楊莉，宋楊，徐曉義，張存勝*

1(江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實驗室，江蘇 南京，210042) 2(江蘇大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江，212013)

生物氫氣因其高燃燒熱值、無污染等優(yōu)點(diǎn)，是未來極具發(fā)展前景的能源載體[1]。與其他生物制氫方法(如光發(fā)酵、微生物電解池(microbial electrolysis cells,MEC等)相比，生物暗發(fā)酵具備低成本和高氫氣產(chǎn)率等優(yōu)勢，該方法是通過微生物將生物質(zhì)大分子物質(zhì)分解成揮發(fā)性脂肪酸進(jìn)而轉(zhuǎn)化為氫氣。利用生物質(zhì)廢棄物產(chǎn)氫，一方面能夠解決生物質(zhì)廢棄物引起的環(huán)境污染問題，另一方面，能夠回收生物質(zhì)能，緩解能源緊張局面[2]。因此，生物暗發(fā)酵制氫備受多國政府和能源公司關(guān)注。

酒糟是白酒生產(chǎn)中最主要的副產(chǎn)物，據(jù)統(tǒng)計,中國酒糟年產(chǎn)量約為4×107t，且呈增加趨勢[3]。目前，酒糟主要用于焚燒和飼料化，但焚燒易污染環(huán)境,飼料化難以被廣泛使用，因此酒糟處理是許多釀酒企業(yè)的難題[4]。酒糟的化學(xué)成分為纖維素類物質(zhì)、少量淀粉和蛋白質(zhì)等[5]，若要實現(xiàn)其生物氫氣轉(zhuǎn)化，需首先通過預(yù)處理將纖維素物質(zhì)轉(zhuǎn)化為微生物可直接利用的糖，常用的預(yù)處理方法有物理法、化學(xué)法和生物法等[6]，目前報道尚無有效的高粱酒糟糖化方法，且缺乏對糖化液生物氫氣轉(zhuǎn)化性能研究。本研究探究了酸法、堿法和酶法、酸-酶耦合、堿-酶耦合法5種預(yù)處理方法對酒糟糖化的影響并考察了糖化液暗發(fā)酵制氫性能，以期充分回收高粱酒糟的生物質(zhì)能。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

酒糟由湖北武漢某酒廠提供。產(chǎn)氫菌Clostridiumbeijerinckii購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

富集培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸粉1，蛋白胨 3，葡萄糖 2，沸水浴充入N2除氧20 min，自然pH，滅菌121 ℃，20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基1 L，其中含：酵母浸粉 1 g，葡萄糖 2 g，KH2PO45 g，K2HPO44 g，NH4Cl 1.6 g；微量元素1 mL(MgSO420 g/L，MnSO41 g/L，NaCl 1 g/L，F(xiàn)eSO41 g/L)；維生素1 mL(對氨基苯甲酸 1 g/L，生物素 0.1 g/L，維生素B11 g/L)。

1.2 儀器與設(shè)備

SOP電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；HYL-C組合式搖床，太倉市強(qiáng)樂實驗設(shè)備有限公司；GC-2010 plus氣相色譜儀，上海精密科學(xué)有限公司；Agilent 7890B氣相色譜儀，美國惠普公司；SU8010場發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本日立科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酒糟預(yù)處理

(1)酸法：固(以揮發(fā)性固形物(volatility solids,VS)為基準(zhǔn))液比為1∶10(g∶ mL)，加入0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH為1，常溫攪拌24 h。

(2)堿法：固液比為1∶10(g∶mL)，加入15%(質(zhì)量濃度)NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為12，常溫攪拌6 h。

(3)酸-酶耦合法：將酸處理后的酒糟pH調(diào)至4.8～5.0，加入纖維素酶4 000 U/g，50 ℃酶解72 h。

(4)堿-酶耦合法：將堿處理后的酒糟pH調(diào)至4.8～5.0，加入纖維素酶4 000 U/g，50 ℃酶解72 h。

(5)單酶法：固液比(g∶mL)分別為1∶15和1∶4時，pH調(diào)至4.8～5.0，纖維素酶添加量為4 000 U/g，50 ℃酶解72 h。

(6)雙酶耦合法：固液比分別為1∶15和1∶4時，pH調(diào)至4.8～5.0，纖維素酶添加量為4 000 U/g酶解8 h后，沸水浴加熱20 min，纖維素酶滅活，調(diào)pH至6.0，再加入淀粉酶100 U/g，50 ℃酶解4 h。

1.3.2 不同預(yù)處理方式酒糟暗發(fā)酵產(chǎn)氫試驗

將1.2.1(5)和(6)酶處理糖化液用于暗發(fā)酵產(chǎn)氫，各取50 mL糖化液于100 mL西林瓶中，加入緩沖液、微量元素等，沸水浴充入N2除氧20 min，121 ℃滅菌20 min。冷卻后用無菌濾膜加入維生素。接種10%(體積分?jǐn)?shù))的Clostridiumbeijerinckii，置于37 ℃、180 r/min轉(zhuǎn)速下發(fā)酵3 d。

