張曉萌，秦鳴蔚，趙新月，宋玉竹，張金陽，夏雪山，韓芹芹

(昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明，650500)

根據(jù)鵝膏肽類毒素氨基酸的組成和結(jié)構(gòu),鵝膏肽類毒素可分為鵝膏毒肽、鬼筆毒肽和毒傘素3類，其中鵝膏毒肽是一類雙環(huán)八肽。鵝膏毒肽化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，耐高溫、耐干燥和酸堿，一般的烹調(diào)加工不會(huì)破壞其毒性，該類毒素易溶于甲醇、乙醇和水，分子質(zhì)量在973～990 Da[1]。根據(jù)側(cè)鏈取代基團(tuán)不同鵝膏毒肽又可以分為α-amanitin、β-amanitin、γ-amanitin、∑-amanitin等，其半致死量分別為0.3、0.5、0.2和0.3 mg/kg。據(jù)報(bào)道，每年世界各地都有成千上萬的蘑菇中毒事件發(fā)生[2-6]，蘑菇中毒引起的死亡90%是由含鵝膏毒肽毒素的蘑菇導(dǎo)致[7]。當(dāng)人們誤食含有鵝膏毒肽的毒蘑菇時(shí)，會(huì)產(chǎn)生劇烈惡心、嘔吐、腹痛或腹瀉等情況，嚴(yán)重則會(huì)引起多器官衰竭進(jìn)而導(dǎo)致死亡[8-11]。研究表明，雖然現(xiàn)有多種針對(duì)鵝膏毒肽的檢測(cè)技術(shù)，但是這些檢測(cè)技術(shù)都存在一些弊端，如成本高、耗時(shí)長(zhǎng)、需要專業(yè)的檢測(cè)儀器和檢測(cè)人員等。不同的檢測(cè)技術(shù)對(duì)蘑菇樣品前處理方式需求也不同，更重要的鵝膏毒肽在血漿和尿液中代謝較快，濃度較低，故很多能夠快速檢測(cè)蘑菇樣品中鵝膏毒肽的技術(shù)都無法運(yùn)用到臨床患者尿液和血液的快速檢測(cè)[12]。所以，建立快速檢測(cè)蘑菇、尿液和血漿中鵝膏毒肽的方法就顯得尤為重要。本文分別就現(xiàn)有的快速檢測(cè)蘑菇樣本中鵝膏毒肽和快速檢測(cè)血漿和尿液中鵝膏毒肽的技術(shù)進(jìn)行闡述和分析。

1 蘑菇樣本中鵝膏毒肽的快速檢測(cè)

1.1 超分支滾環(huán)擴(kuò)增(hyper-branched rolling circle amplification, HRCA)技術(shù)

與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)嚴(yán)格的程序升溫不同，HRCA技術(shù)是一種可以在恒溫條件下指數(shù)擴(kuò)增核酸信號(hào)的放大技術(shù)[13-14]，具有較高的擴(kuò)增效率和靈敏度[15]?，F(xiàn)已開發(fā)出許多基于HRCA技術(shù)的傳感器，用于超靈敏性檢測(cè)核酸。HE等[16]設(shè)計(jì)出一種針對(duì)鵝膏菌中α-amanitin基因序列的鎖式探針，并基于HRCA技術(shù)建立檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)中加入SYBR Green I為指示劑，雙鏈DNA與指示劑結(jié)合后增強(qiáng)熒光強(qiáng)度，可直接讀取實(shí)驗(yàn)結(jié)果，無需瓊脂糖凝膠電泳。此方法的檢測(cè)限為100 copies/μL，是普通PCR方法的100倍，檢測(cè)結(jié)果可在3 h內(nèi)獲得，同時(shí)也可用于蘑菇混合物中鵝膏毒肽的檢測(cè)。該傳感器提供了一種靈敏、快速的鵝膏毒肽檢測(cè)方法，避免了農(nóng)村地區(qū)無法使用昂貴儀器的限制。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)

ELISA是實(shí)驗(yàn)室目前最為常用的檢測(cè)方法，這種方法主要是以抗原和抗體的特異性免疫結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，在特定標(biāo)記物如同位素、酶、熒光基團(tuán)等的配合下將免疫反應(yīng)擴(kuò)大，用于對(duì)特定靶標(biāo)的檢測(cè)。酶聯(lián)免疫反應(yīng)相比其他檢測(cè)方法具有特異性高、操作簡(jiǎn)單、不需要特定儀器等優(yōu)點(diǎn)。

