崔曉霞，趙 碩，郭書(shū)巧，束紅梅，何曉蘭，倪萬(wàn)潮，鞏元勇，劉來(lái)華

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所，江蘇 南京 210014；2.教育部植物與土壤互作重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)資源、環(huán)境及糧食安全中心，北京 100193)

植物谷氨酸受體(Glutamate receptors-like receptors，GLRs)最早是Lam等[1]于1998年在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的，通過(guò)序列的同源性分析獲得20個(gè)與動(dòng)物離子型谷氨酸受體(Ionotropic glutamate receptors, iGLuRs)同源的基因，命名為AtGLRs。隨后在多個(gè)不同植物中有關(guān)于谷氨酸受體基因家族的報(bào)道。在水稻基因組中都發(fā)現(xiàn)有同擬南芥谷氨酸受體高度同源的24個(gè)OsGLRs基因[2]，Aouini等[3]鑒定出番茄基因組中包含13個(gè)SlGLRs基因，蘋果基因組中鑒定出32個(gè)MdGLRs基因[4]。

目前，已有多個(gè)植物GLRs基因的分子生理功能獲得解析，作為模式植物擬南芥的AtGLRs基因研究的相對(duì)較多[5]，其他植物也有報(bào)道。根部的AtGLR3.2和AtGLR3.4主要在韌皮部表達(dá)，AtGLR3.2和AtGLR3.4缺失突變體表現(xiàn)出有大量側(cè)根原基出現(xiàn)，推測(cè)和這2個(gè)基因相關(guān)的離子通道可能通過(guò)韌皮部的Ca2+信號(hào)調(diào)控側(cè)根的生長(zhǎng)[6]。Kang等[7]研究表明，AtGLR1.1參與擬南芥的ABA生物合成和C/N代謝以此調(diào)控種子的萌發(fā)，AtGLR1.1還參與了擬南芥的水分調(diào)節(jié)[8]。Zheng等[9]研究證實(shí)，AtGLR1.2和AtGLR1.3通過(guò)調(diào)控茉莉酸信號(hào)途徑增強(qiáng)擬南芥的耐寒性。Kong等[10]的研究結(jié)果表明，在種子萌發(fā)過(guò)程中AtGLR3.5上調(diào)表達(dá)促進(jìn)胞質(zhì)Ca2+濃度的增加，從而抑制ABI4的表達(dá)，達(dá)到促進(jìn)種子萌發(fā)的作用。Cho等[11]發(fā)現(xiàn)AtGLR3.1在葉片的保衛(wèi)細(xì)胞中表達(dá)，超表達(dá)AtGLR3.1基因?qū)⒂绊懕Ｐl(wèi)細(xì)胞對(duì)Ca2+信號(hào)的接收或轉(zhuǎn)導(dǎo)。AtGLR3.4基因在植株受到外界機(jī)械損傷刺激時(shí)表達(dá)量會(huì)增加3～6倍，細(xì)胞質(zhì)中酸中毒也可以誘導(dǎo)該基因的上調(diào)表達(dá)[12]，這些研究結(jié)果表明,AtGLR3.4基因可能參與了植物的抗逆反應(yīng)。Li等[13]研究報(bào)道，OsGLR3.1在維持水稻根尖分生組織細(xì)胞活力的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。小蘿卜RsGLuR基因在擬南芥中超表達(dá)，可以提高植株抗真菌感染的能力[14]。

大豆是全世界種植面積最大的豆科植物，根瘤菌與大豆共生的生物固氮作用是世界農(nóng)業(yè)非常重要的組成部分，此外大豆還是世界范圍內(nèi)動(dòng)物飼料蛋白和食用油的重要植物來(lái)源。2010年，大豆栽培品種美國(guó)的Williams 82(Glycine_max_v2.0) 基因組序列公布[15]，并成為當(dāng)前參考應(yīng)用最多的大豆基因組序列。最近，我國(guó)科學(xué)家對(duì)國(guó)審大豆品種中黃13的基因組(Gmax_ZH13) 進(jìn)行從頭組裝，最終得到1.025 Gb的基因組序列，包含20條染色體和1條葉綠體[16]。這些大豆基因組測(cè)序工作的完成為大豆基因的基礎(chǔ)性研究提供了很好的參考條件，很多大豆的基因家族在基因組中被鑒定和發(fā)掘，但是還沒(méi)有關(guān)于大豆GmGLRs基因相關(guān)信息的研究報(bào)道。本研究也是參考Williams 82(Glycine_max_v2.0) 基因組序列，在全基因組層面鑒定出GmGLRs基因，并就這些基因從生物信息學(xué)角度進(jìn)行分析，同時(shí)也研究了它們的組織表達(dá)模式，為深入研究該家族成員的分子生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 GmGLRs基因的鑒定及序列分析

