李世軍，尹寶穎，李 佳，李中勇，張學(xué)英，徐繼忠

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，河北 保定 071000；2.河北景縣中學(xué)，河北 衡水 053500)

蘋(píng)果品種結(jié)構(gòu)不合理是影響我國(guó)蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的一個(gè)重要因素，提高早熟品種所占比例，是蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然。限制早熟蘋(píng)果品種在生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的一個(gè)重要因素是早熟品種果實(shí)容易軟化、貨架期短。有關(guān)蘋(píng)果果實(shí)軟化的研究，歷來(lái)是蘋(píng)果研究中重要的熱點(diǎn)領(lǐng)域。齊秀東等[1-2]以嘎拉、富士、金冠蘋(píng)果為試材，分析了果實(shí)發(fā)育軟化過(guò)程細(xì)胞壁組分、細(xì)胞壁酶活性及其基因表達(dá)的變化。陳學(xué)森等[3]以喬納金及其脆肉株變?yōu)樵嚥?，比較分析了果實(shí)發(fā)育后期果實(shí)軟化相關(guān)基因的表達(dá)差異，李宏建等[4]研究了岳帥蘋(píng)果貯藏軟化過(guò)程中果實(shí)酶活性及理化性狀的變化。以上分析顯示果實(shí)軟化的研究以中晚熟品種為試材的較多，劉超超等[5]研究了泰山早霞、遼伏、極早紅等3個(gè)早熟品種果實(shí)軟化過(guò)程中硬度、乙烯、酶活性間的關(guān)系。

藤木1號(hào)是一個(gè)優(yōu)良早熟蘋(píng)果品種，在我國(guó)已有一定的栽培面積，XU2-5是河北農(nóng)業(yè)大學(xué)選育出早熟蘋(píng)果新品系，具有成熟期早、果個(gè)適中、果形端正、色澤鮮艷等優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定藤木1號(hào)、XU2-5果實(shí)成熟過(guò)程中果實(shí)硬度、乙烯釋放速率及相關(guān)基因表達(dá)等指標(biāo)的變化，探明藤木1號(hào)、XU2-5果實(shí)軟化的原因，以期為延長(zhǎng)果實(shí)貯藏期，保持其品質(zhì)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試材及采樣

試驗(yàn)于2016-2017年在河北省保定市順平縣南神南村河北農(nóng)業(yè)大學(xué)蘋(píng)果示范園中進(jìn)行，供試材料為7～8 a生的早熟品種(系)XU2-5、藤木1號(hào)，中間砧為SH40，基砧為八棱海棠，樹(shù)形為細(xì)長(zhǎng)紡錘形，株行距為2 m×4 m，樹(shù)勢(shì)生長(zhǎng)健壯，常規(guī)管理。

每個(gè)品種(系)選擇生長(zhǎng)結(jié)果一致的3棵樹(shù)，自盛花后80～100 d，每隔5 d取樣1次，共計(jì)5次。各品種(系)每次每株從樹(shù)冠外圍到內(nèi)膛隨機(jī)選取大小均勻、無(wú)損傷的10個(gè)果實(shí)，共30個(gè)果實(shí)。采后立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乙烯釋放速率的測(cè)定 將蘋(píng)果果實(shí)置于干燥器中，靜置密封6 h后收集乙烯氣體，醫(yī)用注射器抽取1 mL氣體保存?zhèn)溆?，每個(gè)重復(fù)測(cè)定3次。

采用FULI-9790II 氣相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，色譜條件為：色譜柱采用不銹鋼填充柱；氫火焰離子化檢測(cè)器；柱箱溫度90 ℃，汽化室溫度140 ℃，載氣流速分別為N2：120 mL/min(0.12 MPa)，H2：100 mL/min(0.1 MPa)，合成空氣：100 mL/min(0.1 MPa)，進(jìn)樣量為1 mL。

1.2.2 硬度的測(cè)定 采用GY-1型果實(shí)硬度計(jì)測(cè)定，在果實(shí)表面選擇對(duì)稱(chēng)的4個(gè)面，去皮，取4個(gè)面的平均值，單位kg/cm2。

1.2.3 酶活性的測(cè)定 取 2 g 樣品，用 6 mL 酶提取液(6% NaCl，內(nèi)含0.6% EDTA，1% PVP) 勻漿。然后再 10 000 r/min 離心 20 min，上清液即為粗酶提取液，待用。

