楊巨鵬，張登科，洪夢蓉，張慧恩，呂春霞，楊華*

1(浙江萬里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院,浙江 寧波，315100) 2(寧波海關(guān)技術(shù)中心，浙江 寧波，315020)

大黃魚(Pseudosciaenacrocea)，屬硬骨魚綱，鱸形目，為傳統(tǒng)“四大海產(chǎn)”之一，是我國近海主要經(jīng)濟魚類[1]。自20世紀70年代以來，由于酷漁濫捕，導(dǎo)致海洋中大黃魚自然資源衰退，已形不成漁汛；20世紀80年代，大黃魚人工繁育技術(shù)突破后，近海大黃魚網(wǎng)箱養(yǎng)殖迅速發(fā)展，大黃魚已成為我國規(guī)模最大的海水養(yǎng)殖魚類[2]。海灣傳統(tǒng)小網(wǎng)箱高密度養(yǎng)殖條件下，大黃魚表現(xiàn)出肥滿度升高、體色異常、體脂含量增加、肉質(zhì)松散、風(fēng)味退化等品質(zhì)下降現(xiàn)象，不能滿足部分消費者對大黃魚產(chǎn)品品質(zhì)的需求[3]，所以野生大黃魚市場價格非常高[4]。目前，為滿足消費者對高品質(zhì)大黃魚的需求，通過養(yǎng)殖技術(shù)和養(yǎng)殖模式的改進，養(yǎng)殖大黃魚的品質(zhì)、外觀已接近野生大黃魚[5]，但其市場價格也遠高于傳統(tǒng)養(yǎng)殖大黃魚。

深海養(yǎng)殖大黃魚通常作為生鮮商品流通，客戶對其鮮度和色澤等要求很高，其保質(zhì)期很短，所以在物流過程中需要良好的保障措施來保證產(chǎn)品品質(zhì)。目前國內(nèi)仍主要采用低溫保鮮技術(shù)(即冰溫保鮮)，但低溫保鮮時間短，而且在保鮮過程中水產(chǎn)品營養(yǎng)流失大，存在口感降低、營養(yǎng)價值損失等問題[6]。因此需要研究新的保鮮技術(shù)替代原有的保鮮技術(shù)，從而對產(chǎn)品實現(xiàn)更好的品質(zhì)控制。玻璃態(tài)凍藏技術(shù)為食品貯藏開辟了一條嶄新的、富有巨大潛力的道路[7]。食品處于玻璃態(tài)，一切受擴散控制的松弛過程都將被抑制，反應(yīng)速率極其緩慢甚至不會發(fā)生[8]，所以玻璃化保存可以最大限度地保持食品的品質(zhì)，玻璃態(tài)食品也常被認為是穩(wěn)定的[9]。近幾年，食品玻璃化轉(zhuǎn)變在果蔬[10-11]、淀粉類食品[12]、乳制品[13]、冷凍禽畜肉類[14]、糖果類[15]及水產(chǎn)品[16]等食品貯藏方面均有研究報道。

發(fā)生玻璃化轉(zhuǎn)變時的溫度稱為玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(glass transition temperature,Tg)，它是控制食品質(zhì)量和穩(wěn)定性的關(guān)鍵[17]。根據(jù)玻璃化轉(zhuǎn)變理論，冷凍食品最適宜的貯藏溫度T≤Tg，而當(dāng)T>Tg時，體系處于橡膠態(tài)，分子流動性增加，各種分子擴散運動控制的化學(xué)反應(yīng)加快[18]。而水產(chǎn)品中水分含量較高，其Tg太低，對其進行玻璃態(tài)保藏成本較高，水產(chǎn)品中組分較多，其玻璃化轉(zhuǎn)變也十分復(fù)雜。一般來說，Tg受食品中糖類相對分子質(zhì)量大小影響,對純物質(zhì)而言，相對分子質(zhì)量越大，Tg就越高；相對分子質(zhì)量低時，隨著相對分子質(zhì)量的增加，玻璃化轉(zhuǎn)變溫度急劇升高[18],目前國內(nèi)外也逐漸開展此方面的研究[19]。本文通過研究不同食品添加物對深海養(yǎng)殖大黃魚Tg的影響，篩選最適的復(fù)合配方，提高其Tg，降低其玻璃態(tài)保藏成本，為水產(chǎn)品的玻璃化保存技術(shù)的研究與應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

深海養(yǎng)殖大黃魚,寧波市水產(chǎn)市場，體重(500±25)g，體長(30±3)cm，用冰盒運至實驗室后進行樣品處理；麥芽糊精、低聚異麥芽糖、羧甲基纖維素(CMC)、海藻糖、海藻酸鈉、乳酸鈉、檸檬酸鈉均為BR級,源葉生物有限公司。

