馬斐越，王清爽，周繁樹(shù)，張曉，王一東

（長(zhǎng)春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130022）

羊肚菌（Morchella）是一種以美味、富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而著稱(chēng)于世的珍稀食用菌，屬于子囊菌亞門(mén)（Ascomycotina）、盤(pán)菌綱（Discomycetes）、盤(pán)菌目（Pezizales）、羊肚菌科（Morchellaceae）、羊肚菌屬（Morchella），具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值［1-2］。由于人們對(duì)于羊肚菌的生活史還不完全了解，目前的人工仿生栽培還存在較大的技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。所以對(duì)包括羊肚菌子實(shí)體組織細(xì)胞菌絲在內(nèi)的羊肚菌各發(fā)育階段菌絲的發(fā)生機(jī)制、發(fā)育規(guī)律等羊肚菌生活史相關(guān)的基礎(chǔ)研究就顯得尤為必要［3-6］。通過(guò)對(duì)采集的野生新鮮羊肚菌子實(shí)體進(jìn)行無(wú)菌及破碎處理后，對(duì)組織細(xì)胞超低溫冷凍保存，利用冷凍細(xì)胞復(fù)蘇原理及有限稀釋法，對(duì)復(fù)蘇的羊肚菌組織細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇后在細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)4℃下培養(yǎng)，倒置顯微鏡，其下觀(guān)察細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)組織細(xì)胞萌發(fā)情況，對(duì)非孢子萌發(fā)的、無(wú)污染的、具有典型羊肚菌菌絲形態(tài)的組織細(xì)胞萌發(fā)菌絲進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行ELISA方法及18 s保守序列測(cè)序鑒定［7-11］，進(jìn)而確定得到的子實(shí)體組織細(xì)胞萌發(fā)并分離的菌絲（菌種）為羊肚菌菌絲。該研究可為羊肚菌菌絲發(fā)育機(jī)理等基礎(chǔ)研究及人工栽培實(shí)踐提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株、羊肚菌子實(shí)體

羊肚菌（Morehella esculenta）標(biāo)準(zhǔn)菌株（51589號(hào)）購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心。

黑木耳（Auricularia auricula）菌種（栽培種），購(gòu)于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物研究所。

野生羊肚菌子實(shí)體，于2017年5月采自于長(zhǎng)春市凈月潭國(guó)家森林公園，處理后的子實(shí)體組織細(xì)胞現(xiàn)保存于-80℃低溫冰柜。

1.1.2 主要試劑與耗材

HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG（H+L）購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司；TMB，購(gòu)于sigma公司；馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）；菌絲萌發(fā)液（葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、水1 000 mL，121 ℃ 20 min）；二甲基亞砜（DMSO），北化產(chǎn)品；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

抗羊肚菌單抗C6A8雜交瘤細(xì)胞株現(xiàn)保存于該實(shí)驗(yàn)室-80℃冷凍冰箱內(nèi)?？寡蚨蔷鷨慰寺】贵w為C6A8細(xì)胞株腹水抗體［8］。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

1736R SCANSPEED高速離心機(jī)，Lrbogene公司；XD30型倒置顯微鏡（附攝影裝置及軟件），寧波舜宇公司；HZQ-QX型恒溫振蕩培養(yǎng)箱；DW-86L626型超低溫保存箱，青島海爾特種電器有限公司；ELx800TM酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；96孔、24孔一次性動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)板，1.8 ml內(nèi)旋細(xì)胞凍存管，Corning公司等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 羊肚菌子實(shí)體樣本的采集與處理

羊肚菌子實(shí)體于2017年5月10日至15日采集于吉林省長(zhǎng)春市凈月潭國(guó)家森林公園，共采集到羊肚菌標(biāo)本10份，用滅菌紙包裹放入盛有冰袋的保溫盒，迅速送至實(shí)驗(yàn)室，在超凈臺(tái)內(nèi)將羊肚菌子實(shí)體表面泥土等雜物去除后置于無(wú)菌平皿中，用無(wú)菌生理鹽水沖洗子實(shí)體表面2-3次并用無(wú)菌棉球吸干殘留水分。