多聚半乳糖醛酸酶(PG)及果膠甲酯酶(PE)活性測(cè)定采用薛應(yīng)龍[6]的方法。脂氧合酶活性(LOX)的測(cè)定參照陳昆松等[7]的方法。

1.2.4MdACS、MdPG、MdPE、MdLOX基因相對(duì)表達(dá)量測(cè)定 采用天根生物科技有限公司的試劑盒提取果實(shí)樣品總RNA，引用文獻(xiàn)中給出的MdPG1、MdPE、MdACS6、MdLOX引物[8-11](表 1)，用全式金逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成各基因的cDNA 第一鏈后，在多重Real-time熒光定量PCR儀下進(jìn)行各基因的相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定。以Actin為內(nèi)參基因。重復(fù)3 次。

采用2-ΔΔCT法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相對(duì)定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 果實(shí)硬度的變化

隨著果實(shí)發(fā)育成熟，2個(gè)品種(系)果實(shí)硬度均呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，但各品種(系)間下降幅度及速率存在差異(圖1)。花后80 d，藤木1號(hào)果實(shí)硬度最高，為14.15 kg/cm2，到花后100 d硬度最低，僅為7.38 kg/cm2，其硬度下降了47.84%。而XU2-5花后80～100 d，果實(shí)硬度變化幅度較小，僅降低了22.19%?；ê?00 d，XU2-5的果實(shí)硬度顯著高于藤木1號(hào)的果實(shí)硬度(P<0.05)。

表1 Real-time PCR 引物序列Tab.1 Nucleotide sequences of primers in Real-time PCR

不同小寫(xiě)字母表示在P<0.05水平上差異顯著。圖2-9同。 Different lowercase letters mean significant difference at 0.05 level.The same as Fig.2-9.

2.2 乙烯釋放速率及MdACS6基因表達(dá)變化

如圖2所示，供試2個(gè)品種(系)的乙烯釋放速率(以鮮質(zhì)量計(jì))隨著果實(shí)成熟總體呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，但2個(gè)品種(系)間存在差異。藤木1號(hào)的乙烯釋放速率在花后95 d出現(xiàn)明顯的高峰，此時(shí)藤木1號(hào)的乙烯釋放速率顯著高于XU2-5。XU2-5的乙烯釋放速率前期緩慢增加，在花后90～100 d迅速升高，乙烯釋放速率增加了36.97 nL/(h·g)?；ê?0～100 d，藤木1號(hào)乙烯釋放速率顯著高于XU2-5。

圖2 兩個(gè)品種成熟過(guò)程中乙烯釋放速率的變化Fig.2 Changes of ethylene production during the ripening process

XU2-5和藤木1號(hào)的MdACS6基因相對(duì)表達(dá)量變化基本一致(圖3)，前期基因相對(duì)表達(dá)量較低，之后相對(duì)表達(dá)量逐漸升高?；ê?0，90，95 d藤木1號(hào)的MdACS6基因相對(duì)表達(dá)量均顯著高于XU2-5，花后85,100 d雖然藤木1號(hào)的MdACS6基因相對(duì)表達(dá)量高于XU2-5，但未達(dá)顯著水平。

對(duì)比兩品種(系)果實(shí)的乙烯釋放速率與MdACS6基因相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示二者總體趨勢(shì)相一致，藤木1號(hào)在花后95 d、XU2-5在花后100 d乙烯釋放速率較高，而且MdACS6基因相對(duì)表達(dá)量也相對(duì)較高。

圖3 兩個(gè)品種成熟過(guò)程中MdACS6基因相對(duì)表達(dá)量的變化Fig.3 Changes in MdACS6 gene expressions during the ripening process

2.3 相關(guān)酶活性及其基因表達(dá)變化

2.3.1 多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性及其基因相對(duì)表達(dá)量 由圖4，5可以看出，藤木1號(hào)果實(shí)成熟過(guò)程中MdPG1基因相對(duì)表達(dá)量和酶活性表現(xiàn)出了較好的一致性，而XU2-5則表現(xiàn)為盛花后80～90 d二者趨勢(shì)一致。盛花后80 d，藤木1號(hào)的MdPG1基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于XU2-5，此時(shí)，藤木1號(hào)的酶活性顯著高于XU2-5。盛花后85 d，兩品種(系)的基因相對(duì)表達(dá)量及酶活性均下降，差異不顯著；盛花后85～90 d兩品種(系)的基因相對(duì)表達(dá)量及酶活性均顯著升高，90 d時(shí)MdPG1基因相對(duì)表達(dá)量是85 d的7.56～29.72倍，XU2-5的相對(duì)表達(dá)量顯著高于藤木1號(hào)；盛花后90 d PG活性是85 d的1.39～1.58倍，表現(xiàn)為藤木1號(hào)的酶活性顯著高于XU2-5。盛花后90～95 d二者的基因相對(duì)表達(dá)量顯著下降，95 d時(shí)二者間無(wú)顯著差異，但二者的PG活性仍較高，二者間無(wú)顯著差異。盛花后100 d，二者的基因相對(duì)表達(dá)量和酶活性均升高，藤木1號(hào)的基因相對(duì)表達(dá)量顯著大于XU2-5，但酶活性間差異不顯著。

