劉雅潔，薛 翀，邱詩蕊，李 想，唐麗雯，曾淑華

( 四川農業(yè)大學 農學院，四川 成都 611130)

腋生分生組織(Axillary meristem,AM)起源于莖頂端分生組織(Shoot apical meristem,SAM)旁的邊界區(qū)(Boundary zone)，為植物側枝的生長和發(fā)育提供細胞來源，對植物器官發(fā)育和形態(tài)的建成極為重要[1-4]。SAM旁的邊界區(qū)通常由一些小且低分裂速率的細胞組成，與SAM干細胞區(qū)不同，這些邊界區(qū)細胞處于分化狀態(tài)，但是在早期的邊界區(qū)發(fā)育過程中，所有的邊界區(qū)細胞都會低量表達標記細胞分化狀態(tài)的SHOOTMERISTEMLESS(STM)基因，恢復未分化狀態(tài)，起始形成腋生分生組織[5]。已有研究表明，許多轉錄因子通過與激素的共同作用調節(jié)著腋芽分生組織的發(fā)育和形成。如GRAS轉錄因子中的LATERALSUPPRESSOR(LAS)/MOC/LS基因[6-8]、bHLH家族轉錄因子ROX/LAX1/BA[9-13]和Myb家族轉錄因子Blind/RAXs[14-17]等都被證實影響腋生分生組織的發(fā)育。

番茄中的Blind基因是最早用于研究腋生分生組織發(fā)育的空間標記之一，它是R2R3Myb家族的一員，Blind基因在SAM旁的邊界區(qū)域內的中央部分表達，調節(jié)腋生分生組織的形成和維持[15,17]。擬南芥中，Blind的同源基因RAX1、RAX2和RAX3的功能缺失突變體呈現(xiàn)出不同程度的側芽缺失的表型，結合rax突變體中SHOOTMERISTEMLESS(STM)基因的轉錄表達檢測結果表明，AtRAXs基因控制了腋生分生組織生長的很早的一個階段，RAX1、RAX2和RAX3在側枝發(fā)育的不同時期發(fā)揮作用，且具有部分功能冗余[14,16]。前人研究表明，番茄和擬南芥中分別有9，6個Blind同源基因，這些基因大部分與分枝發(fā)育和葉型發(fā)育相關，Blind同源基因的前118個氨基酸具有高度的保守性，C端的同源性卻較低，但是不同的物種中部分Blind同源基因的C端間卻保持了特有的同源性[17]。

盡管高等植物中腋生分生組織維持相關的轉錄因子已經(jīng)被大量發(fā)現(xiàn)和系統(tǒng)研究，但是煙草屬中只有少數(shù)的側生分生組織維持相關基因被報道[18-22]。由于普通煙草為異源四倍體，相對擬南芥等二倍體植物，其同源基因的數(shù)量通常加倍，同時存在功能冗余，只有發(fā)現(xiàn)更多相關基因才能解釋同一通路或者多個通路共同影響下的腋生分生組織形成。本研究利用同源比對法在煙草的公開測序數(shù)據(jù)中克隆煙草Blind基因，對其進行生物信息學分析和非生物脅迫下的表達分析，為后續(xù)基因功能驗證、創(chuàng)建煙草腋芽缺失植株打下基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

煙草種子K326(Nicotianatabacumcv. K326)由四川農業(yè)大學農學院提供。TRNzol總RNA提取試劑(DP405)和反轉錄試劑盒 TIANScript Ⅱ RT Kit(KR107)購自天根生化科技有限公司；EasyTaq DNA polymerase購自全式金生物科技公司；PCR引物合成和測序均由北京擎科新業(yè)生物有限公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 煙草幼苗的脅迫處理 用5%次氯酸鈉對煙草K326的種子進行表面消毒并播種于MS培養(yǎng)基上，播種后的培養(yǎng)基置于25 ℃的光照培養(yǎng)室內豎直培養(yǎng)14 d，然后轉入MS液體培養(yǎng)基(無糖)中繼續(xù)培養(yǎng)7 d，繼而進行模擬干旱(20% PEG-6000)、1 μmol/L ABA、200 mmol/L NaCl的非生物脅迫處理，處理的時間間隔均為0，8，16，24 h,每個處理在4個取樣點取100 mg煙苗全株用于RNA提取。

1.2.2 煙草NtBL1基因的克隆 提取K326苗期全株的總RNA，方法參照TRNzol(DP405)試劑的產品說明書；分別取2 μg總RNA合成cDNA，反轉錄引物采用oligo dT18,方法參照TIANScript Ⅱ RT Kit(KR107)的產品說明。以K326根部cDNA為模板,NtBL14F和NtBL1442R為引物，用EasyTaq DNA polymerase擴增NtBL1的CDS序列，采用普通三步法的PCR程序，瓊脂糖凝膠檢測PCR產物，并將PCR產物送出測序。

