楊智慧，張軍偉，魏冠棉，周鵬*

1(江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗室，江蘇 無錫,214122) 2(江南大學(xué) 食品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗室，江蘇 無錫,214122)

腐乳(sufu)是以大豆為主要原料，經(jīng)加工磨漿、制坯、培菌、發(fā)酵而制成的調(diào)味、佐餐制品[1]。云南牟定腐乳深受云貴川等地區(qū)消費(fèi)者喜愛，然而其生產(chǎn)仍沿用傳統(tǒng)工藝，開放的自然條件下微生物種類十分復(fù)雜，使腐乳終產(chǎn)品質(zhì)量極不穩(wěn)定。

食鹽在腐乳的生產(chǎn)中主要具有以下作用：提供咸味；與谷氨酸結(jié)合，使腐乳產(chǎn)生鮮味；降低水分含量，增加鹽坯硬度；抑制和防止雜菌污染；抑制發(fā)酵過程中酶的活性，使其不至過度分解[2]。腐乳中鹽含量過低會導(dǎo)致腐乳質(zhì)地松散或腐敗變質(zhì)，引發(fā)食品安全問題[3]；而鹽含量過高則會使產(chǎn)品生產(chǎn)周期變長[4]，增加消費(fèi)者患病風(fēng)險，使產(chǎn)品的消費(fèi)受限制[5]。本文分離純化了云南自然發(fā)酵腐乳中的霉菌，并用于制備低鹽腐乳，同時分析其理化性質(zhì)、微觀結(jié)構(gòu)、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及感官特性，以期為低鹽腐乳的實(shí)際生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 實(shí)驗材料

大豆，購自安徽省；菜籽油、辣椒、花椒、食用鹽，購自云南當(dāng)?shù)?；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；2-苯基乙酸乙酯(色譜純)，阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

YJ-VS-1單人垂直超凈工作臺，無錫一凈凈化設(shè)備有限公司；G154DWS立式自動壓力蒸汽滅菌鍋，致微(廈門)儀器有限公司；SHP-15生化培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗儀器有限公司；DM2000生物顯微鏡，徠卡顯微系統(tǒng)有限公司；C1000 TouchTM基因擴(kuò)增儀，美國Bio-Rad公司；Heraeus Multifuge XIR冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾科技公司；Agilent 1100氨基酸分析儀，美國安捷倫科技有限公司；S220 Seven Compact pH計，梅特勒-托利多公司；X08A自動硝化裝置，上海晟聲自動化分析儀器有限公司；K1302自動定氮分析儀，上海晟聲自動化分析儀器有限公司；Trace 1300 GC-MS色譜儀，賽默飛世爾科技公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 腐乳發(fā)酵菌種的分離純化

從腐乳廠隨機(jī)采集自然發(fā)酵3 d后的毛坯，將毛坯分別以10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7七個梯度稀釋，每個梯度取100 μL涂布到PDA平板中，28 ℃培養(yǎng)觀察。

取平板上單個菌落，以點(diǎn)接法接種在PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)觀察，直至菌落形態(tài)穩(wěn)定且單一。用生物顯微鏡對分離菌株的形態(tài)進(jìn)行觀察。

1.2.2 低鹽腐乳的制備

腐乳的制備工藝參考地標(biāo)DB53/T 713—2015[6]，大豆經(jīng)浸泡后磨漿、煮漿、點(diǎn)漿、壓榨成坯，然后切成小塊，制得豆腐；在豆腐上均勻地噴灑霉菌孢子懸浮液，培養(yǎng)3 d，制得毛坯；將毛坯進(jìn)行晾曬、鹽漬(10 kg毛坯中含500 g鹽)，得到鹽坯；鹽坯與辣椒、花椒、姜片、不同比例的鹽(10 kg鹽坯中分別含1 000、700、400 g鹽，分別相對于傳統(tǒng)牟定腐乳100%、70%和40%的鹽添加量)混勻后裝瓶，加入湯汁(含體積分?jǐn)?shù)為3%乙醇)后發(fā)酵90 d制得低鹽腐乳。