在TAIR(http://www.arabidopsis.org)獲取擬南芥AtGLRs的基因序列，以擬南芥的序列為探針在Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!infoalias=Org_Gmax)大豆基因組(Wm82.a2.v1)Blast，搜索獲得E值小于e-10的相似性序列，將獲得的序列(大豆和擬南芥)在InterProscan5 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)在線分析功能結(jié)構(gòu)域存在情況，最終確定目標(biāo)序列。序列的轉(zhuǎn)錄名稱、編碼區(qū)長(zhǎng)度、CDS序列長(zhǎng)度、外顯子個(gè)數(shù)均在Phytozome獲得；利用ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)在線分析獲得GmGLRs基因蛋白氨基酸序列的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等基本信息。

1.2 GmGLRs基因染色體定位

通過(guò)大豆基因組數(shù)據(jù)庫(kù)Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)獲得GmGLRs基因在大豆染色體上的位置信息，用Map Inspect軟件繪制基因的染色體物理分布圖。

1.3 GmGLRs基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

GmGLRs蛋白質(zhì)氨基酸序列在Phytozome獲得，擬南芥AtGLRs蛋白序列在TAIR上獲取，用Mega 6 軟件采用Neighbor-Joining構(gòu)建大豆GmGLRs和擬南芥AtGLRs蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，校驗(yàn)參數(shù)Bootstrap=1 000。

1.4 GmGLRs基因結(jié)構(gòu)和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

采用GSDS(Gene Structure Dispely Server，http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)在線繪制大豆GmGLRs基因結(jié)構(gòu)圖[17]；大豆GmGLRs蛋白序列的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)在TMHMM Server v. 2.0;http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM在線進(jìn)行。

1.5 GmGLRs基因組織表達(dá)模式分析

GmGLRs基因在花、葉、根瘤、豆莢、根、根毛、種子、頂端生長(zhǎng)點(diǎn)、莖等9個(gè)組織部位表達(dá)量數(shù)據(jù)(FPKM)來(lái)自Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)[18]，將獲得數(shù)據(jù)log2均一化處理后，用HemI 1.0軟件繪制GmGLRs基因表達(dá)熱圖[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmGLRs基因鑒定及序列基本信息

利用擬南芥AtGLRs基因序列在Phytozome大豆基因組(Wm82.a2.v1)Blast，共鑒定出18個(gè)GmGLRs候選基因。將這18個(gè)候選基因在InterProScan上鑒別功能結(jié)構(gòu)域，因4個(gè)結(jié)構(gòu)域IPR001638、IPR001828、IPR001320和IPR017103在擬南芥AtGLRs基因中都存在(表1)，所以最后確定17個(gè)同時(shí)具有這4個(gè)結(jié)構(gòu)域的GmGLRs基因?yàn)镚mGLR基因家族基因。

根據(jù)這17個(gè)GmGLRs基因在染色體上出現(xiàn)的先后順序分別命名為GmGLR1～GmGLR17(表2)，這些基因編碼區(qū)平均長(zhǎng)度約為4 727 bp，最長(zhǎng)的是GmGLR15的5 491 bp，最短的是GmGLR16的3 404 bp；CDS平均長(zhǎng)度為2 748 bp，最長(zhǎng)的是GmGLR7、GmGLR13和GmGLR14基因的2 844 bp，最短的是GmGLR6基因的2 409 bp；這些基因的外顯子個(gè)數(shù)除了GmGLR8基因有7個(gè)，其他都有6個(gè)外顯子。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析表明，17個(gè)GmGLRs基因的蛋白質(zhì)氨基酸序列個(gè)數(shù)平均為915個(gè)氨基酸，平均分子質(zhì)量是102.086 4 ku, 最大的是105.822 ku(GmGLR13)，最小的是91.405 ku(GmGLR5)；理論等電點(diǎn)最大的是GmGLR14的8.41，最小的是GmGLR8的6.17。只有GmGLR8的等電點(diǎn)小于7，說(shuō)明該蛋白編碼弱酸性蛋白，將在亞細(xì)胞環(huán)境為酸性的條件下發(fā)揮功能[19]。

表1 InterPro 結(jié)構(gòu)域在大豆和擬南芥GLRs蛋白中的分布Tab.1 InterPro domains found in GmGLRs and AtGLRs