1.2.3NtBL1的半定量和qRT-PCR表達分析NtBL1基因的半定量分析。提取24 d苗期的根、全株、開花期的莖、葉、花等組織的RNA，反轉錄獲得cDNA，方法同1.2.2中cDNA的合成方法。以cDNA為模板，NtBL1-qF和NtBL1-qR為引物擴增NtBL1的部分CDS序列，PCR產物大小約為150 bp,且引物設計跨內含子，采用煙草的ACTIN2為對照(引物為NtActinqF/R，序列見表1)，瓊脂糖凝膠電泳檢測產物。

NtBL1基因的qRT-PCR表達分析。提取非生物脅迫處理后的K326幼苗RNA,反轉錄獲得cDNA，以此cDNA為模板，NtBL1-qF/qR為引物進行相對定量分析，對照采用煙草ACTIN2為對照(引物為NtActinqF/R,序列見表1)，表達差異的計算方法采用2-ΔΔCt法。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.4 NtBL1的生物信息學分析 從Sol Genomics Network、TAIR、NCBI網(wǎng)站下載煙草、擬南芥、番茄Blind同源基因的蛋白質序列，序列號分別為：絨毛狀煙草mRNA_79528_cds(N.tomBL)、林煙草mRNA_10368_cds(N.sylBL)、本生煙Niben101Scf04560g07009.1(N.benBL1)、Niben101Scf01693g01004.1(N.benBl2)、漸狹葉煙草NIATv7_g13170.t1(N.attBL)、番茄Solyc11g069030.1(blind)、Solyc06g074910.2(blind-like2)、Solyc06g074920.1(blind-like6)、Solyc09g-008250.2(blind-like1)、Solyc04g077260.2(blind-like3)、Solyc02g091980.1(blind-like7)、Solyc07g-006750.2(blind-like8)、Solyc12g008670.1(blind-like4)、Solyc08g065910.1(blind-like5)、擬南芥AT5G57620.1(MYB36)、AT5G65790.1(MYB68)、AT3G49690.1(RAX3/MYB84)、AT2G36890.2(RAX2/MYB38)、AT2G36890.1(RAX2/MYB38)、AT5G23000.1(MYB37)、AT4G37780.1(MYB87)，僅以番茄Blind、擬南芥RAX1、RAX2、RAX3 4個蛋白序列的前118個氨基酸為模板構建參考數(shù)據(jù)的隱馬爾可科夫模型，然后利用Hmmer(Hmmsearch)軟件在茄科基因組網(wǎng)站的煙草K326全基因組數(shù)據(jù)庫中檢索，獲得包括NtBL1在內的14條氨基酸序列,序列號分別為：Nitab4.5_0001442g0010/NtBL1、Nitab4.5_0004993g0020/NtBL2、Nitab4.5_0001163g-0150、Nitab4.5_0001050g0010、Nitab4.5_0000578g-0120、Nitab4.5_0007679g0010、Nitab4.5_0003478g-0050、Nitab4.5_0006804g0010、Nitab4.5_0012173g-0010、Nitab4.5_0000063g0150、Nitab4.5_0000244g-0260、Nitab4.5_0001074g0040、Nitab4.5_0003781g-0060、Nitab4.5_0004621g0030。

利用ProtParam(ExPASy)在線分析軟件分析NtBL1蛋白的理化性質；運用TMHMM和TMpred(ExpASy)進行基因的跨膜結構分析；利用PROSITE(ExPASy)對NtBL1進行蛋白質結構域分析；利用Sopma和Swissmodel分別預測蛋白二級結構和三級結構；用MEME軟件對NtBL1及其同源蛋白分別進行了蛋白結構分析；利用ClustralW和DNAMan軟件對氨基酸序列進行比對與分析，采用Mega 7.0 軟件Neighbor-Joining構建系統(tǒng)進化樹，Bootstrap設置1000次。

2 結果與分析

2.1 煙草NtBL1的克隆

以煙草K326的24 d苗期根部cDNA為模板，NtBL14F/NtBL1442R為引物進行PCR擴增，電泳結果顯示在1 000 bp附近擴增得到目的大小的條帶(圖1)，將PCR產物送出測序獲得1 014 bp的測序序列，將測序結果與茄科基因組網(wǎng)站(http://www.Solgenomics.net//)上下載的NtBL1(序列號：Nitab4.5_0001442g0010)序列進行比對，結果顯示序列一致。

M.1 kb DNA Marker.