圖4 果實(shí)成熟過(guò)程中多聚半乳糖醛酸酶活性的變化Fig.4 Changes in PG activity of two varieties during the ripening process

圖5 兩個(gè)品種成熟過(guò)程中MdPG1基因相對(duì)表達(dá)量的變化Fig.5 Changes in MdPG1 gene expressions during the ripening process

2.3.2 果膠甲酯酶(PE)活性及其基因表達(dá) 由圖6，7可以看出，兩品種的MdPE基因相對(duì)表達(dá)量與PE酶活性(以鮮質(zhì)量計(jì))變化趨勢(shì)在盛花后85 d前一致，以后不一致。盛花后80～85 d，MdPE基因相對(duì)表達(dá)量升高，藤木1號(hào)的高于XU2-5，此時(shí)酶活性表現(xiàn)出一致性；盛花后90 d，XU2-5的MdPE基因相對(duì)表達(dá)量繼續(xù)升高，而藤木1號(hào)的則下降，而此時(shí)二者的酶活性則同時(shí)下降；盛花后90～100 d，兩品種(系)的MdPE基因相對(duì)表達(dá)量下降，而其酶活性則持續(xù)升高，盛花后100 d，藤木1號(hào)的酶活性顯著高于XU2-5。

圖6 果實(shí)成熟過(guò)程中果膠甲酯酶活性的變化Fig.6 Changes in PE activity of two varieties during the ripening process

圖7 兩個(gè)品種成熟過(guò)程中MdPE基因相對(duì)表達(dá)量的變化Fig.7 Changes in MdPE gene expressions during the ripening process

2.3.3 脂氧合酶(LOX)活性及其基因表達(dá) 由圖8，9可以看出，果實(shí)成熟過(guò)程中脂氧合酶(以鮮質(zhì)量計(jì))的變化趨勢(shì)與MdLOX基因相對(duì)表達(dá)量變化不一致。隨著果實(shí)成熟，供試2個(gè)品種(系)的脂氧合酶(LOX)活性呈現(xiàn)相似的變化趨勢(shì)，先降低后升高(圖8)?；ê?0～85 d，2個(gè)品種(系)的脂氧合酶活性迅速降低， XU2-5的降低幅度大于藤木1號(hào)?；ê?5～100 d，XU2-5和藤木1號(hào)的酶活性呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，藤木1號(hào)的酶活性始終高于XU2-5的酶活性，花后90 d和花后100 d，藤木1號(hào)和XU2-5的酶活性存在顯著差異。從圖9可以看出，XU2-5的MdLOX基因的相對(duì)表達(dá)量變化呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，高峰出現(xiàn)在花后85 d，而藤木1號(hào)的MdLOX基因相對(duì)表達(dá)量波動(dòng)較大，最高值出現(xiàn)在花后100 d。

圖8 果實(shí)成熟過(guò)程中脂氧合酶活性的變化Fig.8 Changes in LOX activity of two varieties during the ripening process

2.3.4 果實(shí)硬度與酶活性的相關(guān)性 XU2-5和藤木1號(hào)的發(fā)育過(guò)程中果實(shí)硬度與酶活性的相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。由表2可知，XU2-5和藤木1號(hào)的果實(shí)硬度與PG活性存在顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.944，-0.870，而果實(shí)硬度與PE活性和LOX活性的相關(guān)性不明顯。

圖9 兩個(gè)品種成熟過(guò)程中MdLOX基因相對(duì)表達(dá)量的變化Fig.9 Changes in MdLOX gene expressions during the ripening process

表2 果實(shí)硬度與酶活性的相關(guān)性系數(shù)Tab.2 The correlation coefficient of related enzymes activity and firmness

注：*.5%的差異顯著水平。

Note：*.The significant level of 5%.