1.2.3 低鹽腐乳理化指標(biāo)的測定

水分含量[7]：按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.3—2016中規(guī)定的“直接干燥法”進(jìn)行檢測。

NaCl含量[8]：按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.44—2016中規(guī)定的“佛爾哈德法(間接沉淀滴定法)”進(jìn)行檢測；

總酸含量[9]：按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 12456—2008中規(guī)定的“酸堿滴定法”進(jìn)行檢測；

氨基酸態(tài)氮含量[10]：按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.235—2016中規(guī)定的“酸度計法”進(jìn)行檢測；

水溶性蛋白含量[11]：按照農(nóng)業(yè)部推薦標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1205—2006進(jìn)行檢測；

粗蛋白含量[12]：按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.5—2016中規(guī)定的“凱式定氮法”進(jìn)行檢測；

蛋白質(zhì)水解程度：以氨基酸態(tài)氮(amini acid nitrogen,AAN)/總氮(total nitrogen,TN)結(jié)合水溶性蛋白(water-soluble protein,WP)/粗蛋白(crude protein,CP)的百分比表示蛋白的水解程度。

1.2.4 菌種的鑒定

所分離菌株的全基因利用CTAB法提取。PCR擴(kuò)增引物采用真菌通用引物NS1:5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’和NS8:5’-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3’。PCR反應(yīng)體系見表1，PCR反應(yīng)采用TaqPCR Master Mix試劑盒。PCR的循環(huán)步驟：94 ℃預(yù)變性4 min，34次循環(huán)，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技有限公司武漢分公司測序。

根據(jù)其所測的序列在NCBI網(wǎng)站中進(jìn)行比對，找出與所測序列最相似的菌株，并采用Mega 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 低鹽腐乳游離氨基酸含量的測定

采用氨基酸分析儀進(jìn)行測定，具體方法參考文獻(xiàn)[13]。

1.2.6 低鹽腐乳微觀結(jié)構(gòu)的觀察

采用掃描電子顯微鏡對低鹽腐乳微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，具體方法參考文獻(xiàn)[14]。

1.2.7 低鹽腐乳揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定

樣品前處理：將5 g腐乳、1 g NaCl和5 g H2O充分混勻后，取5 g混合物于頂空瓶中，上機(jī)分析前加入20 μL 2-苯基乙酸乙酯甲醇溶液作為內(nèi)標(biāo)物(內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度為320.5 μg/mL)。

采用色譜儀進(jìn)行測定，具體方法參考文獻(xiàn)[15]。

1.2.8 低鹽腐乳的感官評價

低鹽腐乳的感官評價參考地方標(biāo)準(zhǔn)DB53/T 713—2015[6]、沈子林[16]、張曉鳴等[17]的方法，并結(jié)合實(shí)際樣品進(jìn)行了一定修改：10名感評人員(5男5女)分別按照表2對腐乳的色澤、香氣、質(zhì)地、滋味進(jìn)行評分，按照表3對腐乳進(jìn)行接受度檢驗。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗數(shù)據(jù)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的判斷標(biāo)準(zhǔn)；用SPSS 23.0軟件對鹽含量和理化指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性(Pearson correlation,PC)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的形態(tài)學(xué)觀察

經(jīng)分離純化后獲得了純種菌株M2，其形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果如圖1所示。M2菌落中心為淺黃色，邊緣為白色，呈薄棉絮狀，菌絲茂密，有分生孢子和孢子囊，孢子囊頂生，內(nèi)含大量孢囊孢子，孢囊梗不分支，根據(jù)《真菌學(xué)》[18]初步判斷為毛霉屬真菌。

2.2 分子生物學(xué)鑒定

通過NCBI對菌株M2的基因測序結(jié)果進(jìn)行Blast比對分析，結(jié)果顯示M2與總狀毛霉(Mucorracemosus)同源性最高。利用Mega 7.0軟件構(gòu)建菌株M2與毛霉屬部分模式種的基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示，菌株M2與Mucorracemosus(JF723681.2)處同一進(jìn)化分支，親緣關(guān)系最近。