2.2 煙草NtBL1基因及其同源基因的表達分析

對茄科基因組網(wǎng)站(Sol Genomics Network)上的煙草轉錄組數(shù)據(jù)進行分析，表明NtBL1基因在52 d的煙苗地上部分、根和莖頂端中均有表達，但在根中的表達量顯著高于地上部分和莖頂端(圖2)；同時，對不同部位的煙株進行半定量PCR的結果同樣顯示，NtBL1基因在24 d苗期全株、苗期根、成熟期的花序、葉、莖中均有表達，但苗期全株和根中NtBL1的轉錄水平表達量明顯高于花和葉(圖3)。綜合結果表明，NtBL1基因在普通煙草的多個時期和部位普遍表達，且在根中的表達量較高。

不同小寫字母表示差異達到顯著水平(P<0.05)。 Different lowercase letter show significant difference(P<0.05).

2.3 煙草NtBL1蛋白質結構的生物信息學分析

2.3.1 NtBL1蛋白質的理化性質和跨膜結構分析 用ProtParam(ExPASy)在線分析了煙草NtBL1蛋白的理化性質，該蛋白含有337個氨基酸，其中天冬酰胺(Asn)含量最高，占比12.8%，其分子質量為3.8 ku， pI值為8.46，有 29個帶負電荷的氨基酸殘基和33個帶正電荷的氨基酸殘基，蛋白質的不穩(wěn)定系數(shù)和平均總親水性系數(shù)分別為52.96和-0.84，屬于不穩(wěn)定的親水性蛋白。利用TMHMM和TMpred(ExpASy)進行基因的跨膜結構分析均表明NtBL1不存在跨膜結構。

圖3 NtBL1在不同組織中的表達分析Fig.3 Analysis of relative expression of NtBL1 in different tissues

2.3.2 NtBL1蛋白二級、三級結構預測 利用PROSITE(ExPASy)和DNAMan進行結構域分析發(fā)現(xiàn)NtBL1的氨基酸序列包含2個Myb-type HTH DNA-binding domian，分別位于9-62，63-117的氨基酸區(qū)段，DNA結合區(qū)分別位于38-61和90-113的2個區(qū)段(圖4)。利用Sopma進行蛋白質二級結構分析表明，62.61%的氨基酸組成了無規(guī)則卷曲(Random coil)，21.07%的氨基酸組成了α-螺旋(Alpha helix)，13.35%的氨基酸參與組成延伸鏈(Extended strand)，2.97%的氨基酸參與組成β-轉角(Beta turn)(圖5-A)。利用Swissmodel預測得到NtBL1蛋白的三級結構(圖5-B)，與二級結構結果較為一致，表明NtBL1蛋白高級結構主要由無規(guī)則卷曲和α-螺旋組成。

圖4 部分煙草屬、番茄和擬南芥中Blind同源基因的多序列比對Fig.4 Multiple sequences alignment of Blind homologues in several Nicotiana species,Tomato and Arabidopsis

2.3.3 NtBL1蛋白的同源性分析 從茄科基因組網(wǎng)站(Sol Genomics Network)和擬南芥網(wǎng)站(TAIR)上分別下載番茄、普通煙草K326和擬南芥的Blind/RAX同源蛋白序列，通過ClustalW進行多序列比對，然后用Mega 7.0軟件構建系統(tǒng)進化樹，同時利用MEME網(wǎng)站分析上述序列的模體結構(圖6)。結果顯示，NtBL1序列與番茄中的BL、Blind-like2、Blind-like6聚合在一起，且這些序列共同含有模體1,2,3,15，大部分含有模體5,8,9,11,12，相似的模體結構預示著番茄和煙草中BL同源基因可能擁有類似的功能，如NtBL1基因可能在煙草分支發(fā)育過程中起重要的調控作用。

A.NtBL1二級結構預測圖；B.NtBL1的三級結構預測圖。 A.Secondary structure of NtBL1；B.Tertiary structure of NtBL1.

利用DNAMan軟件計算NtBL1與番茄、擬南芥和部分煙屬Blind同源序列間的氨基酸相似度發(fā)現(xiàn)(圖4)，NtBL1基因與林煙草、絨毛煙草BL同源基因的蛋白序列同源性分別高達99.7%和97.3%,說明NtBL1來源于林煙草基因組；NtBL1基因與本生煙和漸狹葉煙草中3個Blind同源基因的全長氨基酸序列同源性為95.85%～96.13%，前118個氨基酸的同源性為98.28%～99.14%，證明Blind基因在煙屬植物中普遍存在且序列保守程度高；NtBL1與番茄Blind的前118個氨基酸序列(Myb結構域)同源性為92.31%，與擬南芥RAXs的前118個氨基酸序列的同源性為82.05%～86.32%，進一步證實了NtBL1是番茄Blind基因在普通煙草中的同源基因之一。