3 結(jié)論與討論

乙烯能夠改變細(xì)胞原生質(zhì)膜的透性，使水解酶外滲，有助于降解細(xì)胞壁的組成成分，所以乙烯對(duì)果實(shí)的成熟軟化起著重要的調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果顯示，隨著果實(shí)的成熟，XU2-5和藤木1號(hào)的乙烯釋放速率均呈現(xiàn)增高的趨勢(shì)，整個(gè)采樣期間藤木1號(hào)的乙烯釋放速率均明顯大于XU2-5，且藤木1號(hào)的果實(shí)已產(chǎn)生呼吸躍變。與之對(duì)應(yīng)的二者果實(shí)的硬度也呈現(xiàn)明顯的下降，且藤木1號(hào)的果實(shí)硬度下降速率明顯高于XU2-5，因而推測(cè)乙烯釋放速率升高可能是造成果實(shí)硬度下降的主要原因，劉超超等[5]對(duì)泰山早霞的研究也得出了同樣的結(jié)果。但對(duì)比果實(shí)硬度下降和乙烯釋放速率可以看出，XU2-5在盛花后80～90 d乙烯釋放速率變化很小，但硬度下降較快，表明此時(shí)硬度的下降可能是獨(dú)立于乙烯控制或較小依賴乙烯的事件，Ireland 等[12]也有同樣發(fā)現(xiàn)。ACC合成酶(ACS)是乙烯合成的限速酶，在果實(shí)成熟軟化過(guò)程中起重要作用，雖然Harb等[13]研究顯示，蜜脆蘋(píng)果乙烯釋放量較低與乙烯生物合成基因表達(dá)不相關(guān)，但本試驗(yàn)結(jié)果顯示花后90 d藤木1號(hào)、花后95 d XU2-5果實(shí)的ACS6的基因表達(dá)強(qiáng)度達(dá)到最高值，以后二者乙烯的釋放速率迅速升高。李通[11]的結(jié)果也顯示ACS基因表達(dá)在果實(shí)產(chǎn)生乙烯高峰時(shí)起著重要的調(diào)控作用。因此，采取措施調(diào)控ACS基因表達(dá)可以有效的調(diào)控軟化。

研究認(rèn)為，果實(shí)軟化主要是多種細(xì)胞壁酶的作用引起果膠和細(xì)胞壁物質(zhì)的水解，造成硬度的下降，但在不同果實(shí)中起主導(dǎo)作用的水解酶不同，且在不同發(fā)育階段也有所差異[14]。在山農(nóng)脆梨、黃金梨和鴨梨3個(gè)梨品種的研究中認(rèn)為果膠甲酯酶(PE)、淀粉酶(AM)、纖維素酶(Cx)是引起硬度下降的主要原因[15]。秦冠的硬度和脆度與PG和PE酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)[16]。而劉超超等[5]認(rèn)為硬度的快速下降及貨架期短的原因主要是PG活性高峰的出現(xiàn)。在蘋(píng)果后期軟化過(guò)程中，PG起主要作用，與果實(shí)的成熟軟化呈正相關(guān)。本試驗(yàn)中XU2-5和藤木1號(hào)果實(shí)硬度均呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，但下降幅度不同，2個(gè)品種(系)的硬度變化與PG活性變化存在顯著的負(fù)相關(guān)。但對(duì)比分析二者M(jìn)dPG基因表達(dá)可以看出，藤木1號(hào)的基因相對(duì)表達(dá)量變化與酶活性變化一致，表明本試驗(yàn)中檢測(cè)的MdPG基因(為MdPG1)在藤木1號(hào)中起主要作用，而在XU2-5中可能MdPG家族中其他基因起主要作用。LOX參與膜質(zhì)過(guò)氧化作用，通過(guò)破壞膜結(jié)構(gòu)，從而加速衰老，是果實(shí)軟化的重要因素之一[17-18]。有研究表明，脂氧合酶(LOX)在紅星蘋(píng)果和肥城桃軟化的啟動(dòng)階段有促進(jìn)作用，LOX可能是導(dǎo)致前期軟化的原因[19-20]。本試驗(yàn)中，XU2-5和藤木1號(hào)的果實(shí)硬度變化與LOX活性變化相關(guān)性不顯著，但2個(gè)品種(系)的LOX活性在花后80 d處于最高峰，可能與果實(shí)軟化的啟動(dòng)有關(guān)。