1.4 分析方法

(1)氫氣測定

采用氣相色譜儀對氫氣進(jìn)行測定，色譜配有TCD檢測器、填充柱TDX-01，進(jìn)樣口、柱溫和檢測器溫度分別為200、180 和200 ℃。載氣為Ar，流速為30 mL/min。

(2)揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acids，VFAs)測定

采用氣相色譜儀檢測，配置氫火焰檢測器和毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm)，進(jìn)樣口和檢測器溫度分別為 240和260 ℃，柱箱溫度采用升溫程序：初溫60 ℃保持3 min，以30 ℃/min的速率升溫至90 ℃保持1 min，30 ℃/min速率升溫至165 ℃保持2 min，15 ℃/min速率升至180保持1 min，15 ℃/min速率升至230 ℃保持2 min。載氣氮?dú)?、氫氣和空氣的流速分別為30、40和300 mL/min。

(3)酒糟表面結(jié)構(gòu)分析

采用場發(fā)射掃描電子顯微鏡檢測，將處理好的樣品用雙面膠固定于掃描電鏡樣品臺上，并對樣品噴金60 s，觀察表面結(jié)構(gòu)。

(4)化學(xué)分析方法

采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定還原糖含量。采用酸水解法測定淀粉含量，參考GB 5009.9—2016。纖維素類物質(zhì)測定參考GB/T 20805—2006、GB/T 20806—2006和NY/T 1459—2007。采用凱氏定氮法測定酒糟蛋白質(zhì)含量。

(5)計算方法

還原糖產(chǎn)率Y還原糖和轉(zhuǎn)化率α以及氫氣產(chǎn)率Y氫氣分別按公式(1)～(3)計算。

(1)

式中：ρ，糖化液中還原糖質(zhì)量濃度，g/L；V，糖化液體積，mL；m，酒糟質(zhì)量，g。

(2)

式中：m1，發(fā)酵前還原糖質(zhì)量，g；m2，發(fā)酵后還原糖質(zhì)量，g。

(3)

式中：V，氫氣的體積，mL；m，酒糟質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 處理方式對酒糟糖化的影響

表1顯示了不同預(yù)處理方式對酒糟糖化的影響。酶處理、酸處理、酸-酶處理、堿處理、堿-酶處理的還原糖產(chǎn)率分別為17.21%、13.41%、13.89%、4.66%、4.82%，均高于未處理酒糟(3.9%)。還原糖產(chǎn)率的次序為：酶法>酸-酶耦合法>酸法>堿-酶耦合法>堿法。固液比為1∶15(g∶mL)經(jīng)酶處理的酒糟糖化效果最佳，還原糖產(chǎn)率為17.21%，相比未處理酒糟(3.9%)提高了341.28%。相同酶解條件下馬文鵬等[7]酒糟酶解后還原糖產(chǎn)率為16.87%，與本文最佳還原糖產(chǎn)率相近。劉浩[8]研究表明酸處理不僅能將纖維素和半纖維素組分降解為葡萄糖和木糖，而且過度酸化會產(chǎn)生糠醛、甲酸和乙酰丙酸等副產(chǎn)物，不利于還原糖產(chǎn)量的提高，且酸處理液以及糖醛等副產(chǎn)物對纖維素酶活性有一定抑制作用[9]。堿液能將木質(zhì)素降解為小片段或酚類等物質(zhì)，但不能提高還原糖產(chǎn)率。徐棟梁等[10]研究表明堿預(yù)處理后，底物的酶解效率會降低。這可能是堿法和堿-酶耦合法糖化率較低的原因。酒糟酶法處理時，高固液比1∶4(g∶mL)雖提高了酒糟預(yù)處理液的還原糖濃度(44.52 g/L)，但還原糖產(chǎn)率(14.12%)低于低固液比1∶15(g∶mL)的產(chǎn)率(17.21%)。高固液比下得到的酒糟糖化液黏度較高，添加的纖維酶難以充分與纖維素結(jié)合，不利于糖化。相反，低固液比更有利于酒糟纖維素糖化，同時有利于糖分向溶液中擴(kuò)散。這可能是低固液比下還原糖產(chǎn)率較高的原因。

注：1)固體指干酒糟所含物質(zhì)的含量。

2.2 纖維素酶法處理前后酒糟組分和結(jié)構(gòu)分析

表2顯示了低固液比下酒糟酶解前后的組分變化。酶解前后淀粉和蛋白質(zhì)含量無明顯變化，纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和還原糖成分變化明顯。原始酒糟中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的含量分別為9.37%、7.11%和11.27%，酶解后含量分別為5.00%、5.20%和7.20%，其轉(zhuǎn)化率(根據(jù)1.4(5)中公式(2)計算)分別為46.63%、26.86%和36.11%，同時原始酒糟中還原糖含量僅為3.90%，酶解后含量為17.21%，提高了341.28%。任海偉等[11]研究表明，酶解后纖維素轉(zhuǎn)化率為44.45%，與本文纖維素轉(zhuǎn)化率相近。說明纖維素酶破壞酒糟的木質(zhì)纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，水解纖維素和半纖維素中的葡萄糖苷鍵，促使其轉(zhuǎn)化為葡萄糖。圖1表明，酒糟原料的木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)緊密，纖維素聚集態(tài)結(jié)構(gòu)清晰。酶解后，表面結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，原先緊密的表面結(jié)構(gòu)被破壞，纖維素骨架發(fā)生斷裂，表面呈現(xiàn)無規(guī)則或形狀各異的膨松狀態(tài)，溝壑明顯，比表面積增大[12]。因此，預(yù)處理對酒糟木質(zhì)纖維包覆結(jié)構(gòu)有一定破壞。