表2 GmGLRs基因家族基本信息Tab.2 Basic information of GmGLRs gene family of soybean

2.2 GmGLRs基因染色體定位分析

根據(jù)基因位置信息，將鑒定出的17個(gè)GmGLRs基因定位在大豆的10條染色體上，定位結(jié)果如圖1所示。這些基因在染色體上呈現(xiàn)不均勻分布，第9號(hào)和第12號(hào)染色體上各有3個(gè)GmGLRs基因，第6號(hào)、第7號(hào)和第13號(hào)染色體上各有2個(gè)GmGLRs基因，第1號(hào)、第4號(hào)、第11號(hào)、第14號(hào)和第16號(hào)染色體上都只有1個(gè)GmGLR基因。其中，第7號(hào)、第9號(hào)、第12號(hào)和第13號(hào)染色體的GmGLRs基因呈簇存在。

圖1 GmGLRs基因的染色體定位Fig.1 The chromosomal positions of GLRs gene in soybean

2.3 GmGLRs基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了分析GmGLRs基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，利用GmGLRs蛋白質(zhì)序列同擬南芥的AtGLRs蛋白質(zhì)序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖2所示。擬南芥AtGLRs基因分成3個(gè)亞家族，第一亞家族4個(gè)基因，第二亞家族和第三亞家族分別是9，7個(gè)基因。GmGLRs有GmGLR5和GmGLR62個(gè)基因同擬南芥第二亞家族聚在一起，其他的15個(gè)GmGLRs基因同擬南芥第三亞家族聚在一起，沒(méi)有基因與擬南芥第一亞家族聚在一起。從進(jìn)化樹(shù)末端聚類可以看出，17個(gè)GmGLRs基因存在8對(duì)同源基因，只有GmGLR16單獨(dú)一個(gè)分支。

圖2 大豆與擬南芥GLRs蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 The phylogenetic tree of GLRs protein in soybean and Arabidopsis

2.4 GmGLRs基因結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)搜索鑒定獲得17個(gè)GmGLRs基因的基因組編碼區(qū)序列和CDS序列，用GSDS 2.0軟件在線繪制GmGLRs基因結(jié)構(gòu)圖，同時(shí)分析這17個(gè)GmGLRs基因的外顯子和內(nèi)含子情況?？傮w來(lái)看，除GmGLR8基因，其他16個(gè)GmGLRs基因都包含6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子(圖3)。從外顯子的長(zhǎng)度分析保守性，保守性較高的外顯子依次為E4、E3、E5，E4長(zhǎng)度為32 bp的基因有14個(gè)，E3長(zhǎng)度為278 bp的基因有13個(gè)，E5長(zhǎng)度為407 bp的基因有9個(gè)(表3)。同源基因在基因結(jié)構(gòu)上也表現(xiàn)出高度一致，其中GmGLR1和GmGLR10、GmGLR12和GmGLR15、GmGLR13和GmGLR14，所對(duì)應(yīng)的外顯子長(zhǎng)度都一樣；GmGLR2和GmGLR3、GmGLR7和GmGLR17，除E6以外的其他外顯子長(zhǎng)度是一樣的；GmGLR4和GmGLR11，除E1和E6以外的外顯子長(zhǎng)度是一樣的；同源基因長(zhǎng)度不同的外顯子差異也不大，所對(duì)應(yīng)的內(nèi)含子的長(zhǎng)度差別也不大(表3)。GmGLR8基因結(jié)構(gòu)差異的原因，可能是在進(jìn)化過(guò)程中，第一個(gè)外顯子插入一個(gè)內(nèi)含子造成的。

圖3 GmGLRs基因外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)示意圖Fig.3 The diagram of extron and intron structure within GmGLRs

表3 GmGLRs基因外顯子和內(nèi)含子的比較Tab.3 Comparation of exons and introns in GmGLRs genes bp

2.5 GmGLRs跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

利用TMHMM Server v.2.0 在線預(yù)測(cè)GmGLRs 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域，如表4所示，10 個(gè)GmGLRs蛋白有3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，4個(gè)GmGLRs蛋白有4 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，2 個(gè)GmGLRs蛋白有5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，1個(gè)GmGLRs蛋白有2 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。同源基因的跨膜結(jié)構(gòu)域在個(gè)數(shù)和位置上都表現(xiàn)高度一致，GmGLR2和GmGLR3、GmGLR7和GmGLR17，這3對(duì)等位基因跨膜結(jié)構(gòu)域的位置都一致；GmGLR1和GmGLR10、GmGLR12和GmGLR15，這2對(duì)等位基因?qū)?yīng)跨膜結(jié)構(gòu)域的位置只有幾個(gè)氨基酸的差異。GmGLRs 的跨膜位置多位于580-870 個(gè)氨基酸，該區(qū)域也是保守結(jié)構(gòu)域相對(duì)集中的區(qū)域，由此可見(jiàn)，跨膜結(jié)構(gòu)域在GmGLRs的生理功能上發(fā)揮重要作用。

