決定了它們與凝集素的結(jié)合能力，當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生癌變時，AFP 的糖殘基發(fā)生巖澡糖基化，表現(xiàn)出與小扁豆凝集素(lens culinaris agglutinin，LCA)不同程度的親和性，以AFP-L3 親和性最強(qiáng)。AFP-L3 僅由肝癌細(xì)胞產(chǎn)生，其水平升高僅見于PHC患者[5]。AFP-L3與血清總的AFP比值(AFP-L3%)是小肝癌和早期肝癌診斷的高特異性指標(biāo)，還可以反映肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的惡性特征，如門脈浸潤和腫瘤低分化等[6]。FDA 早在2005 年批準(zhǔn)檢測AFP-L3 應(yīng)用于肝癌診斷，并把AFP-L3%≥10%作為診斷肝細(xì)胞癌的陽性界定[7]。AFP-L3%是獨立于AFP 的肝癌診斷因子，不受血清總AFP水平和半衰期影響，在AFP不升高的情況下，有34.3%的原發(fā)性肝癌患者在確診1 年前即出現(xiàn)AFP-L3%升高[8]。AFP-L3%也是肝癌復(fù)發(fā)的獨立預(yù)測指標(biāo)，術(shù)前AFP-L3%>10%、術(shù)后AFP-L3 持續(xù)陽性或由陰性轉(zhuǎn)為陽性的患者復(fù)發(fā)較早且總生存率更低[6]?，F(xiàn)階段國內(nèi)檢測AFP-L3 的方法主要為親和吸附離心法，需手工操作，步驟繁瑣、耗時、成本高且重復(fù)性較差；微流控免疫熒光法實現(xiàn)了自動化檢測，但國內(nèi)應(yīng)用較少，尚缺乏足夠的臨床經(jīng)驗和數(shù)據(jù)[7]。

3.2 異常凝血酶原(DCP/PIVKAⅡ) LIEBMAN于1984 年首次證實PHC 患者血中含有較高的異常凝血酶原(des-γ-carboxyprothrombin，DCP)，現(xiàn)也稱維生素K 缺乏或拮抗劑Ⅱ誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)(PIVKAⅡ)[9]。在正常人體內(nèi)，凝血酶原前體形成具有正常凝血功能的凝血酶原被認(rèn)為是其谷氨酸殘基(Glu)羧化成為γ-羧化谷氨酸(Gla)的過程，少于10 個Glu 未轉(zhuǎn)化為Gla 的凝血酶原前體即成為DCP 從而失去正常凝血功能[9]。研究發(fā)現(xiàn)DCP 通過激活DCP-Met-JAK1-STAT3 信號傳導(dǎo)途徑刺激HCC生長；通過激活基質(zhì)金屬蛋白酶和ERK1/2MAPK 通路增加HCC 的侵襲和轉(zhuǎn)移；并具有促進(jìn)血管生成的作用，有望成為一種新的血管生成因子[9]。 日本肝病學(xué)會(Japan Society of Hepatology，JSH)制定的肝癌診療指南中建議，將AFP、AFP-L3 和DCP 同時作為肝癌篩查的標(biāo)志物[3]。有研究顯示在HCC 患者中DCP 水平顯著升高，有利于區(qū)分慢性肝病、肝硬化等良性疾病[10]。DCP與AFP作用機(jī)制相互獨立，在診斷肝癌上存在差異，對AFP 陰性肝癌靈敏度高[11]。其優(yōu)點包括高于AFP 的特異性；在體內(nèi)的半衰期更短能更及時反映治療效果因此可用于HCC 術(shù)后復(fù)發(fā)的監(jiān)測。但DCP水平與腫瘤直徑呈正相關(guān)，不推薦作為肝癌篩查和診斷的獨立指標(biāo)，需與其他腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測[12]。在特定因素(如VitK 缺乏的膽管病、華法林?jǐn)z入、長期阻塞性黃斑及一些抗生素等)下DCP的值也會升高，干擾了DCP對原發(fā)性肝癌的診斷。

3.3 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 (Glypicans-3，GPC3) GPC3是蛋白聚糖家族成員之一，通常在胎兒及HCC 患者肝臟組織中檢出，而健康成人、肝炎及肝硬化患者血清及組織中無明顯表達(dá)[13]。GPC3 通過乙酰肝素鏈(HS鏈)穩(wěn)定和促進(jìn)Wnt及其受體Frizzled間的相互作用，并與FGF2受體結(jié)合促進(jìn)FGF信號傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)肝癌的發(fā)生和生長；另外，GPC3可能通過對上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(TAM)功能的影響促進(jìn)HCC發(fā)展和轉(zhuǎn)移，其過表達(dá)將導(dǎo)致侵襲的發(fā)生，提示預(yù)后不良[14]。有研究提示GPC3 對于直徑小于2 cm 的肝癌、AFP 陰性肝癌靈敏度較高[12]。但一項薈萃分析指出GPC3在肝硬化和肝癌患者中特異性不如AFP，靈敏度相似，推薦兩者聯(lián)合檢測[15]。隨著靶向GPC3 分子成像技術(shù)的發(fā)展，有望應(yīng)用于肝癌治療前的定位與分期、術(shù)中手術(shù)切緣的確定以及術(shù)后療效監(jiān)測。近年來GPC3的單克隆抗體、肽疫苗和DNA疫苗的研發(fā)為肝癌靶向治療提供精確靶點；相關(guān)的免疫毒素治療利用抗體誘導(dǎo)的細(xì)胞信號失活和毒素誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)合成抑制以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的消亡，大大提高了肝癌化療的安全性和功效性[16]，在肝癌治療上具有更好前景。

