唐秀英,王會民,龍起樟,黃永蘭,蘆 明,萬建林
(江西省超級水稻研究發(fā)展中心,江西 南昌 330200)
近年來,極端天氣肆虐全球。我國長江中下游雙季早稻種植區(qū)低溫冷害頻發(fā),如每年3-4月出現(xiàn)的“倒春寒”,氣溫驟降、陰雨連綿,造成水稻爛芽、爛秧、死苗而減產(chǎn)。低溫冷害是一種重要的非生物逆境傷害,它嚴(yán)重干擾作物的生理代謝,導(dǎo)致植株生長和發(fā)育不良,最終造成作物減產(chǎn)甚至絕收,給南方早稻生產(chǎn)帶來較大威脅。
東鄉(xiāng)野生稻耐冷性極強(qiáng),能夠在武漢-12.8 ℃的條件下安全越冬[1],目前已成為水稻耐冷性機(jī)理研究的重要材料和育種的優(yōu)異種質(zhì)資源[2]。有關(guān)研究表明,東鄉(xiāng)野生稻的耐冷性是由多基因控制的數(shù)量性狀[3-4],并且先后在多條染色體上發(fā)現(xiàn)與耐冷性相關(guān)的QTL[5-6],但是,由于東鄉(xiāng)野生稻的遺傳性狀野生性強(qiáng),以及研究方法和實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備的局限性,其耐冷性的遺傳機(jī)理研究進(jìn)展緩慢。蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的產(chǎn)物,是一切生命功能的最終執(zhí)行者,蛋白質(zhì)組學(xué)可從全息化的視角研究作物對環(huán)境應(yīng)答的機(jī)制[7]。
本項(xiàng)目以東鄉(xiāng)野生稻(來源于江西省農(nóng)科院水稻所)和冷敏感品種中嘉早17為研究材料[8-9],利用iTRAQ技術(shù)對水稻幼苗響應(yīng)低溫脅迫的根系蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究,以期發(fā)現(xiàn)與低溫冷害相關(guān)的蛋白質(zhì)或基因,為進(jìn)一步闡述水稻耐冷機(jī)理及耐冷基因的挖掘提供理論依據(jù),同時(shí)也有助于在生產(chǎn)上培育出耐冷性強(qiáng)的水稻材料或品種。
以強(qiáng)耐冷材料東鄉(xiāng)野生稻(W)和冷敏感材料中嘉早17(Z)為供試材料。
生理指標(biāo)樣品處理:將生長一致的三葉一心期苗于5 ℃低溫處理,分別于處理0,1,2,3 d測定幼苗的根系活力、過氧化物酶(POD)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。
蛋白質(zhì)樣品處理:將生長一致的三葉一心期苗進(jìn)行25 ℃的常溫(CK)和5 ℃的低溫(L)處理,重復(fù)3次,處理3 d后取下根系立即用液氮處理并置于-70 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.1 生理指標(biāo)測定 各項(xiàng)生理指標(biāo)參照王學(xué)奎[10]的方法測定,即用氯化三苯基四氮唑(TTC)測定根系活力,用愈創(chuàng)木酚法測定POD活性,用氮藍(lán)四唑法測定SOD活性,用硫代巴比妥酸測定MDA含量。
1.3.2 蛋白質(zhì)樣品制備 稱取根系1 g,剪碎,放入研缽,加入適量的聚乙烯吡咯烷酮和液氮進(jìn)行研磨,將粉末轉(zhuǎn)移到10 mL離心管中,加入適量的含0.07%β-巰基乙醇的三氯乙酸-丙酮溶液(1∶9),混勻后置于-20 ℃冰箱中沉淀至少2 h,于4 ℃、15 000 r/min離心30 min,去上清,加入80%丙酮(含0.07% β-巰基乙醇)重懸沉淀,按上述條件離心,重復(fù)多次,至上清為無色,沉淀經(jīng)真空干燥成蛋白質(zhì)干粉,于-80 ℃保存。稱取適量的蛋白質(zhì)干粉,加入蛋白質(zhì)裂解液(8 mol/L尿素、65 mmol/L二硫蘇糖醇、40 mmol/L Tris、4%CHAPS),于25 ℃水浴超聲溶解30 min,18 000 r/min離心15 min取上清,采用Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,判斷iTRAQ質(zhì)譜定量實(shí)驗(yàn)可行性。