2.6 GmGLRs基因組織表達(dá)模式分析

利用Phytozome 數(shù)據(jù)庫(kù)中GmGLRs基因的組織表達(dá)量數(shù)據(jù)(FPKM)，對(duì)GmGLRs基因在花、葉、根瘤、豆莢、根、根毛、種子、頂端生長(zhǎng)點(diǎn)、莖等9個(gè)組織部位的表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4所示。17個(gè)GmGLRs基因的表達(dá)都沒(méi)有表現(xiàn)出組織特異性的差異，但是在表達(dá)豐度上存在顯著差異，有8個(gè)基因高豐度表達(dá)，5個(gè)基因中豐度表達(dá)，4個(gè)基因低豐度表達(dá)。同源基因具有相似的表達(dá)趨勢(shì)，GmGLR7和GmGLR17、GmGLR4和GmGLR11、GmGLR12和GmGLR15、GmGLR5和GmGLR6，這些同源基因在表達(dá)豐度和不同組織部位表達(dá)量上趨于一致。從不同組織部位表達(dá)高低的角度來(lái)看，GmGLR1在葉中表達(dá)量最高，GmGLR7在種子中表達(dá)量最高，GmGLR15在根中表達(dá)量最高，GmGLR12在頂端生長(zhǎng)點(diǎn)中表達(dá)量最高，GmGLR8在花、葉和根中表達(dá)量最低，GmGLR6在根瘤、種子和頂端生長(zhǎng)點(diǎn)中表達(dá)量最低。

表4 GmGLRs蛋白跨膜域預(yù)測(cè)Tab.4 Prediction of the transmembrane regions of GmGLRs proteins

F.花；L.葉；N.根瘤；P.豆莢；R.根；RH.根毛；Se.種子；SAM.頂端生長(zhǎng)點(diǎn)；St.莖。 F.Flower;L.Leaves;N.Nodules;P.Pod;R.Root;RH.Root hair;Se.Seed;SAM.Shoot apical meristem;St.Stem.

3 結(jié)論與討論

結(jié)構(gòu)域是生物大分子中具有特異結(jié)構(gòu)和獨(dú)立功能的區(qū)域，也是蛋白質(zhì)功能單元[20]，具有相同結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)分子在理論上具有相同生物學(xué)功能的可能性最大。擬南芥AtGLRs所有的成員都具有IPR001638、IPR001828、IPR001320和IPR017103這4個(gè)結(jié)構(gòu)域，因此,在篩選其他植物基因組中GLRs的時(shí)候，也應(yīng)以此為參考[3]，所以本研究所最終確定的17個(gè)GmGLRs成員也是同時(shí)包含這4個(gè)結(jié)構(gòu)域。

擬南芥的AtGLRs基因根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化的分析結(jié)果分成3個(gè)亞家族[21]，水稻的OsGLRs基因根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化的結(jié)果分成4個(gè)亞家族，都有基因同擬南芥的3個(gè)亞家族聚類到一起，還有一個(gè)分支的7個(gè)基因有別于這3個(gè)亞家族[2]；番茄SlGLRs基因也分成3個(gè)亞家族，其中有2個(gè)亞家族同擬南芥的第二和第三亞家族聚類到一起，另一個(gè)亞家族單獨(dú)聚到一個(gè)分支[3]；蘋果的MdGLRs基因同擬南芥的系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)果一致，分成3個(gè)亞家族[4]。本研究結(jié)果顯示，大豆的GmGLRs基因只包含同擬南芥AtGLRs基因第二和第三亞家族聚類到一起基因，缺少同擬南芥AtGLRs基因第一亞家族一致的基因，而且17個(gè)GmGLRs基因有15個(gè)同擬南芥AtGLRs基因第三亞家族聚類在一起，表明大豆的GmGLRs基因在生理功能上可能更趨同于擬南芥AtGLRs基因第三亞家族。

先前的研究表明，植物GLRs多拷貝基因通常成串地排列在同一條染色體上[2,3,22]，大豆的GmGLRs基因也表現(xiàn)出了類似的特性。大豆基因組在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生過(guò)大規(guī)模復(fù)制事件，使得大豆的很多基因表現(xiàn)出成對(duì)出現(xiàn)的分布模式[15,23-24]，大豆的17個(gè)GmGLRs基因有8對(duì)基因成對(duì)出現(xiàn)，也表現(xiàn)出了大豆基因的這一普遍規(guī)律。大豆的17個(gè)GmGLRs基因中的同源基因，不管是在基因內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)上，還是跨膜結(jié)構(gòu)域的存在形式上，以及基因組織表達(dá)模式上都表現(xiàn)出了高度一致性，表明這些基因的分子生物學(xué)功能也可能存在重復(fù)。