HE等[17]研究并制備出一種單克隆抗體，并利用其建立了一種利用間接競(jìng)爭(zhēng)性免疫反應(yīng)檢測(cè)蘑菇樣品中鵝膏毒肽的方法。在整個(gè)免疫反應(yīng)中以α-amanitin與牛血清蛋白的偶聯(lián)物(α-amanitin-OVA) 作為包被抗原，以鵝膏毒素作為競(jìng)爭(zhēng)抗原，初步建立了檢測(cè)蘑菇中鵝膏毒肽的間接ELISA。對(duì)蘑菇樣品中鵝膏毒肽進(jìn)行檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，此方法對(duì)蘑菇樣品中α-amanitin、β-amanitin、γ-amanitin的檢測(cè)限分別為4.55、4.9和4.45 ng/mL。在此基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜法對(duì)該蘑菇樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明2種方法之間具有較好的一致性。

BEVER等[18]開發(fā)了一種能同時(shí)檢測(cè)α-amanitin、β-amanitin和γ-amanitin的檢測(cè)技術(shù)，且檢測(cè)的同時(shí)不會(huì)與結(jié)構(gòu)類似物發(fā)生交叉反應(yīng)。低分子量的鵝膏毒肽本身不具有免疫原性，不能發(fā)生免疫反應(yīng)，但前期研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)鵝膏毒肽與大分子物質(zhì)如載體蛋白結(jié)合后，其結(jié)合物具備免疫原性?？衫?種不同的化學(xué)連接物質(zhì)構(gòu)建帶有不同免疫原性的鵝膏毒肽與載體蛋白的偶聯(lián)物，以達(dá)到產(chǎn)生與鵝膏毒肽結(jié)合的抗體目的，最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,只有2種方式成功產(chǎn)生了結(jié)合游離鵝膏毒肽的抗體，其中一種是利用高碘酸鹽氧化這一新的連接方式，利用抗體建立競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫反應(yīng)，檢測(cè)限為1.0 μg/mL。由于利用單克隆抗體的ELISA更適用于檢測(cè)試劑盒，BEVER等[19]又制備出新的單克隆抗體(mAbs, AMA9G3和AMA9C12)。與多克隆抗體不同，單克隆抗體具有持久性和一致性[20]，從而克服了用于鵝膏毒肽檢測(cè)的商用多克隆抗體(pAb)供應(yīng)有限、不同批次有差別的難題，利用這一新的單克隆抗體建立的快速檢測(cè)鵝膏毒肽的ELISA，檢測(cè)限可以達(dá)到1 ng/mL。同時(shí)在檢測(cè)蘑菇樣品時(shí),前處理方法簡(jiǎn)單，以鵝膏菌為樣本，采用水等簡(jiǎn)單溶劑快速(1 min)提取鵝膏毒肽，大大縮短和簡(jiǎn)化了檢測(cè)的時(shí)間和流程。

綜上所述，ELISA具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，適用于蘑菇樣品中鵝膏毒肽的檢測(cè)，根據(jù)ELISA原理開發(fā)的試劑盒將會(huì)大大縮短檢測(cè)時(shí)間，改善基層難以檢測(cè)的問題[21]。但是ELISA是一種利用抗原與抗體特異性結(jié)合的酶聯(lián)免疫反應(yīng)，在檢測(cè)前期需要購買或制備能與抗原特異性結(jié)合的抗體，故該方法存在費(fèi)用高、制備抗體耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)。更重要的是雖然有許多ELISA試劑盒在市場(chǎng)上得到應(yīng)用，但是大多數(shù)在評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)、有效樣品預(yù)處理的高交叉反應(yīng)性等方面受到限制，因此限制了其實(shí)際應(yīng)用，也不適用于檢測(cè)血漿和尿液中的鵝膏毒肽。

1.3 側(cè)流免疫層析法(lateral flow immunoassay, LFIA)