3.4 高爾基體糖蛋白(GP73) 在正常肝臟中GP73 幾乎只少量表達(dá)于匯管區(qū)的膽管上皮，當(dāng)發(fā)生肝臟疾患如病毒性肝炎、自身免疫性肝病、肝硬化及肝癌時可特異性表達(dá)，尤以結(jié)締組織周圍及肝硬化結(jié)節(jié)處最強(qiáng)。Marrero 通過蛋白質(zhì)印跡技術(shù)分析352 例肝癌患者血清，發(fā)現(xiàn)GP73 診斷肝癌的靈敏度 與 特 異 度 均 超 過70%( 約 為AFP 的2.5 倍)，在AFP<20 ng /L 的肝癌患者中，超過半數(shù)人群GP73 明顯升高，這提示GP73 在AFP 水平升高不明顯或不升高的情況下更有價值[17]。我國學(xué)者毛一雷的一項包含4 217 名研究對象的多中心研究同樣證實了這一觀點，并提出與AFP 聯(lián)合檢測能大大提高肝癌檢出率[18]。但近些年GP73 用于診斷肝癌存在爭議，研究指出血清GP73 可以反映急慢性肝病炎癥壞死程度，與肝纖維化分期更密切[19]。LIU 等[20]的研究發(fā)現(xiàn)合并肝硬化的肝癌患者血清GP73 水平升高，而無肝硬化的肝癌患者不升高；在根治性切除腫瘤組織后血清AFP 水平下降而GP73 水平保持穩(wěn)定，從而提出GP73主要表達(dá)于肝硬化組織中而與HCC無關(guān)，不適合肝癌的診斷。此外，GP73 可反映肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的動態(tài)變化，隨肝組織形態(tài)學(xué)的改變，肝組織及血清GP73 呈上升趨勢，其表達(dá)水平與肝癌分期平行，表達(dá)水平越高患者總生存期越短[21]。血清GP73水平變化與肝損傷嚴(yán)重程度正相關(guān)，是識別肝臟損傷的敏感指標(biāo)，在多種良性肝病中存在不同程度升高，因此在鑒別肝臟良惡性病變上作用有限。

3.5 α-L-巖藻糖苷酶(α-l-fucosidase，AFU) AFU是一種水解巖藻糖蛋白的溶酶體酶，存在于所有哺乳動物細(xì)胞中。DEUGNIER 首次報道了AFU 在原發(fā)性肝癌患者血清中過表達(dá)，提示AFU可能是肝癌早期診斷的潛在標(biāo)志物，診斷的敏感性為70.7%～94.0%，特異性為37.0%～84.0%[12]，其活性明顯高于繼發(fā)性肝癌及肝硬化患者。另外，血清AFU水平與肝癌細(xì)胞直徑呈正相關(guān)，在小肝癌或AFP陰性肝癌中表達(dá)更加突出，且與AFP 陽性率無明顯相關(guān)性[22]，可作為AFP 診斷早期肝癌的有效補充。但在糖尿病、胰腺炎、甲狀腺功能減低癥時也會有一定程度的升高[23]，因此特異性不高，一般需要與其他標(biāo)志物聯(lián)合檢測。有研究表明原發(fā)性肝癌患者術(shù)后血清AFU水平明顯下降[24]，這提示AFU還可用于肝癌術(shù)后的療效監(jiān)測，是獨立的預(yù)后指標(biāo)。

3.6 骨橋蛋白(osteopontin，OPN) 骨橋蛋白是一種具有多種生物活性的分泌型鈣結(jié)合磷酸化糖蛋白，主要參與整合素介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在結(jié)腸癌、胰腺癌和乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞的致癌過程中發(fā)揮重要作用[25]。OPN 的表達(dá)水平與HCC 臨床病理特點密切相關(guān)，如包膜浸潤、血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期。一些針對不同國家的大樣本病例對照研究顯示OPN單獨或聯(lián)合AFP診斷HCC的結(jié)果可能存在地區(qū)差異，需要更多前瞻性研究驗證OPN作為肝癌血清標(biāo)志物的可行性[12]。研究表明HCC 患者中OPN 水平明顯高于肝炎或肝硬化患者，且OPN對病毒性肝炎相關(guān)HCC具有較高診斷價值，因此更適合應(yīng)用于我國肝癌人群[26]。血清OPN 在直徑小于2 cm 及AFP 陰性肝癌患者中顯著升高[27]。另外，OPN可能在預(yù)測肝癌患者預(yù)后方面的優(yōu)勢更突出，其表達(dá)可能與腫瘤包膜的完整性有關(guān)，促進(jìn)肝內(nèi)浸潤、肝外轉(zhuǎn)移及肝癌復(fù)發(fā)，但具體機(jī)制尚未明確[27]。一項大樣本Meta 分析指出OPN 與腫瘤大小、分期呈正相關(guān)，其高水平表達(dá)往往提示預(yù)后不良，總生存時間和無病生存期更短[28]。聯(lián)合血管內(nèi)皮生長因子可作為預(yù)測肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的潛在指標(biāo)[27]。