PL2002電子分析天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；131EVO差示掃描微量熱儀,法國塞塔拉姆；ALPHA2-4冷凍干燥儀，上海實維實驗儀器技術(shù)有限公司；S-3400N掃描電鏡，日本株式會社日立制作所。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

深海養(yǎng)殖大黃魚去鱗、去皮，取背部魚肉，放置高速組織搗碎機中制為魚糜。每50 g魚肉為1組，每組3個平行；稱取不同組別的大分子添加劑，按參考文獻[20]選取麥芽糊精、低聚異麥芽糖、羧甲基纖維素(CMC)、海藻糖、海藻酸鈉、乳酸鈉、檸檬酸鈉作為添加劑。

麥芽糊精：質(zhì)量分數(shù)3%，6%；低聚異麥芽糖：質(zhì)量分數(shù)3%，6%；羧甲基纖維素(CMC)：質(zhì)量分數(shù)3%，6%；海藻糖：質(zhì)量分數(shù)3%，6%；海藻酸鈉：質(zhì)量分數(shù)0.5%，1%；乳酸鈉：質(zhì)量分數(shù)0.5%，1%；檸檬酸鈉：質(zhì)量分數(shù)0.5%，1%。

魚糜與添加物混合均勻后真空包裝，放置4℃冰箱中平衡滲透3 h。

1.2.2 感官評定方法

將樣品放置蒸鍋中蒸制20 min，進行感官評定，評價員根據(jù)國標GB/T 16291.1—2012[21]和GB/T 16860—1997[22]進行培訓(xùn)，評定的參考標準[23]見表1。為了避免評價小組成員因各自不同嗜好等因素造成對產(chǎn)品的偏見，感官評定時需對樣品進行盲標。樣品送呈評價員之前置于20 ℃條件下進行評定測試。每次評價由每位評價員單獨進行，不互相交流，且在每個樣品評價之間用清水漱口，排除上1個樣品對下1個樣品的影響；并且設(shè)置6位評價員，3男3女；以指標得分總和的平均值為感官評分。

1.2.3 凍結(jié)點的測定方法

采用差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry,DSC)測定樣品凍結(jié)點[24]，稱取試樣5 mg，放入鋁制坩堝并壓封，放置儀器樣品盤，蓋好內(nèi)蓋，裝上冷卻罐，冷卻液為液氮。開始溫度-130 ℃，平衡時間3 min，停止溫度0 ℃，升溫速率10 ℃/min，載氣(N2)流速50 mL/min，每個樣品重復(fù)3次。參照熱分析領(lǐng)域確定熱效應(yīng)起點和終點的通常做法，DSC熱流曲線由熔融峰上升側(cè)面的拐點處作切線與基線的交點，定為試樣的凍結(jié)點。

1.2.4Tg的測定方法

采用多次掃描法[25]測定樣品Tg，稱取試樣5 mg，放入鋁制坩堝并壓封，放置儀器樣品盤，蓋好內(nèi)蓋，裝上冷卻罐，冷卻液為液氮。降溫至-130 ℃，平衡20 min。然后從-130 ℃升溫到20 ℃，升溫速率10 ℃/min，載氣(N2)流速50 mL/min，重復(fù)3次。采用DSC軟件分析熱流密度曲線，得到初始(Tgi)、中點(Tgm)和終點(Tge)的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，樣品玻璃化轉(zhuǎn)變溫度取其中點值Tgm。

1.2.5 掃描電鏡樣品處理

將樣品切成3 mm×3 mm×1 mm的薄片，放入3%的戊二酸溶液在4 ℃溫度下固定24 h，倒掉固定液，用0.1 mol/L的磷酸緩沖液漂洗樣品3次，每次15 min；用質(zhì)量分數(shù)1%鋨酸溶液固定樣品1 h，倒掉固定液，用0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗樣品3次，每次15 min，依次用體積分數(shù)為30%、50%、70%、80%、90%乙醇溶液對樣品進行脫水處理[26]，每個濃度處理15 min，再用無水乙醇處理2次，每次10 min，再依次用V(無水乙醇)∶V(叔丁醇)混合液(3∶1、1∶1、1∶3)處理10 min，再用叔丁醇處理樣品10 min，加適量叔丁醇，放入-70 ℃冰箱2 h，然后放入冷凍干燥機干燥48 h，樣品黏貼，真空離子濺射鍵白金膜，處理好的樣品進行電子顯微鏡觀察，拍攝樣品橫切面的500倍掃描圖像。

1.2.6 Box-Behnken實驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果進行4因素3水平的Box-Behnken中心組合設(shè)計試驗。選取Tg作為響應(yīng)值，優(yōu)化添加劑配方。