綜合對菌種的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果以及基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，將菌株M2初步鑒定為總狀毛霉，并保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CGMCC No.15264。

2.3 低鹽腐乳理化性質(zhì)分析

低鹽腐乳中的鹽含量、總酸、氨基酸態(tài)氮、水溶性蛋白及粗蛋白含量結(jié)果見表4。相對于傳統(tǒng)云南牟定腐乳100%、70%和40%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鹽添加量制備的腐乳(M2-100%、M2-70%和M2-40%)，鹽含量分別為8.15、6.83和5.03 g/100 g；水分含量均為69%左右；腐乳的總酸隨著鹽含量的降低而升高，主要是由于降低鹽含量使得其對酶的抑制作用減小，腐乳蛋白水解程度增大造成的；從AAN/TN和WP/CP的結(jié)果可看出，腐乳的蛋白水解程度隨著鹽含量的降低而增大，這與氨基酸態(tài)氮和水溶性蛋白的變化趨勢相一致。M2-100%、M2-70%和M2-40%理化指標(biāo)的檢測結(jié)果均符合云南省地方標(biāo)準(zhǔn)DB53/T 713—2015《地理標(biāo)志產(chǎn)品 牟定腐乳》[6]中腐乳成熟的理化要求。

注：同一列中標(biāo)記有不同字母(a，b，c)的數(shù)據(jù)間有顯著性差異(P<0.05);TN=CP/5.71表示總氮含量

采用SPSS 23.0對各理化指標(biāo)與鹽含量進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析，結(jié)果如表5所示。腐乳中的鹽含量與總酸、水溶性蛋白含量呈較顯著的負(fù)相關(guān)，與氨基酸態(tài)氮含量、蛋白質(zhì)水解程度呈顯著的負(fù)相關(guān)，這與文獻(xiàn)報道[4]的相似。

注：**表示在0.01水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)；*表示在0.05水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)

2.4 低鹽腐乳游離氨基酸含量分析

低鹽腐乳中的游離氨基酸含量結(jié)果見表6。M2-100%、M2-70%和M2-40%的總氨基酸含量分別為22.62、26.98、30.59 g/100 g。腐乳中含量最高的游離氨基酸為呈鮮味的谷氨酸，其次為天冬氨酸，隨著鹽含量的降低，游離氨基酸含量逐漸升高，這與HAN等[19]的研究結(jié)果相一致，且與腐乳理化性質(zhì)的變化趨勢相一致。

注：“-”表示未檢測出

2.5 低鹽腐乳微觀結(jié)構(gòu)分析

采用掃描電鏡對低鹽腐乳微觀結(jié)構(gòu)的觀察結(jié)果如圖3所示。

隨著鹽含量的降低，凝膠結(jié)構(gòu)的孔徑逐漸縮小，且更加致密均一。M2-100%內(nèi)部呈網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，存在較多的大孔徑，可能是因為蛋白質(zhì)的水解程度較低，蛋白質(zhì)膠粒較大，蛋白凝膠結(jié)構(gòu)受到的破壞程度有限；M2-70%的微觀結(jié)構(gòu)與M2-100%相似，但M2-70%的凝膠孔徑略??；M2-40%的孔徑最小，致密均一，說明其蛋白質(zhì)水解程度最高，這與汪建明等[20]、張媛媛等[21]的結(jié)果相一致。

2.6 低鹽腐乳的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

低鹽腐乳中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)結(jié)果見表7。M2-100%、M2-70%、M2-40%中均檢測出了45種揮發(fā)性物質(zhì)，包括15種酯類、12種醇類、5種酸類、4種醛類、4種烯類、2種酮類和3種雜環(huán)類物質(zhì)。3種鹽含量的腐乳揮發(fā)性物質(zhì)種類相近，但含量具有顯著的差異。M2-100%、M2-70%、M2-40%中揮發(fā)性風(fēng)味化合物含量分別為17 964.42、29 090.05、19 644.56 μg/kg，其中酯類、醇類、烯類含量所占比例較大。腐乳中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)可由蛋白質(zhì)及脂肪酸等大分子物質(zhì)的分解代謝及其他酶催化反應(yīng)(尤其是酯化反應(yīng))途徑產(chǎn)生；由于不同含量的鹽對酶類的抑制作用不同，故含不同鹽含量的腐乳中揮發(fā)性物質(zhì)含量不同。