相比ELISA， LFIA具有使用簡(jiǎn)單、成本低廉和檢測(cè)快速等優(yōu)點(diǎn)。LFIA是一種快速診斷方法，且適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，現(xiàn)已用于生物及食物安全檢測(cè)中[22]。雖然ELISA是實(shí)驗(yàn)室常用的檢測(cè)技術(shù)，但是需要借助專業(yè)的試劑和設(shè)備，耗時(shí)也較長(zhǎng)。如果將ELISA中使用的免疫試劑轉(zhuǎn)移到LFIA中將會(huì)解決以上問題。LFIA又被稱為橫向流動(dòng)免疫檢測(cè)技術(shù)[23]，是以條狀纖維層析材料為固相，利用纖維層析材料上毛細(xì)管的吸附作用使滴在材料上的樣品向前移動(dòng)，最終通過顯色反應(yīng)達(dá)到檢測(cè)樣品中是否存在待檢物的技術(shù)。在LFIA中，免疫反應(yīng)的發(fā)生可以基于抗原、抗體的特異性結(jié)合或核酸適配體和靶標(biāo)的特異性結(jié)合。近年來，一些與核酸適配體有關(guān)的腫瘤治療技術(shù)已經(jīng)在臨床上得到應(yīng)用[24]，核酸適配體的出現(xiàn)也使診斷研究發(fā)生了一定轉(zhuǎn)變，相較于抗體，核酸適配體對(duì)于側(cè)流免疫檢測(cè)平臺(tái)具有更好的無免疫原性及可標(biāo)記適用性[25]。傳統(tǒng)的LFIA主要分為雙抗夾心層析法和競(jìng)爭(zhēng)免疫層析法。根據(jù)LFIA原理開發(fā)的免疫試紙條主要是由樣品墊、結(jié)合墊、吸水墊和硝酸維生素膜等構(gòu)成，適用于大批量樣本的定性實(shí)驗(yàn)[26]。

針對(duì)常規(guī)檢測(cè)鵝膏毒肽的方法設(shè)備昂貴或步驟繁瑣等弊端，BEVER等在上述酶聯(lián)免疫吸附法基礎(chǔ)上開發(fā)了一種競(jìng)爭(zhēng)免疫層析法，他們將制備的單克隆抗體mAbs運(yùn)用到LFIA上，通過實(shí)驗(yàn)確定LFIA檢測(cè)的特異性和靈敏性。檢測(cè)可在10 min內(nèi)完成，檢測(cè)結(jié)果可直接讀取，其方法對(duì)α-amanitin和γ-amanitin的檢測(cè)限都可以達(dá)到10 ng/mL。利用該LFIA對(duì)野生蘑菇進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果與液相色譜結(jié)果一致性較好[27]。該方法實(shí)現(xiàn)了快速、便捷、靈敏檢測(cè)蘑菇樣本中鵝膏毒肽的目的，在一定程度上解決了ELISA抗體制備耗時(shí)長(zhǎng)、需要儀器測(cè)定和不適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等缺點(diǎn)，可用于大批量樣品中鵝膏毒肽的快速檢測(cè)[28]。

2 血漿和尿液中鵝膏毒肽的快速檢測(cè)

由于鵝膏毒肽在血漿和尿液中代謝較快、濃度較低，因此常規(guī)檢測(cè)蘑菇樣本中鵝膏毒肽的方法(如ELFIA、紫外-可見光吸收光譜技術(shù)等)都無法運(yùn)用到檢測(cè)血漿和尿液上。含有鵝膏肽類毒素蘑菇中毒病例具有較長(zhǎng)的潛伏期(6～24 h)，大多數(shù)病例的潛伏期為十幾個(gè)小時(shí)[29]。因此一種能夠適用于臨床的快速檢測(cè)鵝膏毒肽的檢測(cè)方法就顯得尤為重要。

2.1 高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)

GARCIA等[30]建立一種聯(lián)用二極管陣列和電化學(xué)檢測(cè)的HPLC技術(shù)。單一的HPLC技術(shù)限制了檢測(cè)鵝膏毒肽時(shí)的靈敏度，二極管陣列和電化學(xué)檢測(cè)法的聯(lián)用將會(huì)大大提高檢測(cè)范圍和準(zhǔn)確度。分別利用聯(lián)用二極管陣列檢測(cè)的HPLC和聯(lián)用電化學(xué)檢測(cè)法的HPLC技術(shù)對(duì)大鼠生物樣品(肝臟、腎臟)進(jìn)行鵝膏毒肽檢測(cè)，色譜檢測(cè)運(yùn)行時(shí)間在22 min內(nèi)，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),聯(lián)用電化學(xué)檢測(cè)法時(shí)檢測(cè)限更低，可達(dá)0.040 μg/mL。此外，研究還驗(yàn)證了此方法可用于人體血漿中鵝膏毒肽的檢測(cè)。

2.2 液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)