1.2.7 統(tǒng)計分析

試驗設(shè) 3～5個平行，數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，使用SPSS Statistics 17軟件進行差異性顯著分析，其中P<0.05差異顯著，P>0.05 差異不顯著，使用Office excel 2003軟件進行數(shù)據(jù)處理及繪圖；采用DSC軟件分析熱流密度曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗與結(jié)果

2.1.1 不同添加劑對深海養(yǎng)殖大黃魚肉感官的影響

根據(jù)相關(guān)文獻[20]并參考《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》(GB 2760—2014)[27]，選取麥芽糊精、低聚異麥芽糖、羧甲基纖維素(CMC)、海藻糖、海藻酸鈉、乳酸鈉、檸檬酸鈉作為添加劑，以感官評價作為測定指標，初步篩選出合適的添加劑。

由圖1可得，空白組感官評分最佳(32.25±0.96)且差異性顯著，說明添加物本身會影響魚糜的口感；部分實驗組略低于空白組，如3%海藻糖組(30.75±1.25)和3%麥芽糊精組(29.50±1.29)，這2組和空白組相比，感官評定差別不大，僅帶有略微的甜度；6%海藻糖組(29.25±0.96)、0.5%乳酸鈉組(28.75±1.71)、1%乳酸鈉組(28.50±0.58)、6%麥芽糊精(28.00±0.82)、0.5%檸檬酸鈉(24.75±0.96)組感官評分都有所下降，不過都尚可接受。其余實驗組存在感官評定某項評分過低的問題，如低聚異麥芽糖組存在蛋白變性嚴重，口感粗糙的問題；CMC組口感難以接受，海藻酸鈉組無肉質(zhì)感，且出現(xiàn)糊化現(xiàn)象，均不適合作為深海養(yǎng)殖大黃魚肉的添加劑。為了進一步篩選出復(fù)合添加劑配方，故選取海藻糖、乳酸鈉、麥芽糊精、檸檬酸鈉進行下一步試驗。

2.1.2 不同濃度添加劑對深海養(yǎng)殖大黃魚魚肉凍結(jié)點和Tg的影響

食品凍結(jié)點是對食品物料進行凍藏、運輸、加工、銷售中需要了解和控制的參數(shù)之一，物料在凍結(jié)過程中，存在“最大冰晶生成帶”，由于生成大量冰晶，組織受損嚴重，造成食品品質(zhì)下降[28]，但如果冷卻速度足夠快或難以形核，以至于液體來不及成核和長大，即使到了熔點以下也仍然保持高溫時的狀態(tài)，即液體凝固通過另一條途徑進入過冷狀態(tài)，即可生成玻璃體[29]，因此凍結(jié)時通過“最大冰晶體生成帶”的時間短，則品質(zhì)會更好。

由圖2～圖5可知，添加海藻糖、乳酸鈉、麥芽糊精、檸檬酸鈉均會降低樣品的凍結(jié)點，且隨著添加量的增加，凍結(jié)點降低的越多，與空白對照相比，1%乳酸鈉降低了2.64 ℃，5%海藻糖降低了3.81 ℃，0.5%檸檬酸鈉降低了2.82 ℃，5%麥芽糊精降低了5.04 ℃，可能是因為樣品基質(zhì)濃度變大，凍結(jié)點降低，這與康彥[30]的研究結(jié)果一致。添加海藻糖、乳酸鈉、麥芽糊精、檸檬酸鈉均能提高樣品Tg值，且隨著添加量的增加，Tg值提高的越多；其中添加海藻糖和麥芽糊精對提高樣品Tg有較好的作用，5%海藻糖組Tg值提升至(-90.12±0.27)℃。

5%麥芽糊精組提升至(-95.52±0.29)℃，1%乳酸鈉提升至(-102.21±0.24)℃，0.5%檸檬酸鈉提升至(-100.19±0.43)℃?？赡苁翘砑游锱c水之間或者相鄰大分子之間存在相互作用，從而使得分子擴散變?nèi)鹾蜏p慢，改變物質(zhì)體系的性狀，提高體系的Tg。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化添加劑配方

為研究添加物與Tg值之間的關(guān)系，優(yōu)化獲得最佳添加物復(fù)合配方，根據(jù)Box-Benhnken模型的中心組合試驗設(shè)計原理，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，進行4因素的響應(yīng)面試驗，響應(yīng)面因素編碼及水平見表2，試驗結(jié)果見表3。

利用方差分析可以得到各個數(shù)據(jù)之間的顯著差異。運用Design-Expert 8.0程序?qū)Ω髟囼烖c的響應(yīng)值進行最小二乘法擬合回歸，得到二次多元回歸方程模型為：Tg=-80.35+2.56×A+9.67×B+11.08×C+1.66×D-1.35×A×B+0.74×A×C-4.64×A×D+5.69×B×C+4.97×B×D-4.03×C×D+3.77×A2-6.57×B2-2.52×C2+1.34×D2