注：同一行不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)

酯類大多具有特殊香氣，可賦予腐乳香甜氣味。其中辛酸乙酯、棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯、乙酸乙酯、丙酸-2-苯乙酯、苯乙酸乙酯賦予了腐乳果香、奶香和花香[22]，苯甲酸乙酯、水楊酸甲酯賦予了腐乳冬青油香，十四酸乙酯、丙位壬內(nèi)酯賦予了腐乳椰子香。腐乳的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中，乙酯類物質(zhì)含量較高，可能是腐乳中脂質(zhì)水解產(chǎn)生的脂肪酸與所加入的乙醇發(fā)生酯化反應(yīng)生成的；另外，LI等[23]認(rèn)為酯類的增加主要發(fā)生在加入酒精的腌制期，且產(chǎn)生的酯類含量與加入的酒精含量呈正相關(guān)。

醇類具有較強(qiáng)烈的香味，腐乳中醇的種類和含量與外界添加有關(guān)，腌制時由于添加乙醇，腐乳中醇的種類和含量增加，且醇能與脂肪酸等酸類物質(zhì)通過酯化反應(yīng)生成酯類物質(zhì)。此外，香辛料的加入也大大豐富了腐乳醇類成分，花椒中含有大量的香氣成分，其中主要含有芳樟醇、4-萜烯醇、松油醇等[24-25]，因此腐乳中含量最為豐富的芳樟醇、4-萜烯醇和松油醇等，可能來自于配料中的花椒。

腐乳中另一大類揮發(fā)性物質(zhì)是醛類，醛類物質(zhì)中苯甲醛含量最高，可由游離的苯丙氨酸轉(zhuǎn)化而來[26]，能夠賦予腐乳苦杏仁香味。

2.7 低鹽腐乳的感官評價

低鹽腐乳的感官評定結(jié)果如圖4所示。M2-100%、M2-70%、M2-40%的色澤和香氣無顯著性差異，且得分均在7～9分之間，符合腐乳的要求[15]。M2-100%滋味得分為7.20分，M2-70%(8.28分)和M2-40%(7.90分)的滋味得分均高于M2-100%；且M2-70%(8.10分)和M2-40%(7.74分)的質(zhì)地得分也高于M2-100%(7.00分)。結(jié)合低鹽腐乳的理化性質(zhì)來看，可能是由于M2-70%和M2-40%的水解程度比M2-100%高，所以呈味的小分子含量更高，滋味更好，且質(zhì)地更細(xì)膩軟糯；而M2-40%的滋味和質(zhì)地得分相對于M2-70%較低，則可能是M2-40%過度水解導(dǎo)致質(zhì)地過軟，且鹽含量過低，滋味相對寡淡。低鹽腐乳的喜好度得分順序為M2-70%>M2-40%>M2-100%，這與滋味和質(zhì)地的感評結(jié)果相一致。

3 結(jié)論

通過對分離純化菌種的形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定，所分離出來的菌種為總狀毛霉。將該菌種應(yīng)用于低鹽腐乳的制備，確定降低鹽含量可提高蛋白質(zhì)的水解程度和游離氨基酸含量，使得微觀結(jié)構(gòu)更加致密均一；低鹽腐乳中共檢測出了45種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，酯類、醇類和烯類含量所占比例較大，且鹽含量對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量有較大影響；M2-100%、M2-70%、M2-40%腐乳接受度皆較好，但M2-70%的接受度最高。這為M2的實(shí)際應(yīng)用、傳統(tǒng)腐乳發(fā)酵工藝的改進(jìn)及低鹽腐乳的開放提供了理論指導(dǎo)。