1.2.2 羊肚菌子實(shí)體組織細(xì)胞懸液的制備與凍存

在超凈臺(tái)內(nèi)，將處理過(guò)的子實(shí)體按菌蓋、菌柄分離，放入無(wú)菌研缽中加少量無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行研磨破碎（可加入適量無(wú)菌海沙助研），取樣于100×下鏡檢研磨的組織懸液，可見(jiàn)大量單個(gè)小段菌絲及少量組織碎塊后終止研磨，將研磨液及生理鹽水清洗研缽液體移入15 mL離心管，400 rpm離心5 min，將上清移入新的無(wú)菌15 mL離心管，3 000 rpm離心10 min后棄上清，將沉淀用細(xì)胞凍存液（90%無(wú)菌菌絲萌發(fā)液+10%DMSO混合液）懸浮，分裝于1.8 mL凍存管，每管1 mL，標(biāo)記名稱(chēng)、日期。將凍存管放入壁厚1.5 cm的泡沫保溫盒中并將保溫盒用膠帶封口，將保溫盒放入-80℃冰箱中，凍存管內(nèi)的組織細(xì)胞將緩慢降溫至-80℃。

1.2.3 凍存羊肚菌子實(shí)體組織液的復(fù)蘇與菌絲細(xì)胞的分離培養(yǎng)

凍存6個(gè)月后，將上述凍存管從-80℃冰箱中取出，迅速置于37℃水浴，在凍存管內(nèi)冰凍固體即將完全融化時(shí)取出至室溫下完全解凍，超凈工作臺(tái)內(nèi)將凍存管內(nèi)組織細(xì)胞液轉(zhuǎn)入15 mL無(wú)菌離心管，滴加生理鹽水至10 mL，旋緊離心管蓋，2 000 rpm離心5 min，棄上清，用生理鹽水重懸，重復(fù)兩次生理鹽水洗滌離心后將沉淀用菌絲萌發(fā)液懸浮，轉(zhuǎn)移至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，倒置顯微鏡下觀(guān)察，估算組織細(xì)胞的密度。用菌絲萌發(fā)液將組織細(xì)胞懸液稀釋至約10個(gè)/mL的終濃度，滴加96孔培養(yǎng)板，每孔2滴（約100 μL）。

1.2.4 4℃菌絲培養(yǎng)觀(guān)察與篩選及擴(kuò)大培養(yǎng)

利用羊肚菌菌絲的低溫生長(zhǎng)的特性，將細(xì)胞板邊緣封口后放入4℃冰箱避光培養(yǎng)。每日鏡檢，觀(guān)察孔內(nèi)菌絲生長(zhǎng)情況并拍照記錄，觀(guān)察是否有雜菌生長(zhǎng)。應(yīng)注意觀(guān)察盡量快速，防止室溫高（20℃）菌絲萌發(fā)生長(zhǎng)過(guò)快對(duì)觀(guān)察的不利影響。

在大量觀(guān)察及比對(duì)分析后，選取96孔板內(nèi)非孢子萌發(fā)、無(wú)雜菌、符合羊肚菌菌絲形態(tài)的培養(yǎng)孔內(nèi)萌發(fā)生長(zhǎng)的菌絲，吸取并移至PDA固體培養(yǎng)基上，室溫條件下避光培養(yǎng)。菌落萌發(fā)后，無(wú)菌挑取疑似羊肚菌菌落接種至PDB液體培養(yǎng)基，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中20℃，轉(zhuǎn)速110 rpm搖瓶培養(yǎng)。

1.2.5 分離菌絲的ELISA間接法鑒定

利用該實(shí)驗(yàn)室的便利條件［12］，對(duì)分離并擴(kuò)大培養(yǎng)的菌絲進(jìn)行ELISA間接法檢測(cè)。

1.2.6 分離菌絲的分子生物學(xué)鑒定

將分離并擴(kuò)大培養(yǎng)得到的球狀菌絲培養(yǎng)物送測(cè)序技術(shù)公司（華大公司）進(jìn)行18 s基因測(cè)序比對(duì)，鑒定菌絲種屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊肚菌子實(shí)體組織細(xì)胞菌絲萌發(fā)觀(guān)察結(jié)果

分別于2017年11月，2018年1月、3-5月，對(duì)2017年5月凍存的羊肚菌子實(shí)體組織細(xì)胞進(jìn)行了五個(gè)批次復(fù)蘇，復(fù)蘇情況重復(fù)性良好。通過(guò)跟蹤觀(guān)察及比對(duì)拍攝的大量照片，凍存后子實(shí)體組織細(xì)胞復(fù)蘇萌發(fā)過(guò)程中可觀(guān)察到幾種現(xiàn)象：（1）與菌蓋組織細(xì)胞相比，絲狀菌柄細(xì)胞不易萌發(fā)；（2）4℃條件下培養(yǎng)5天左右，部分組織團(tuán)塊開(kāi)始有菌絲萌發(fā)，20天左右在培養(yǎng)孔內(nèi)形成肉眼可見(jiàn)的白色疑似羊肚菌菌絲團(tuán)；（3）4℃條件下子囊孢子不易萌發(fā)；（4）在觀(guān)察孔各培養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中，10天左右在部分孔內(nèi)觀(guān)察到與羊肚菌菌絲形態(tài)不同的雜菌。

