畢歡歡，張曉雅，王小敏，劉玉衛(wèi)，鞏校東， 谷守芹，韓建民，董金皋

(1.河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071001；2.泊頭職業(yè)學(xué)院，河北 泊頭 062150)

玉米大斑病(Northern corn leaf blight)是一種常見(jiàn)的玉米葉部病害，在我國(guó)的東北、華北北部以及南方冷涼山區(qū)常有發(fā)生[1]。引起該病害的病原菌為玉米大斑病菌(Setosphaeriaturcica)。該病害直接影響玉米葉片的光合作用從而導(dǎo)致玉米減產(chǎn)，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)可達(dá)50%[2-3]，目前在生產(chǎn)上種植抗病玉米品種是最重要的防控措施，但近年來(lái)由于該病菌變異頻繁，使得抗病玉米品種的抗性頻頻喪失[4]。因此，研發(fā)新型殺真菌制劑已成為目前研究的熱點(diǎn)之一。

研究表明，真菌細(xì)胞壁是由糖蛋白、葡聚糖和幾丁質(zhì)所構(gòu)成，其中幾丁質(zhì)在賦予細(xì)胞壁剛性、物理強(qiáng)度和特定形狀中發(fā)揮重要作用[5-6]。幾丁質(zhì)是由膜蛋白幾丁質(zhì)合成酶通過(guò)催化N-乙酰葡糖胺單體聚合形成[7]。在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)編碼幾丁質(zhì)合成酶的Scchs基因。Scchs1p在出芽過(guò)程中作為一種修復(fù)酶，修補(bǔ)酵母子細(xì)胞脫離母體后脆弱的細(xì)胞壁；Scchs2p參與初級(jí)隔膜的形成；Scchs3p參與芽痕和側(cè)壁的幾丁質(zhì)合成[8-9]。在禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)中，F(xiàn)gChs2和其他的幾丁質(zhì)合成酶基因共同調(diào)控病菌的營(yíng)養(yǎng)發(fā)育和毒力[10]。在稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)中，MoCHS1、MoCHS6和MoCHS7對(duì)于植物侵染是必需的，MoCHS5和MoCHS6在維持菌絲的極化生長(zhǎng)過(guò)程中共同發(fā)揮作用[11]。另外，對(duì)釀酒酵母(S.cerevisiae)、禾谷鐮刀菌(F.graminearum)、小巢狀麴菌(Aspergillusnidulans)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)、粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)和稻瘟病菌(M.oryzae)等真菌進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，這些真菌中的幾丁質(zhì)合成酶基因可為7類(Class Ⅰ～Class Ⅶ)[10]。河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室植物病原信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)課題組前期研究中在玉米大斑病菌中已鑒定得到8個(gè)幾丁質(zhì)合成酶基因(StCHS1～StCHS8)，將這些幾丁質(zhì)合成酶基因同樣分為7類(Ⅰ～Ⅶ)，其中StCHS7屬于Class Ⅰ,StCHS8屬于Class Ⅱ,StCHS6屬于Class Ⅲ,StCHS2屬于Class Ⅳ,StCHS5屬于Class Ⅴ,StCHS1屬于Class Ⅵ，StCHS3、StCHS4屬于Class Ⅶ。

本研究擬從玉米大斑病菌中克隆其關(guān)鍵的幾丁質(zhì)合成酶基因StCHS6(Class Ⅲ)，并利用SMART、GSDS、Expasy、SOMPA和WoLF PSORT等軟件對(duì)其基因結(jié)構(gòu)及其所編碼的蛋白進(jìn)行分析，進(jìn)一步利用RNA-Seq技術(shù)分析StCHS6在病菌不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式，旨在明確玉米大斑病菌幾丁質(zhì)合酶基因StCHS6的結(jié)構(gòu)特征及表達(dá)模式，闡明該基因在病菌的生長(zhǎng)發(fā)育及致病過(guò)程中的作用及研發(fā)以幾丁質(zhì)合成酶基因?yàn)榘袠?biāo)的新型抗真菌藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

玉米大斑病菌1號(hào)小種菌株01-23，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

dNTP Mixture、10×PCR Buffer、TaqDNA聚合酶及PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser均購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司；便捷型植物RNA快速提取試劑盒購(gòu)于天津華力科析科技有限公司；膠回收試劑盒購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 RNA的提取 玉米大斑病菌野生型菌株于25 ℃黑暗條件培養(yǎng)12 d后，收集病菌氣生菌絲。RNA提取方法參照便捷型植物RNA快速提取試劑盒說(shuō)明書。