3.7 分泌型糖蛋白(DKK1) DKK1 是一種分泌型蛋白，能在血清中檢測到，通過結(jié)合細(xì)胞表面受體從而抑制經(jīng)典Wnt信號通路，而這一信號通路是包括肝癌在內(nèi)的大多數(shù)腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制[29]。DKK1 在不同腫瘤組織中存在差異性表達(dá)，尤其在肝癌、肺癌、宮頸癌等腫瘤中表達(dá)顯著[30]。對早期和直徑<2 cm 的小肝癌診斷優(yōu)于AFP，在AFP 陰性肝癌中其診斷的特異性為90%、敏感性為70.4%，與AFP聯(lián)合檢測可將敏感性提高到88%[31]。說明DKK1 可以降低早期肝癌、小肝癌及AFP陰性肝癌的漏診率，同時，較高的特異性對鑒別肝臟良惡性病變幫助很大；利用DKK1進(jìn)行聯(lián)合檢測可以作為AFP的有效補充。

3.8 微循環(huán)RNA (miRNA) 微循環(huán)RNA (miRNA)是一種小型非編碼RNA，以外泌體、蛋白結(jié)合微粒和凋亡小體的方式存在人體體液循環(huán)中，其主要功能是降解目的基因的mRNA，從而調(diào)控靶向基因的表達(dá)，在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中存在多種miRNA 的異常表達(dá)。已知文獻(xiàn)報道中，與肝癌有關(guān)的異常表達(dá)的miRNAs 就有200 余種，其中miR-1、miR-16、let-7f、miR-21、miR-24-3p、miR-122、miR-139、miR-215、miR-221、miR-222這10種miRNA可以作為肝癌早期診斷的生物標(biāo)志物，以miR21與miR-122的潛能最大[32]。研究表明miR-122表達(dá)降低可導(dǎo)致肝纖維化失代償，增加肝癌發(fā)生風(fēng)險，其表達(dá)變化與乙型肝炎病毒DNA水平顯著相關(guān)，提示miR-122不僅有利于我國肝癌的早期診斷也可以作為肝癌治療的有效靶點[33]。有文獻(xiàn)指出miRNA 在血液中不容易被內(nèi)源性RNA 酶降解，能穩(wěn)定存在于血液中[34]，這一特性表明miRNA具有成為生物標(biāo)記物可能，且miRNA 獲取方便，幾乎可以在人體所有體液(唾液、尿液、血液等)中分離得到，患者接受度高[33]。但是miRNA調(diào)控基因表達(dá)上復(fù)雜多樣，一種miRNA參與多種基因的表達(dá)，每一種目的基因的表達(dá)又受到一種或多種miRNA的靶向調(diào)控，其交叉調(diào)控機(jī)制使得尋找與肝癌相關(guān)的特異性miRNA 極具挑戰(zhàn)。目前miRNA 與肝癌作用關(guān)系及機(jī)制尚未完全闡明，聯(lián)合多種miRNA 能增加肝癌診斷能力，但需要選擇合適的組合，仍需大量研究數(shù)據(jù)。

4 結(jié)語

綜上所述，血清學(xué)標(biāo)志物檢測費用相對低廉，便于篩查及重復(fù)檢測，尋找能夠替代或有效補充AFP早期診斷原發(fā)性肝癌的血清學(xué)標(biāo)志物仍是目前研究主流。但仍存在這些問題：(1)未新發(fā)現(xiàn)可單獨用于篩查PHC 的血清學(xué)標(biāo)志物，需依賴多項標(biāo)志物聯(lián)合檢測，但究竟怎樣的組合作為篩查指標(biāo)仍沒有定論；(2)目前我國的研究多是小樣本、單中心的研究，缺乏更多的數(shù)據(jù)支持及臨床驗證；(3)一些標(biāo)志物存在特定的檢測閾值，而不同的檢測試劑和方法對檢測結(jié)果存在偏倚；(4)由于國家在肝炎防治上的有效舉措，現(xiàn)階段我國病毒性肝炎發(fā)病率逐年下降，但肝癌發(fā)生的危險因素越來越多，需要更多基礎(chǔ)研究指導(dǎo)臨床標(biāo)志物的選擇。除血清學(xué)標(biāo)志物外，我國在免疫組化、miRNA 方面的研究也逐步深入并取得有效成果，相信隨著蛋白組學(xué)、基因組學(xué)、分子病理流行病學(xué)及信息工程等的發(fā)展，更加經(jīng)濟(jì)、方便且準(zhǔn)確性高的篩查方案能更早應(yīng)用于臨床。