1.3.3 蛋白質(zhì)酶解和標(biāo)記 取200 μg蛋白質(zhì)樣品,加入200 μL UA Buffer(8 mol/L尿素、150 mmol/L Tris HCl、pH值8.0),充分混勻,轉(zhuǎn)移到10K超濾離心管中,12 000 r/min離心15 min,棄濾液,重復(fù)1次。加入100 μL IAA,600 r/min振蕩1 min,25 ℃避光放置30 min,12 000 r/min離心10 min,棄濾液,加入100 μL UA Buffer,12 000 r/min離心10 min,重復(fù)2次。加入100 μL Dissolution Buffer, 12 000 r/min離心10 min,重復(fù)2次。加入40 μL Trypsin Buffer,600 r/min振蕩1 min,于37 ℃放置約17 h。各組樣品肽段分別取80 μg,按照AB公司試劑盒(AB SCIEX)進(jìn)行iTRAQ標(biāo)記。隨機(jī)取3次生物學(xué)重復(fù)中的2次進(jìn)行標(biāo)記。
1.3.4 色譜SCX分級及質(zhì)譜分析 利用AKTA Purifier 100蛋白純化系統(tǒng)對標(biāo)記后的肽段進(jìn)行SCX預(yù)分級,收集洗脫組分約33份,根據(jù)色譜圖合并成10份,冷凍抽干后C18脫鹽。樣品采用毛細(xì)管高效液相色譜進(jìn)行分離,利用Q-Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜檢測。
1.3.5 數(shù)據(jù)處理及生物信息學(xué)分析 原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)RAW文件利用Mascot 2.2版本進(jìn)行查庫,采用軟件Proteomo Discoverer 1.4對肽段報(bào)告離子峰強(qiáng)度進(jìn)行定量分析??尚诺鞍诪镻eptide FDR≤0.01且肽段數(shù)≥1。在可信蛋白基礎(chǔ)上,選擇P≤0.05,差異倍數(shù)<0.83或>1.2為差異表達(dá)蛋白。對鑒定的蛋白質(zhì)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG分析。
1.3.6 qRT-PCR驗(yàn)證 選擇部分差異表達(dá)蛋白進(jìn)行mRNA表達(dá)水平上的驗(yàn)證。提取根系總RNA,以經(jīng)過DNAse處理后的總RNA為模板,使用鼎國反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成。從NCBI獲取目的基因mRNA全長序列,利用Primer Blast軟件設(shè)計(jì)引物,引物序列見表1。以肌動蛋白-1(Actin-1)基因作為內(nèi)參基因。PCR循環(huán)參數(shù)為:95 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35個(gè)循環(huán)。
表1 熒光定量PCR引物信息Tab.1 Primers for qRT-PCR
從圖1可知,隨著處理天數(shù)的增加,只有SOD酶活性在東鄉(xiāng)野生稻和中嘉早17中的變化總趨勢表現(xiàn)一致,即隨著處理天數(shù)的增加,SOD酶活性先顯著增加再下降,但是中嘉早17在第3天下降得更顯著。在根系活力變化圖中,中嘉早17的根系活力隨著處理天數(shù)的增加均顯著下降,而東鄉(xiāng)野生稻的根系活力在前2 d呈顯著下降趨勢,在第3天卻稍有增長。在POD酶活性變化圖中,東鄉(xiāng)野生稻和中嘉早17的根系POD酶活性在前2 d呈現(xiàn)相反的變化趨勢,即東鄉(xiāng)野生稻根系POD酶活性先降低再增加,中嘉早17根系POD酶活性先增加再降低。在MDA含量變化圖中,處理前2 d均呈現(xiàn)增長趨勢(東鄉(xiāng)野生稻的增長幅度很慢),但在第3天,東鄉(xiāng)野生稻略微下降,而中嘉早17呈顯著增長。因此,5 ℃低溫處理影響東鄉(xiāng)野生稻和中嘉早17的根系生理指標(biāo),且在低溫處理第3天,2個(gè)材料間已出現(xiàn)明顯差異。
不同小寫字母表示同一品種不同處理之間差異顯著(P<0.05)。 Different lowercases indicate that the difference between the different treatments of the same variety at the 0.05 level is significant.
