趙改名，李珊珊，崔文明，祝超智*，焦陽陽，李佳麒，銀峰，韓明山

1(河南農(nóng)業(yè)大學 食品科學技術(shù)學院，河南 鄭州，450002) 2(內(nèi)蒙古科爾沁牛業(yè)股份有限公司，內(nèi)蒙古 通遼，028000)

傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品具有高鹽、低水分的特點，儲存期長，風味獨特，營養(yǎng)價值高[1]。它屬于在自然條件下，經(jīng)微生物或酶的作用，發(fā)生一系列生物化學及物理變化而形成的肉制品[2-3]。目前，我國發(fā)酵肉制品發(fā)展較慢，主要原因是缺少自主產(chǎn)權(quán)的發(fā)酵劑，產(chǎn)品品種單一，加工過程難以控制，產(chǎn)品質(zhì)量難以穩(wěn)定等。通過篩選適合于肉制品發(fā)酵的優(yōu)良菌株并制備發(fā)酵劑，可以使一些產(chǎn)品實現(xiàn)發(fā)酵過程的人工控制，并且開發(fā)更多樣的發(fā)酵肉制品，為發(fā)酵肉制品的產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；a(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

乳酸菌是最早從發(fā)酵肉制品中分離出的微生物，與產(chǎn)品品質(zhì)有密切的關(guān)系[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌可降低產(chǎn)品pH值，賦予產(chǎn)品特殊的發(fā)酵風味，改善組織質(zhì)構(gòu)，促進色澤與風味的形成[6-7]。同時，某些乳酸菌能產(chǎn)細菌素，抑制腐敗菌和致病菌生長繁殖[8-10]，甚至還有某些乳酸菌具有降低產(chǎn)品中生物胺[11-13]、降低膽固醇[14]、抗氧化[15]等作用。但并非所有乳酸菌都適合作為肉制品發(fā)酵菌株，不同種甚至同一種的不同菌株間特性的差異都會使產(chǎn)品品質(zhì)產(chǎn)生極大的差別[16-17]。云南火腿是我國重要的傳統(tǒng)發(fā)酵風味肉制品，不僅具有獨特的風味與口感，而且具有悠久的歷史與深厚的文化底蘊。本研究擬從云南傳統(tǒng)發(fā)酵火腿中分離篩選出符合發(fā)酵肉制品標準且產(chǎn)酸能力強、耐鹽性和耐亞硝酸鹽性好的乳酸菌菌株，為云南火腿的工業(yè)化生產(chǎn)及肉制品發(fā)酵劑的研究與開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：云南火腿(農(nóng)家自制)

試劑：MRS瓊脂、MRS肉湯，北京路橋技術(shù)股份有限公司；瓊脂、牛肉浸粉、蛋白胨、酵母提取物，北京奧博興生物技術(shù)有限責任公司；細菌DNA提取試劑盒，北京天根試劑；CaCO3、NaCl、NaNO2、葡萄糖、MnSO4、MgSO2、乙酸鈉、檸檬酸鈉、MnO2、KOH等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD無菌操作臺，美國Airtech公司；TGradient梯度PCR儀，德國Biometra公司；EC3-310凝膠成像系統(tǒng)，美國UVP公司；DYY-12電泳儀，北京市六一儀器廠；DHP-9272低溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；ECLIPSE 80i共聚焦熒光顯微鏡，日本尼康公司；UV-2600紫外分光光度儀，日本島津(Shimadzu)公司；Easy MIX拍擊式均質(zhì)儀，梅里埃診斷產(chǎn)品(上海)有限公司；VORTEX-2 GENIE渦旋震蕩器，美國Scientific Industries公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化及初步篩選

參考《GB 4789.35—2016食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》，稱取樣品25 g，剪碎，加入225 mL無菌生理鹽水，用均質(zhì)機均質(zhì)，并用無菌生理鹽水依次做10倍稀釋，選擇3個適宜稀釋度，分別取200 μL稀釋液涂布于MRS+3% CaCO3(質(zhì)量分數(shù))培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)24～48 h。挑選有明顯溶鈣圈且符合乳酸菌菌落形態(tài)的菌落，反復劃線純化。對純化好的菌株進行革蘭氏染色及過氧化氫酶試驗，選取革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性、且不形成芽孢的菌株作為初篩菌株。

1.3.2 菌株復篩試驗

產(chǎn)酸能力測定：將活化3代的菌液接種于液體培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)24 h，測定pH。

發(fā)酵性能測定[18-19]：葡萄糖產(chǎn)氣試驗、H2S產(chǎn)生檢測試驗、精氨酸產(chǎn)氨試驗、過氧化氫產(chǎn)生檢測試驗。

NaCl和NaNO2耐受性測定：參考張曉東[20]的方法進行測定。

生長曲線和產(chǎn)酸曲線的測定：參考潘曉倩等[21]的方法進行測定。

不同溫度條件下的生長能力測定：將活化3代的菌液接種于液體培養(yǎng)基中，分別在10、20、30、40、50 ℃條件下培養(yǎng)24 h，測定菌液的OD600。

不同pH條件下的生長能力測定：將活化3代的菌液分別接種于pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，測定菌液的pH。

1.3.3 生理生化鑒定

采用生化鑒定試劑盒進行糖醇發(fā)酵實驗，參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對菌株進行初步鑒定。