（1）菌柄組織分離結(jié)果

圖1為觀(guān)察低倍稀釋?zhuān)?4孔培養(yǎng)板）的菌柄組織細(xì)胞，可以看出經(jīng)過(guò)20天的培養(yǎng)沒(méi)有出現(xiàn)萌發(fā)的菌絲，懷疑這可能與菌柄組織特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)有關(guān)，菌柄中含有大量的膨大狀菌絲，膨大菌絲沒(méi)有利用孢子萌發(fā)液的營(yíng)養(yǎng)而萌發(fā)生長(zhǎng)。

圖1 4℃條件下接種在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板20 d羊肚菌子實(shí)體菌柄組織細(xì)胞情況

（2）羊肚菌菌蓋組織細(xì)胞萌發(fā)、生長(zhǎng)情況

由圖2可看出，該菌絲明顯是從一個(gè)羊肚菌組織塊細(xì)胞團(tuán)中萌發(fā)生長(zhǎng)的，組織細(xì)胞團(tuán)中未見(jiàn)明顯的孢子囊及孢子；萌發(fā)菌絲由薄而透明的管狀壁構(gòu)成，內(nèi)含許多內(nèi)容物，菌絲直徑約8 μm，是呈竹節(jié)狀的有隔菌絲，菌絲有分枝，并且能夠相互融合形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，將該菌絲擴(kuò)大培養(yǎng)的菌落編號(hào)為M10H3。

由圖3可看出，羊肚菌子囊呈長(zhǎng)圓柱形，無(wú)色透明，子囊內(nèi)有有子囊孢子，單行排列，子囊孢子橢圓形，近無(wú)色，圖中箭頭所示的萌發(fā)菌絲是從貼近子囊結(jié)構(gòu)的組織細(xì)胞萌發(fā)而不是孢子萌發(fā)，萌發(fā)的菌絲在萌發(fā)初期沒(méi)有出現(xiàn)分支現(xiàn)象，其形態(tài)與圖3所示菌絲基本一致。將該菌絲擴(kuò)大培養(yǎng)的菌落編號(hào)為M10H4。在圖3中可以比較明顯的觀(guān)察出子囊及子囊孢子，可以觀(guān)察到孢子沒(méi)有萌發(fā)，分析與比對(duì)實(shí)驗(yàn)可以確定這種現(xiàn)象與4℃條件下培養(yǎng)有關(guān)。

圖2 4℃條件下羊肚菌子實(shí)體同一組織細(xì)胞團(tuán)不同萌發(fā)時(shí)間下菌絲萌發(fā)生長(zhǎng)過(guò)程

圖3 孢子囊結(jié)構(gòu)處萌發(fā)的菌絲生長(zhǎng)的過(guò)程

在培養(yǎng)過(guò)程中還觀(guān)察到一些培養(yǎng)孔中菌絲形態(tài)特征與羊肚菌菌絲完全不同的雜菌，部分雜菌培養(yǎng)后期在培養(yǎng)孔內(nèi)形成青色菌絲團(tuán)，疑似霉菌污染，對(duì)疑似雜菌污染的培養(yǎng)孔標(biāo)記并廢棄。

2.2 分離菌絲擴(kuò)大培養(yǎng)結(jié)果

將編號(hào)M10H3、M10H4的菌絲接種PDA培養(yǎng)基后，分別于3 d、5 d后形成菌落。菌絲生長(zhǎng)初期呈乳白色，貼在培養(yǎng)基表面呈圓形生長(zhǎng)，有光澤，尖端分泌無(wú)色露珠，生長(zhǎng)至菌落半徑約1 cm時(shí)出現(xiàn)氣生菌絲，氣生菌絲生長(zhǎng)初期呈乳白色。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌絲顏色逐漸向棕紅色轉(zhuǎn)變，由于色素沉積，培養(yǎng)基顏色也逐漸加深向棕黃色轉(zhuǎn)變。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加出現(xiàn)菌核，菌核初期為分散的點(diǎn)狀白色小菌核，隨后變成淡黃色，后期變?yōu)楹稚?。與文獻(xiàn)記載［11］的羊肚菌菌落特征相符。

挑取上述菌絲接種PDB液體培養(yǎng)基，置搖床培養(yǎng)，3 d后形成菌絲球，初期為乳白色，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)液逐漸變得澄清透明，菌絲球體積增大，顏色變淡棕褐色。