圖6 NtBL1系統(tǒng)進化樹和模體分析Fig.6 The phylogenetic tree analysis and Motif prediction of NtBL1

2.4 非生物脅迫下NtBL1基因的表達分析

用qRT-PCR檢測3種非生物脅迫處理下NtBL1基因的表達情況(圖7)，在ABA處理后，NtBL1基因的表達量在8 h時下調至對照的0.25倍，但是在隨后的24 h內表達量隨著時間延長而增加，最大值在24 h時出現(xiàn)，為對照的3.57倍。在NaCl處理后，NtBL1基因的表達量24 h內出現(xiàn)下調，最低值在24 h時出現(xiàn)，為對照的0.19倍。在PEG-6000處理后，NtBL1基因的表達量在24 h內與對照相比并未出現(xiàn)顯著性差異。結果表明，NtBL1基因的表達受ABA處理的誘導，受NaCl處理的抑制，但是不受PEG-6000處理的影響。

圖7 NtBL1在3種非生物脅迫下的相對表達量分析Fig.7 Analysis of relative expression of NtBL1 under three abiotic stresses

3 討論

普通煙草是一種重要的葉用經(jīng)濟作物，為了收獲高品質的煙葉制品，生產中通常采用人工打頂抹杈或者化學抑芽劑的方法去除腋芽，但是前者勞動強度大，后者對煙葉質量和環(huán)境均有不良影響，生物技術抑芽被公認為一條重要的探索途徑，因此，對腋芽分化相關基因的克隆和功能研究極為重要。但是長期以來，普通煙草中相關遺傳機制研究進展較慢。

本研究從普通煙草K326中克隆得到1個NtBL1基因的CDS序列，該基因全長1 014 bp,編碼337個氨基酸。NtBL1蛋白與林煙草、絨毛狀煙草、本生煙和漸狹葉煙草中的BL的同源性較高，說明其在煙草屬中的進化相對保守。Blind基因在高等植物中普遍存在，且其N端具有高度保守的118個氨基酸殘基，但是C端的序列卻按結構和功能的不同而分別聚類[17]，本研究中對番茄、擬南芥和煙草的Blind同源序列的蛋白結構分析驗證了這種保守性以及不同進化分支在C端蛋白模體結構上的高度一致性。NtBL1蛋白前118個氨基酸序列與擬南芥和番茄中的Blind/RAX蛋白的同源性高達82.05%～92.31%，且與番茄Blind及其同源蛋白Blind-like2/C、Blind-like6有相似的蛋白模體結構和較近的進化距離，Blind和Blind-like2/C分別調控番茄的分枝發(fā)育和葉型結構，均參與到的分生組織的邊界區(qū)域建立相關的通路中[17]，預示著NtBL1基因可能也參與了分生組織邊界區(qū)建立相關的進程。

本研究利用半定量PCR分析NtBL1在煙草苗期和成熟期不同組織中的表達水平，結果顯示了其在多時期各部位均有表達，在根中的表達量最高，這與前人研究中擬南芥RAX2和RAX3的表達模式類似，但與番茄Blind的表達模式不完全相同，提示四倍體煙草基因組的復雜性，二倍體番茄和擬南芥中Blind/RAX基因在煙草中的同源基因可能存在多個，部分可能如番茄中Blind-like6基因一樣，為無功能的假基因[17]，系統(tǒng)進化樹分析結果部分驗證了這個猜想，與番茄Blind、Blind-like2、Blind-like6基因聚合在同一分支上的普通煙草Blind同源序列共計4個，其中包括NtBL1。在后續(xù)研究過程中，應該對煙草中剩余的13個Blind同源序列進行克隆，全面描述煙草Blind同源基因在腋芽分化過程中的功能。

部分與分支發(fā)育相關的基因同時參與植物非生物脅迫下的抗逆性，如AtRAX1/MYB37的超表達會影響一系列ABA應答相關基因的表達，同時超表達轉化植株對外源ABA表現(xiàn)出超敏感表型，但是卻能提高其耐旱性[23]。因此，本研究采用了3種非生物脅迫處理以研究NtBL1在脅迫處理下的應答，在不同的脅迫處理下，該基因的表達情況不同，推測NtBL1基因在不同的逆境條件下應答機制不同，同樣仍不能排除NtBL1在對不同脅迫處理下是否存在翻譯水平的不同響應，或者蛋白間的互作。因此，為了進一步明確NtBL1在腋芽分化和對抗非生物脅迫逆境的具體機制，預計構建NtBL1基因敲除和超表達載體，繼而對林煙草和普通煙草進行遺傳轉化獲得轉基因植株，通過對轉基因植株的遺傳分析進一步明確NtBL1的功能。