MAURER等[31]將LC-MS運(yùn)用到人類尿液樣本中鵝膏毒肽的檢測(cè)，因LC-MS檢測(cè)方法具有靈敏度高、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，LC-MS技術(shù)已在血漿和尿液樣本檢測(cè)中得到普遍使用。眾所周知，如果將色譜與質(zhì)譜聯(lián)用，被測(cè)樣品首先被色譜技術(shù)分離純化，純化后的樣品進(jìn)入質(zhì)譜系統(tǒng)，故二者聯(lián)用后會(huì)將色譜和質(zhì)譜的優(yōu)勢(shì)進(jìn)行互補(bǔ)，同時(shí)也會(huì)大大節(jié)省檢測(cè)時(shí)間。研究發(fā)現(xiàn)，不同的LC方法和MS方法組合會(huì)對(duì)檢測(cè)方法靈敏度的提高產(chǎn)生影響，現(xiàn)有更多的鵝膏毒肽檢測(cè)手段是在LC-MS檢測(cè)技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展而來的[32]。

2.2.1 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS)

UPLC-MS/MS可同時(shí)測(cè)定尿液或血漿中的6種毒肽(α-amanitin、β-amanitin、γ-amanitin、phallisacin、phalloidin和phallacidin)[33]。該檢測(cè)方法的線性范圍為0.2～20 ng/mL，這6種毒肽的檢出限均低于0.06 ng/mL，在血漿和尿液基質(zhì)中的加標(biāo)回收率在79.6%～104.8%。

2.2.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)

LC/MS技術(shù)雖然能夠高靈敏度、快速并定量地檢測(cè)鵝膏毒肽,但是存在一個(gè)明顯弊端,在定量分析時(shí)受待測(cè)樣品基質(zhì)中所含的鹽或其他共洗脫化合物影響較大，故該技術(shù)對(duì)樣品的制備要求較高。樣品制備優(yōu)化和調(diào)試色譜條件可減小基質(zhì)影響，但是最有效的手段是將一個(gè)同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)引入到實(shí)驗(yàn)中，然而內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的選擇也是檢測(cè)結(jié)果能否準(zhǔn)確的關(guān)鍵。ABBOTT等[34]首次將同位素標(biāo)記的15N10-α-amanitin，作為定量檢測(cè)尿液中鵝膏毒肽的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對(duì)尿液中α-amanitin、β-amanitin、γ-amanitin的定量檢測(cè)，三者檢測(cè)限分別為0.458/0.930和0.169 ng/mL。

2.2.3 高效液相色譜/三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用法(high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry, HPLC-MS/MS)

魏佳會(huì)等[12]建立了一種利用HPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定血漿和尿液中3類重要鵝膏毒肽類(α-amanitin、β-amanitin、phalloidin)、丙氨酸羥毒傘肽及二羥毒散肽等毒素的方法。此方法不僅可用于檢測(cè)蘑菇樣品中的鵝膏毒肽，也可用于檢測(cè)患者血液和尿液中的鵝膏毒肽，檢測(cè)時(shí)間為10 min左右。該方法對(duì)α-amanitin和β-amanitin在血漿和尿液中的檢測(cè)限均為0.5 μg/mL，線性范圍均為5～500 μg/mL，對(duì)二羥鬼筆環(huán)肽、丙氨酸羥毒傘肽及二羥毒散肽在血漿和尿液中的檢測(cè)限為0.2 μg/mL。該方法具有樣品需要量少、檢測(cè)速度快、靈敏度高、回收率高等特點(diǎn)，可大大改善血液和尿液中毒素基質(zhì)效應(yīng)大、檢測(cè)限高的問題。

雖然色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)血漿和尿液樣本中鵝膏毒肽表現(xiàn)出諸多優(yōu)勢(shì)，但是依然需要借助于昂貴的設(shè)備和專業(yè)的技術(shù)人員，檢測(cè)成本較高，無法在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中應(yīng)用。

2.3 分子印跡技術(shù)(molecular imprinting technique, MIT)

大多數(shù)免疫反應(yīng)是基于抗原與抗體特異性結(jié)合產(chǎn)生的，與抗原-抗體特異性結(jié)合有著相似的性質(zhì)[35]，MIT是制備能與目標(biāo)分子在特定結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的聚合物，該聚合物被稱為分子印跡聚合物(molecular imprinted polymer, MIP)，它有著特定的空間結(jié)構(gòu)和特異性識(shí)別能力。MIT具有高特異性、高穩(wěn)定性和高預(yù)定性，現(xiàn)已廣泛用于化學(xué)仿生傳感器[36]，實(shí)現(xiàn)了定量分析各種小分子有機(jī)化合物的目的，在食品安全檢測(cè)中有著重要應(yīng)用[37]?，F(xiàn)介紹2種基于MIT建立的檢測(cè)血漿和尿液中鵝膏毒肽的化學(xué)傳感器。