2.3 ELISA間接法鑒定分離菌株

以P/N≥2.1判定為陽(yáng)性，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。1孔為編號(hào)M10H3菌絲液樣本、2孔為編號(hào)M10H4菌絲液樣本、3孔為羊肚菌標(biāo)準(zhǔn)菌株51589菌絲液陽(yáng)性樣本、4孔為木耳菌絲液陰性樣本、5孔為包被緩沖液（空白對(duì)照）。進(jìn)行多次檢測(cè)，每次檢測(cè)有4組平行試驗(yàn)。

表1 ELISA間接法檢測(cè)分離菌株結(jié)果

由表1可以看出，以標(biāo)準(zhǔn)羊肚菌抗原（51589號(hào)）為陽(yáng)性對(duì)照，木耳為陰性對(duì)照，包被緩沖液為試劑空白，進(jìn)行了多次的ELISA間接法檢測(cè)。結(jié)果顯示M10H3、M10H4均表現(xiàn)為陽(yáng)性，確定為羊肚菌菌絲。

2.4 分離菌種的測(cè)序鑒定

分離并經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)的菌絲樣本，送基因測(cè)序公司經(jīng)過(guò)對(duì)樣本的18S保守序列的測(cè)序及比對(duì)，給出的鑒定結(jié)果為：樣品與morchella sp.親緣關(guān)系最近。可以確定分離得到的菌絲為羊肚菌菌絲。

3 結(jié)論

（1）該研究對(duì)-80℃低溫保存6個(gè)月以上的新鮮羊肚菌子實(shí)體組織細(xì)胞，分別進(jìn)行了5個(gè)批次的凍存的羊肚菌組織細(xì)胞的復(fù)蘇，所有批次的復(fù)蘇效果良好。說(shuō)明該方法可以較長(zhǎng)時(shí)間的保存羊肚菌組織細(xì)胞并可以隨時(shí)進(jìn)行菌絲萌發(fā)與分離。這為羊肚菌子實(shí)體組織細(xì)胞及其他不同發(fā)育階段的菌絲細(xì)胞等實(shí)驗(yàn)材料的保存提供了借鑒，為羊肚菌生活史的基礎(chǔ)研究帶來(lái)便利。

（2）包括羊肚菌在內(nèi)的食用菌栽培實(shí)踐中，子實(shí)體的菌種分離具有不可替代的重要作用。目前廣泛應(yīng)用的傳統(tǒng)的組織塊平板分離實(shí)體菌種菌絲方法，存在著無(wú)法確定分離得到的萌發(fā)菌絲是由組織細(xì)胞萌發(fā)（次級(jí)菌絲）還是孢子萌發(fā)（初級(jí)菌絲）亦或是多種組織細(xì)胞與孢子萌發(fā)的混合物的缺陷，而本研究介紹的羊肚菌子實(shí)體組織細(xì)胞菌種分離方法具有可以便捷的實(shí)時(shí)觀(guān)察到組織細(xì)胞萌發(fā)與生長(zhǎng)情況、菌絲細(xì)胞來(lái)源明確的特點(diǎn)，避免了傳統(tǒng)方法的缺陷。該方法可為羊肚菌子實(shí)體組織細(xì)胞萌發(fā)菌絲的確定提供直接便捷的方法參考。

（3）羊肚菌子實(shí)體存在著多種形態(tài)的細(xì)胞組織，該研究觀(guān)察到的（如圖4）子囊結(jié)構(gòu)附近的組織細(xì)胞萌發(fā)菌絲與之前觀(guān)察到的孢子萌發(fā)的菌絲（初級(jí)菌絲）在形態(tài)上基本沒(méi)有差異，這是否存在著子實(shí)體組織結(jié)構(gòu)細(xì)胞萌發(fā)菌絲后，其萌發(fā)的菌絲由于其環(huán)境及營(yíng)養(yǎng)方式的改變而使萌發(fā)的菌絲（分離的菌絲）生理結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生了改變，如從羊肚菌生活史中高分化的產(chǎn)囊絲或是側(cè)絲（擬側(cè)絲）再轉(zhuǎn)變?yōu)闋I(yíng)養(yǎng)菌絲，如同自然界中經(jīng)歷了冬季低溫后復(fù)蘇的菌絲或是潛在的出菇點(diǎn)沒(méi)有出菇的生殖菌絲轉(zhuǎn)化為營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的菌絲等問(wèn)題還有待于進(jìn)一步的研究與分析。