2.3 糖化液暗發(fā)酵產(chǎn)氫性能

由表3可知，雙酶法處理酒糟產(chǎn)糖效果比單酶法處理效果好。雙酶法處理后還原糖產(chǎn)率分別16.49%[固液比1∶4(g∶mL)]、23.49%[固液比1∶15(g∶mL)]，單酶法處理后還原糖產(chǎn)率分別為14.17%[固液比1∶4(g∶mL)]和17.33%[固液比1∶15(g∶mL)]，數(shù)據(jù)表明雙酶法比單酶法處理后還原糖產(chǎn)率提高了16.37%[固液比1∶4(g∶mL)]和33.24%[固液比1∶15(g∶mL)]。另外，低固液比產(chǎn)糖率優(yōu)于高固液比，分別提高了22.30%(單酶)和40.02%(雙酶)。暗發(fā)酵過程中，產(chǎn)氫菌對糖的利用程度不同，菌種對單酶處理的酒糟糖化液中糖的利用率為24.40%[固液比1∶15(g∶mL)]和28.17%[固液比1∶4(g∶mL)]，氫氣產(chǎn)率分別為39.21、14.89 mL/g。菌種對雙酶處理液中糖的利用率為12.51%[固液比1∶15(g∶mL)]和15.66%[固液比1∶4(g∶mL)]，氫氣產(chǎn)率分別為51.56、19.66 mL/g。因此單酶、高固液比的酒糟糖化液中的還原糖更容易被產(chǎn)氫菌利用。張全國等[13]將玉米秸稈進(jìn)行酶解，得到的酶解液發(fā)酵產(chǎn)氫率為54.94 mL/g，與本試驗最佳產(chǎn)氫率相近。另外，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液中VFAs主要成分是乙酸，說明酒糟糖化液產(chǎn)氫發(fā)酵屬于乙酸型發(fā)酵[14]。

酒糟通過酶解將纖維素和淀粉等轉(zhuǎn)化為還原糖，產(chǎn)氫菌通過糖酵解途徑將還原糖乙酸化，進(jìn)一步將乙酸轉(zhuǎn)化為氫氣[15]。表3雙酶酶解結(jié)果表明，不同固液比對發(fā)酵液初始糖濃度有直接影響，固液比(g∶mL)為1∶4和1∶15下的發(fā)酵液初始糖質(zhì)量濃度分別為51.78和19.34 g/L，對應(yīng)的氫氣產(chǎn)率和乙酸質(zhì)量濃度分別為19.66、51.56 mL/g和6.34、3.37 g/L，說明高糖含量導(dǎo)致了體系乙酸的大量累積，抑制了氫氣的生成，而低糖濃度有利于氫氣的生成。乙酸作為氫氣發(fā)酵的重要中間代謝產(chǎn)物，其生成速率與糖濃度有直接關(guān)系，糖濃度較高時，產(chǎn)氫菌能夠快速利用葡萄糖產(chǎn)乙酸，易導(dǎo)致乙酸濃度迅速升高和pH快速下降，過低pH將影響產(chǎn)氫菌代謝進(jìn)而抑制氫氣的生成。另外表3表明，高固液比獲得的糖濃度較高，而較高糖濃度不利于氫氣產(chǎn)率的提高，同時高固液比獲得的糖化液黏度較大，不利于發(fā)酵液傳質(zhì)。因此，酒糟糖化處理時不易采用較高的固液比1∶15(g∶mL)為本文推薦值。

注：1)每克消耗的還原糖氫氣的產(chǎn)率。

3 結(jié)論

酶法對高粱酒糟的降解效果明顯優(yōu)于化學(xué)法(酸法和堿法)，纖維素酶酶解時，最佳固液比和纖維素酶添加量分別為1∶15(g∶mL)和4 000 U/g，對應(yīng)還原糖產(chǎn)率為17.21%。由于高粱酒糟中的淀粉含量較高，在纖維素酶酶解的同時，向酶解體系添加淀粉酶，有助于進(jìn)一步提高還原糖產(chǎn)率，固液比為1∶15(g∶mL)時的還原糖產(chǎn)率可達(dá)23.09%，此糖化液用于氫氣發(fā)酵的氫氣產(chǎn)率為51.56 mL/g。SEM觀察結(jié)果表明，高粱酒糟經(jīng)過酶解后，其纖維結(jié)構(gòu)明顯遭到破壞，這表明酶法是高粱酒糟糖化的有效方法。