2.2.1 根系差異表達(dá)蛋白的鑒定結(jié)果 通過比較常溫與低溫處理下苗期根系蛋白質(zhì)組,共獲得可信肽段數(shù)12 673條,鑒定的蛋白數(shù)量為3 346個(gè)。在WCK-WL中,差異表達(dá)蛋白質(zhì)共167個(gè),上調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)61個(gè),下調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)106個(gè);在ZCK-ZL中,差異表達(dá)的蛋白質(zhì)共261個(gè),上調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)122個(gè),下調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)139個(gè)。在東鄉(xiāng)野生稻和中嘉早17中均發(fā)生顯著性差異表達(dá)的蛋白質(zhì)有29個(gè),其中,表達(dá)趨勢相同(均上調(diào)或下調(diào)表達(dá))的蛋白質(zhì)有19個(gè),表達(dá)趨勢相反的有10個(gè)(表2)。
表2 根系差異表達(dá)蛋白質(zhì)信息Tab.2 Information of differentially expressed proteins in roots
注:↑.表達(dá)上調(diào);↓.表達(dá)下調(diào)。
Note:↑. Up-regulated expression; ↓.Down-regulated expression.
2.2.2 根系差異表達(dá)蛋白的生物信息學(xué)分析 為進(jìn)一步了解差異蛋白質(zhì)的功能,對它們進(jìn)行了獨(dú)立的GO功能富集分析。在WCK-WL中,差異蛋白質(zhì)主要參與代謝、細(xì)胞和單機(jī)體等生物過程,分別占62.9%,46.7%和43.1%;主要涉及細(xì)胞、細(xì)胞部分和細(xì)胞器等細(xì)胞組分,分別占42.5%,41.3%和31.7%;主要在催化活性和結(jié)合兩方面上發(fā)揮分子功能,分別占50.9%和49.7%。在ZCK-ZL中,差異蛋白質(zhì)也主要參與代謝、細(xì)胞和單機(jī)體等生物過程,分別占58.6%,55.9%和47.1%;主要涉及細(xì)胞、細(xì)胞部分和細(xì)胞器等細(xì)胞組分,分別占44.1%,43.7%和28.7%;主要在結(jié)合和催化活性上發(fā)揮分子功能,分別占44.8%和36.8%。
KEGG富集分析發(fā)現(xiàn),在WCK-WL中,差異蛋白質(zhì)共涉及代謝途徑(18.0%)、次級代謝產(chǎn)物生物合成(12.6%)、碳代謝(6.6%)等58條代謝通路;在ZCK-ZL中,差異蛋白質(zhì)共涉及代謝途徑(14.6%)、次級代謝產(chǎn)物生物合成(6.1%)、內(nèi)吞(4.2%)和碳代謝(4.2%)等63條代謝通路。
2.2.3 qRT-PCR分析驗(yàn)證 為了檢測低溫脅迫下根系差異表達(dá)蛋白編碼基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)模式,本研究隨機(jī)選取了4個(gè)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。圖2表明,低溫脅迫下,水稻根系蛋白質(zhì)表達(dá)水平與轉(zhuǎn)錄水平上的表現(xiàn)不完全一致。在東鄉(xiāng)野生稻和中嘉早17中,天冬氨酸蛋白酶豬籠草蛋白酶1和非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白3在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平上的變化趨勢表現(xiàn)一致。銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ATX1和絲氨酸脫羧酶1在翻譯水平與轉(zhuǎn)錄水平上表現(xiàn)不一致,這可能與水稻根系在低溫脅迫下發(fā)生的RNA剪接和翻譯后修飾等過程有關(guān)。
A.天冬氨酸蛋白酶豬籠草蛋白酶1; B.非特異性脂 質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白3;C.銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ATX1;D.絲氨酸脫羧酶1。 A.Aspartic proteinase nepenthesin-1; B.Non-specific lipid-transfer protein 3; C.Copper transport protein ATX1; D.Serine decarboxylase 1.