對模型進行方差分析，所得結(jié)果見表4。

注：模型R2=0.976 3，Radj=0.9526，*P<0.05，**P<0.01

由表4可以看出F模型=41.226 1>F0.01(14,14)=3.698，P模型<0.000 1，表明回歸模型極顯著性，預(yù)測試驗結(jié)果的誤差很小，所得二次回歸方程高度顯著。此外，由模型R2=0.976 3，Radj=0.952 6可知，模型可以解釋97.63%的響應(yīng)值的變化，模型擬合度高，能較好地描述各影響因素對Tg的影響，從一定意義上證實本試驗方法的可靠性。由表4得海藻糖和麥芽糊精(BC)交互作用最為顯著(P<0.01)，這與胡慶蘭[20]的研究結(jié)論相同；其余因素間也存在交互作用，其中乳酸鈉和檸檬酸鈉(AD)、海藻糖和檸檬酸鈉(BD)、麥芽糊精和檸檬酸鈉(CD)交互作用均為非常顯著(P<0.01)，但乳酸鈉和海藻糖(AB)、乳酸鈉和麥芽糊精(AC)交互作用均不顯著(P>0.05)，各因素間交互作用見圖6。

模型計算得到添加劑理論最優(yōu)組合設(shè)計為0.2%乳酸鈉、4%海藻糖、4.0%麥芽糊精、0.3%檸檬酸鈉；模型方程預(yù)測Tg值為-52.61 ℃。為驗證響應(yīng)面法的可行性，采用此配方進行驗證實驗，采用3次平行試驗的Tg實際值為-53.31 ℃，與回歸方程所得預(yù)測值相對偏差在正常偏差范圍內(nèi)，表明回歸方程能較好地反映各因素對深海養(yǎng)殖大黃魚魚肉的影響，回歸模型較為可靠。由此可知，最佳食品添加劑組合為：0.2%乳酸鈉、4.0%海藻糖、4.0%麥芽糊精、0.3%檸檬酸鈉。目前國內(nèi)外此類研究也逐漸開展，如SRITHAM等[31]研究表明加入NaCit可以提高低水分生物玻璃的穩(wěn)定性?？祻30]研究表明凍藏羅非魚的Tg隨著抗凍劑添加量的增大而有所升高；SHI等[32]研究表明添加糖類尤其是菊糖與海藻糖能顯著提高南美白對蝦肉的貯藏穩(wěn)定性，延長其貨架期。

2.3 添加物質(zhì)對深海養(yǎng)殖大黃魚魚肉微觀結(jié)構(gòu)的影響

食品添加劑能改善魚糜制品的微觀結(jié)構(gòu)，原因可能是食品添加劑能與相鄰的分子緊密的包在一起，形成一種相互作用的結(jié)構(gòu)，使得分子擴散受阻，分子變性和分子運動非常微弱，從而使得食品能夠維持原來良好的性狀。由圖7可得，添加最佳配方添加物的樣品掃描電鏡圖(圖7-b)與空白對照組掃描電鏡(圖7-a)相比，添加組內(nèi)部結(jié)構(gòu)緊密、均勻、表面平整，無明顯空洞，而空白組有較大的空洞，組織比較松散，說明添加物可以與樣品蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)作用，使得凝膠更為致密，因此可以改善制品的凝膠強度。表明食品添加劑可能與魚肉制品中的生物大分子物質(zhì)(蛋白質(zhì)、糖、脂肪)等相互作用，提高了魚肉制品的Tg。

3 結(jié)論

實驗結(jié)果表明，最佳食品添加劑組合為：0.2%乳酸鈉，4.0%海藻糖，4.0%麥芽糊精，0.3%檸檬酸鈉?？梢杂行岣邩悠返腡g，可為后來以超低溫冰箱代替?zhèn)鹘y(tǒng)液氮玻璃態(tài)儲藏提供理論支持，可以降低其玻璃態(tài)保藏的成本，提高普及化。食品是多相、多組分、非均質(zhì)，而水產(chǎn)品相較于果蔬等食品在物理化學(xué)性質(zhì)方面更不穩(wěn)定的，通過深入研究玻璃化轉(zhuǎn)變與食品貯藏加工中發(fā)生的一系列品質(zhì)變化機理關(guān)系，結(jié)合水動力學(xué)和玻璃化動力學(xué)形成一定的理論基礎(chǔ)。將玻璃化轉(zhuǎn)變溫度與水分含量和水分活度、黏度等重要的臨界參數(shù)和現(xiàn)有的技術(shù)手段相結(jié)合考慮，來實現(xiàn)真正的玻璃化保存，同時找到更好的抗凍劑及制冷劑來降低玻璃態(tài)保鮮的成本，方便其在食品保藏領(lǐng)域的推廣。