2.3.1 分子印跡熒光傳感器

FENG等[38]將MIP的特異選擇性和碳量子點(diǎn)(carbon quantum dots, CDs)識(shí)別放大光學(xué)信號(hào)的優(yōu)勢(shì)結(jié)合，設(shè)計(jì)MIP-CDs熒光傳感器。在380 nm激發(fā)波長(zhǎng)條件下進(jìn)行熒光測(cè)量，通過MIP-CDs發(fā)射強(qiáng)度的變化檢測(cè)血清中的鵝膏毒肽，其中MIP-CDs新型傳感器的最佳響應(yīng)時(shí)間為20 min，α-amanitin的檢測(cè)限為15 ng/mL，在0.05～4.0 μg/mL范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度和α-amanitin濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，樣本回收率為97.8%～100.9%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該傳感器具有較高的靈敏度和選擇性，更重要的是樣本無需經(jīng)過任何預(yù)處理，即可達(dá)到快速檢測(cè)血清中鵝膏毒肽的目的。

2.3.2 分子印跡光子晶體(molecularly imprinted photonic crystal, MIPC)傳感器

QIU等[39]利用具有可見顏色的光子晶體完成傳感器中信號(hào)轉(zhuǎn)換工作，制備MIPC傳感器。該傳感器可用于實(shí)際樣本(蘑菇、尿液和血清)中鵝膏毒肽的檢測(cè)，檢測(cè)限為5.0×10-10mg/L，線性范圍為10-9～10-3mg/L，僅需要2 min的響應(yīng)時(shí)間，實(shí)際樣本的檢測(cè)結(jié)果會(huì)出現(xiàn)明顯的衍射峰紅移和顏色變化。

基于MIT建立的傳感器在一定程度上改善了LC-MS中樣品前處理程序繁雜的問題，簡(jiǎn)化了實(shí)際樣本的檢測(cè)步驟。

2.4 免疫層析試紙條

BEVER等[40]根據(jù)LFIA開發(fā)的免疫試紙條，檢測(cè)人類和狗的尿液中的鵝膏毒肽，α-amanitin和γ-amanitin檢測(cè)限可達(dá)10 ng/mL，β-amanitin的檢測(cè)限可達(dá)100 ng/mL，檢測(cè)結(jié)果可直接由肉眼讀取，檢測(cè)時(shí)間為10 min。這證明了LFIA不僅可用于蘑菇樣本中鵝膏毒肽的檢測(cè)，也可用于尿液中鵝膏毒肽的快速檢測(cè)。

3 結(jié)語

鵝膏毒肽作為一種具有劇毒性質(zhì)的物質(zhì)，為監(jiān)管其在食品領(lǐng)域的安全，越來越多鵝膏毒肽的檢測(cè)方法被研究報(bào)道。由于蘑菇樣本、血漿和尿液等的特殊性，許多檢測(cè)方法無法應(yīng)用，鵝膏毒肽的快速檢測(cè)方法還面臨著一定的困難。HRCA和MIT為我們建立新方法開拓了思路，在一定程度上解決了某些地區(qū)無法使用昂貴儀器的問題。但是，這2種技術(shù)仍需要專業(yè)的技術(shù)人員和技術(shù)操作，很難實(shí)現(xiàn)檢測(cè)技術(shù)的廣泛使用。近年來，ELISA檢測(cè)蘑菇樣本中的鵝膏毒肽越來越普遍，此方法具有操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，同時(shí)為之后商業(yè)化鵝膏毒肽檢測(cè)試劑盒的生產(chǎn)提供了技術(shù)支持，但ELISA的穩(wěn)定性還需要進(jìn)一步提高。雖然現(xiàn)在用于人體血漿和尿液樣本中鵝膏毒肽的快速檢測(cè)方法還多為色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法，受到昂貴實(shí)驗(yàn)儀器、設(shè)備和專業(yè)技術(shù)水平的限制。但是隨著簡(jiǎn)便、快速、適用于大量樣本的LFIA不斷發(fā)展，會(huì)為臨床建立更加便捷的、適用于現(xiàn)場(chǎng)的鵝膏毒肽檢測(cè)方法提供重要的技術(shù)手段。