作物遭受低溫脅迫時(shí),可通過改變植株體內(nèi)相關(guān)代謝通路或者調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平降低或者修復(fù)低溫造成的損傷,以維持低溫脅迫下正常的生理活動。脫水蛋白(Dehydrin)是一類親水蛋白,在處于逆境脅迫的植株中大量表達(dá),以提高植株的抗逆性[11]。低溫脅迫下,脫水蛋白能夠穩(wěn)定植物細(xì)胞和大分子化合物的結(jié)構(gòu),具有抗凍和清除活性氧等功能[12]。GNOM蛋白(GNOM protein)參與植物主根及側(cè)根的生長發(fā)生過程[13]。低溫脅迫下,GNOM蛋白的大量表達(dá)有利于維持植株的根系生長。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Serine/threonine-protein kinase)是催化絲氨酸或蘇氨酸殘基磷酸化的一類酶,在植株響應(yīng)逆境脅迫、細(xì)胞信號傳導(dǎo)、物質(zhì)運(yùn)輸和生理代謝等方面具有重要作用[14-15]。糖基轉(zhuǎn)移酶(Glycosyltransferase)通過催化作用將糖基轉(zhuǎn)移到特異受體上,糖基化受體將進(jìn)一步參與植株的生長發(fā)育、物質(zhì)合成及逆境脅迫反應(yīng)[16]。氨基酸透性酶BAT1同源物(Amino-acid permease BAT1 homolog)是一類與BAT1具有相同或相似功能的氨基酸透性酶,負(fù)責(zé)植物體內(nèi)氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)[17]。胞漿鐵硫蛋白組裝1同源物(Cytosolic iron-sulfur protein assembly protein CIAO1 homolog)是一類與CIAO1具有相同或相似功能的組裝蛋白,參與鐵硫簇的組裝[18]。低溫脅迫下,絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、氨基酸透性酶BAT1同源物和胞漿鐵硫蛋白組裝1同源物等蛋白在東鄉(xiāng)野生稻和中嘉早17中表達(dá)量均上調(diào),表明這些蛋白質(zhì)易受低溫脅迫因子的誘導(dǎo),對維持低溫脅迫下水稻苗期根系的正常生長有著重要作用。
作物遭受低溫冷害時(shí),細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)合成受阻、生理代謝紊亂、植株生長不良,嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致植株死亡。富含亮氨酸重復(fù)/伸展蛋白(Leucine-rich repeats/exetensins)是一類富含亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域的伸展蛋白,是植物細(xì)胞壁中的一類結(jié)構(gòu)蛋白,對加固細(xì)胞壁和抵御逆境反應(yīng)有著重要作用[19]。二氫硫辛酸脫氫酶(Dihydrolipoyl dehydrogenase)是催化丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴]o酶A的核心酶之一,是影響植株體內(nèi)TCA循環(huán)和脂肪酸代謝的重要酶[20]。泛素受體RAD23b(Ubiquitin receptor RAD23b)可能與植株損傷DNA的修復(fù)有關(guān)[21]。Ⅲ型過氧化物酶(Class Ⅲ peroxidase)是植物特有的一類過氧化物酶,能夠清除H2O2、胺類、酚類等毒性物質(zhì),在抗逆反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用[22]。草酸輔酶A連接酶(Oxalate-CoA ligase)在草酸降解途徑中起著重要作用,參與植株體內(nèi)病蟲害防御、重金屬脅迫及鈣離子濃度、滲透壓和pH值調(diào)節(jié)[23]。低溫脅迫下,上述幾種蛋白質(zhì)在東鄉(xiāng)野生稻和中嘉早17中表達(dá)量上調(diào),可能與水稻苗期根系遭受低溫冷害造成部分機(jī)體功能下降有關(guān),如根系活力隨著低溫處理天數(shù)的增加而下降。
銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Copper transporter)負(fù)責(zé)植物體內(nèi)Cu離子的吸收、利用和分布,維持植物體內(nèi)Cu離子的動態(tài)平衡,調(diào)控植株的生長發(fā)育[24]。最適濃度的Cu離子能夠提高植株的抗逆能力,增強(qiáng)作物的抗逆性。低溫脅迫下,耐冷性強(qiáng)的東鄉(xiāng)野生稻苗期根系中銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)上調(diào),表明該蛋白可能參與了東鄉(xiāng)野生稻抵御低溫環(huán)境過程。絲氨酸脫羧酶(Serine decarboxylase)催化絲氨酸生成乙醇胺[25]。乙醇胺衍生物如N-?;掖及吩谀婢趁{迫下參與植物的細(xì)胞防御,增強(qiáng)抗逆能力。低溫脅迫下,絲氨酸脫羧酶在東鄉(xiāng)野生稻苗期根系中表達(dá)上調(diào),而在冷敏感品種中嘉早17中表達(dá)下調(diào),表明絲氨酸脫羧酶也直接或者間接的參與了東鄉(xiāng)野生稻抵抗低溫環(huán)境過程。因此,這2種蛋白質(zhì)對提高水稻的耐冷性可能有著重要的作用。
非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白(Non-specific lipid-transfer protein)是植物體內(nèi)進(jìn)行脂質(zhì)轉(zhuǎn)移的小分子堿性蛋白,其廣泛參與植物病蟲害防御、角質(zhì)層合成、信號傳導(dǎo)等多種生物學(xué)功能[26]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶(Serine/threonine-protein phosphatase)是催化蛋白質(zhì)底物絲氨酸或蘇氨酸殘基去磷酸化的主要酶類,與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶協(xié)同催化蛋白質(zhì)的可逆磷酸化,共同調(diào)控植物體內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和各種生理過程。天冬氨酸蛋白酶豬籠草蛋白酶1(Aspartic proteinase nepenthesin-1)具有天冬氨酸蛋白酶類的典型特征,參與植物蛋白質(zhì)的加工和降解、細(xì)胞程序性死亡、抗病抗逆性等過程。細(xì)胞數(shù)目調(diào)節(jié)蛋白(Cell number regulator)通過控制細(xì)胞數(shù)量來調(diào)控作物、器官的大小,決定作物的產(chǎn)量。CNR1與植株和器官的大小呈負(fù)相關(guān),CNR2與植株的生長活力呈負(fù)相關(guān)[27]。低溫脅迫下,這幾種蛋白質(zhì)在耐冷性強(qiáng)的東鄉(xiāng)野生稻苗期根系中表達(dá)下調(diào),而在中嘉早17中表達(dá)上調(diào),表明這些蛋白質(zhì)可能與水稻苗期根系受低溫?fù)p傷的程度有關(guān),即損傷越嚴(yán)重,蛋白質(zhì)表達(dá)量越高。因此,低溫環(huán)境下,減少或者抑制這些蛋白質(zhì)的表達(dá)可能會減輕低溫對水稻苗期根系的傷害。
綜上,低溫脅迫下,耐冷材料東鄉(xiāng)野生稻和冷敏感水稻品種中嘉早17的苗期根系均有大量蛋白質(zhì)發(fā)生了差異表達(dá),這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)中,有的是為了維持水稻的正常生長而上調(diào)表達(dá),有的是因?yàn)樗臼艿蜏負(fù)p傷造成機(jī)體功能下降而表達(dá)下調(diào)。另外,有些蛋白質(zhì)在東鄉(xiāng)野生稻和中嘉早17中的表達(dá)趨勢不同,這可能與2種水稻的耐冷性差異有關(guān),對這些蛋白質(zhì)及相關(guān)代謝途徑的進(jìn)一步研究將有助于對水稻耐冷基因的挖掘以及耐冷機(jī)理的闡述。