1.3.2 第一鏈cDNA的合成 以1.3.1提取的病菌總RNA為模板，參照PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒使用說(shuō)明書合成第一鏈cDNA，并將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 玉米大斑病菌StCHS6基因的克隆 對(duì)玉米大斑病菌中幾丁質(zhì)合成酶的鑒定結(jié)果表明，StCHS6的蛋白ID為133408。利用該蛋白ID于玉米大斑病菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://genome.jgi.doe.gov/Settu1/Settu1.home.html)中下載StCHS6的CDS序列[12-13]。利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物CHS6-F/R用于StCHS6的CDS序列擴(kuò)增(表1)。PCR反應(yīng)體系為：模板cDNA(300 ng/μL) 1 μL，CHS6-F/R(10 μmol/L)各1 μL，TaKaRaTaqDNA聚合酶(5 U/μL) 0.25 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L) 2 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，ddH2O 17.25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行檢測(cè)。

表1 基因克隆引物序列Tab.1 Primer sequences used in gene cloning

1.3.4StCHS6基因及編碼產(chǎn)物的生物信息學(xué)分析StCHS6基因的結(jié)構(gòu)特征及其所編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域、理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位分析參考文獻(xiàn)[14]。

1.3.5 玉米大斑病菌不同發(fā)育時(shí)期材料的收集 病菌不同發(fā)育時(shí)期材料的收集方法參考文獻(xiàn)[14]。

1.3.6StCHS6在玉米大斑病菌不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式分析 基于已經(jīng)獲得的玉米大斑病菌RNA-Seq數(shù)據(jù)庫(kù)，分析StCHS6在病菌菌絲、分生孢子、芽管、附著胞和侵入釘5個(gè)典型的發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米大斑病菌StCHS6基因的克隆及結(jié)構(gòu)分析

利用StCHS6的蛋白ID從玉米大斑病菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索，結(jié)果表明其位于病菌基因組scaffold_1:2066293-2069876(-)的位置，基因全長(zhǎng)為3 584 bp，CDS序列大小為2 703 bp。以玉米大斑病菌cDNA為模板，對(duì)StCHS6的CDS序列進(jìn)行擴(kuò)增，得到的PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期相符(圖1)。對(duì)目的條帶進(jìn)行回收測(cè)序，擴(kuò)增產(chǎn)物序列與數(shù)據(jù)庫(kù)所下載序列一致，表明在該病菌中克隆得到了StCHS6的CDS序列。

利用Gene Structure Display Server (GSDS)在線軟件對(duì)StCHS6的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，StCHS6含有4個(gè)內(nèi)含子，5個(gè)外顯子(圖2)。內(nèi)含子相位通常用于分析基因結(jié)構(gòu)的進(jìn)化，0、1和2代表內(nèi)含子在密碼子中的位置。0代表內(nèi)含子位于第1個(gè)堿基之前，1代表內(nèi)含子位于第1個(gè)堿基之后，2代表內(nèi)含子位于第2個(gè)堿基之后[15]。根據(jù)2個(gè)相鄰內(nèi)含子的組合是否引起移碼突變定義了兩類外顯子：不對(duì)稱外顯子和對(duì)稱外顯子[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，StCHS6基因不含有0相位，2個(gè)相鄰內(nèi)含子相位的組合分別為(1-2)，(2-2)和(2-1)，表明在StCHS6中不對(duì)稱外顯子和對(duì)稱外顯子均存在。

M.DNA Marker(100～5 000 bp); 1, 2.StCHS6基因擴(kuò)增產(chǎn)物。 M.DNA Marker(100-5 000 bp); 1, 2.Amplification products of StCHS6.

圖2 StCHS6基因結(jié)構(gòu)特征Fig.2 The structure characteristics of StCHS6 gene

2.2 玉米大斑病菌StCHS6蛋白的理化性質(zhì)分析及亞細(xì)胞定位

利用Expasy在線軟件對(duì)StCHS6蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，推測(cè)StCHS6蛋白的分子式為C4586H6985N1203O1309S30，編碼900個(gè)氨基酸殘基，分子質(zhì)量為100.877 98 ku，等電點(diǎn)(PI)為8.36，表明StCHS6蛋白為堿性蛋白。該蛋白的脂肪指數(shù)為81.86，親水性平均值為-0.178，不穩(wěn)定指數(shù)為36.94，屬于穩(wěn)定型蛋白。利用SOMPA對(duì)StCHS6蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明在該蛋白中，無(wú)規(guī)則卷曲(Random coil)占43.56%，α-螺旋(Alpha helix)占38.44%，延伸鏈(Extended strand)占13.44%，β-轉(zhuǎn)角(Beta turn)占4.56%。利用SMART對(duì)StCHS6的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)StCHS6包含幾丁質(zhì)合酶催化結(jié)構(gòu)域Chitin_synth_1(682-694aa)和多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(圖3)。利用WoLF PSORT對(duì)該蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，推測(cè)其位于細(xì)胞膜上。

藍(lán)色長(zhǎng)方形代表跨膜結(jié)構(gòu)域；粉色長(zhǎng)方形代表幾丁質(zhì)合酶催化結(jié)構(gòu)域Chitin_synth_1。 The blue rectangle represents transmembrane region; The pink rectangle represents the chitin synthase catalytic domain Chitin_synth_1.

2.3 StCHS6在玉米大斑病菌不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式

基于RNA-Seq數(shù)據(jù)對(duì)StCHS6在菌絲、分生孢子、芽管、附著胞及侵入釘5個(gè)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果表明，StCHS6在以上5個(gè)發(fā)育時(shí)期均有表達(dá)，但其表達(dá)量有所差異(圖4)。以芽管時(shí)期的表達(dá)量為1，菌絲、分生孢子、附著胞和侵入釘時(shí)期的表達(dá)量分別為菌絲時(shí)期的3.80，4.97，3.40，2.60倍，說(shuō)明StCHS6在分生孢子時(shí)期表達(dá)量最高，在芽管時(shí)期表達(dá)量最低。以上結(jié)果表明，StCHS6在玉米大斑病菌生長(zhǎng)發(fā)育及侵染過(guò)程中均發(fā)揮作用，但在各個(gè)發(fā)育時(shí)期的重要程度有所不同。

不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。 Different small letters indicate significant difference at the 0.05 level.

3 討論與結(jié)論

前人研究表明，真菌中的幾丁質(zhì)合成酶在維持細(xì)胞完整性、菌絲生長(zhǎng)和寄主侵染等過(guò)程中均發(fā)揮重要作用[17-18]。在小巢狀麴菌(A.nidulans)中，Class Ⅲ的幾丁質(zhì)合成酶對(duì)于菌絲生長(zhǎng)是必需的[19]；在禾谷鐮刀菌(F.graminearum)中沒(méi)有獲得Fgchs3b(Class Ⅲ)的缺失突變體，表明該基因的缺失可能是致命的[20]；在稻瘟病菌(M.oryzae)中，Class Ⅲ中的幾丁質(zhì)合成酶的缺失會(huì)導(dǎo)致超過(guò)90%的分生孢子形態(tài)異常[11]；而在灰葡萄孢菌(B.cinerea)中，Class Ⅲ幾丁質(zhì)合成酶(Bcchs3a)的缺失導(dǎo)致病菌毒力顯著降低[21]；在構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)中，Class Ⅲ類幾丁質(zhì)合成酶基因AnchsB在其整個(gè)發(fā)育過(guò)程中都表達(dá)，當(dāng)AnchsB敲除后，出現(xiàn)了菌株生長(zhǎng)速率減慢、不產(chǎn)孢子、菌絲尖端膨大和側(cè)壁異常等表型缺陷[22]。以上結(jié)果表明，真菌中ClassⅢ幾丁質(zhì)合成酶通過(guò)影響細(xì)胞壁的合成從而對(duì)病菌的生長(zhǎng)發(fā)育及侵染和致病過(guò)程造成影響。本研究中，RNA-Seq數(shù)據(jù)表明StCHS6在病菌生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)時(shí)期都表達(dá)，但在菌絲和分生孢子時(shí)期表達(dá)量較高，由此推測(cè)，StCHS6可能參與玉米大斑病菌的菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢過(guò)程，但需要進(jìn)一步通過(guò)創(chuàng)制StCHS6基因敲除突變體進(jìn)行驗(yàn)證。

前人研究表明，幾丁質(zhì)是植物病原真菌細(xì)胞壁的特有組分，該物質(zhì)不存在于植物細(xì)胞壁中，因此，研發(fā)以抑制或干擾病原真菌幾丁質(zhì)合成酶合成或降低該酶活性的新型殺菌劑是目前植物病理學(xué)界研究的熱點(diǎn)之一[23]。本研究只是分析了玉米大斑病菌幾丁質(zhì)合成酶家族中的1個(gè)關(guān)鍵基因StCHS6的表達(dá)模式，尚沒(méi)有對(duì)整個(gè)基因家族的表達(dá)規(guī)律及功能進(jìn)行系統(tǒng)分析。因此，在后續(xù)研究中，應(yīng)利用基因敲除和過(guò)表達(dá)技術(shù)，明確該基因在病菌致病性方面的功能，進(jìn)一步通過(guò)比較突變體與野生型菌株對(duì)細(xì)胞壁類殺真菌制劑的敏感性，明確殺真菌制劑的作用機(jī)制，并篩選創(chuàng)制新型殺真菌制劑。

本研究通過(guò)克隆得到了玉米大斑病菌幾丁質(zhì)合成酶基因StCHS6的CDS序列，發(fā)現(xiàn)該基因含有4個(gè)內(nèi)含子，5個(gè)外顯子。對(duì)其所編碼的蛋白進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該基因編碼900個(gè)氨基酸，屬于堿性穩(wěn)定型蛋白。該蛋白含有幾丁質(zhì)合成酶催化結(jié)構(gòu)域Ⅰ和多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，定位于細(xì)胞膜上。對(duì)StCHS6在病菌菌絲、分生孢子、芽管、附著胞和侵入釘時(shí)期的表達(dá)量分析表明，該基因在分生孢子時(shí)期表達(dá)量最高，在芽管時(shí)期表達(dá)量最低，說(shuō)明StCHS6可能在分生孢子時(shí)期發(fā)揮重要作用。