1.3.4 16S rDNA 分子生物學鑒定

按照細菌DNA提取試劑盒說明書進行DNA 提取，并以所得DNA 為模板，用細菌16S rDNA通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′)作為上下游引物進行PCR擴增。PCR體系(30 μL)：buffer 3 μL，dNTP 2 μL，模板1 μL，引物27F 3 μL，引物1492R3 μL，酶0.2 μL，ddH2O補至終體積30 μL；PCR擴增條件：第1階段：95 ℃預變性5 min；第2階段：95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；第3階段：72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分析后，送北京六合華大基因科技有限公司(武漢分公司)測序，應用BLAST程序，將測序結(jié)果在GenBank基因數(shù)據(jù)庫中進行同源性比較以鑒定菌種歸屬。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理與分析

所有實驗均重復3次，實驗結(jié)果表示為平均值±標準差。采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)間的分析采用單因素方差分析(one way ANOVA)和Duncan多重比較法，顯著性水平均設(shè)定為P<0.05。生長曲線及產(chǎn)酸曲線的結(jié)果使用Origin Pro 8.0進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離和初步篩選結(jié)果

從云南火腿中通過MRS+3% CaCO3的培養(yǎng)基篩選乳酸菌，多次純化后，挑選有明顯溶鈣圈且具有典型乳酸菌菌落特征，革蘭氏陽性且過氧化氫酶陰性的菌株。共得到20株乳酸菌，并分別編號為H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17、H18、H19、H20。

2.2 菌株的產(chǎn)酸能力

乳酸菌菌株的產(chǎn)酸性能是決定加工發(fā)酵肉制品成功與否及安全性的重要因素[22]。由圖1可知，所有菌株在24 h pH均達到4.0以下。選取產(chǎn)酸能力較強的9株菌，即24 h pH≤3.85的菌株進行后續(xù)試驗。

2.3 菌株的發(fā)酵性能

菌株的發(fā)酵特性決定其是否能作為肉制品發(fā)酵菌株。篩選的菌株若具有產(chǎn)H2S、產(chǎn)H2O2、精氨酸產(chǎn)氨、葡萄糖產(chǎn)氣等特性會嚴重影響產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)、風味、色澤等，使產(chǎn)品品質(zhì)降低[23]。由表1可知，上述9株菌均不具有以上特性，符合篩選要求。菌株若有適當?shù)牡鞍追纸饽芰稍黾赢a(chǎn)品的風味，但以上菌株均不具有蛋白分解能力，這與RAQUEL等[24]的研究一致。并且有研究表明[25-27]，在發(fā)酵肉制品中產(chǎn)生風味的主要是微球菌和凝固酶陰性葡萄球菌，并非乳酸菌。乳酸菌菌株可與微球菌和凝固酶陰性葡萄球菌或風味蛋白酶復配使用，從而使產(chǎn)品產(chǎn)生更多的風味物質(zhì)。菌株的脂肪分解能力容易使產(chǎn)品腐敗變質(zhì)，從而縮短產(chǎn)品的貨架期，所以菌株不應具有脂肪分解能力。綜上所述，上述9株菌的發(fā)酵特性均符合要求，可作為肉制品發(fā)酵劑的潛在菌株。

注：“-”表示反應呈陰性；“+”表示反應呈陽性

2.4 菌株對NaCl的耐受性

發(fā)酵肉制品中食鹽的添加量一般為質(zhì)量分數(shù)2%～3%，在一些特殊的產(chǎn)品如色拉米香腸的加工中，食鹽添加量更高。隨著發(fā)酵的進行，水分含量的降低，食鹽含量也會相對提高，所以要求篩選的菌株有較好的NaCl耐受性。由圖2可知，不同菌株對NaCl的耐受性存在顯著性差異(P<0.05)；陳衛(wèi)等[28]也表明，即使是相同的屬不同的種，甚至不同亞種的乳酸菌，耐鹽能力也會有所不同。當NaCl添加量達到6%時，菌株生長受到不同程度的抑制。其中H8的耐受性最好(2.69→2.08)，H4的耐鹽性最差(2.50→1.52)。這可能是因為高鹽濃度會引起高滲透壓，觸發(fā)細胞內(nèi)水分外流，使細胞胞質(zhì)分離，從而引起細胞在結(jié)構(gòu)和生理上的損傷，導致細胞停止生長，甚至死亡[29-30]。

2.5 菌株對NaNO2的耐受性

發(fā)酵肉制品中添加亞硝酸鹽有促進發(fā)色、增加風味、抑制微生物的作用，尤其可以有效抑制肉毒梭狀芽孢桿菌[31]。但過量的亞硝酸鹽會對人體造成潛在的危害，國標中對亞硝酸鹽在食品中的添加量有明確的規(guī)定。該試驗添加的亞硝酸鈉的最大量為150 mg/kg，由圖3可知，不同菌株對NaNO2的耐受性存在顯著性差異(P<0.05)。但當NaNO2添加量為150 mg/kg時,OD值均在2.0以上，整體表現(xiàn)出較好的NaNO2耐受性，這說明當遇到NaNO2脅迫時，菌株自身有較好的調(diào)節(jié)能力。這可能與菌株的相容性調(diào)控系統(tǒng)、熱休克蛋白調(diào)控系統(tǒng)、糖酵解關(guān)鍵酶調(diào)控系統(tǒng)以及胞內(nèi)離子平衡等有關(guān)[32]。

綜合考慮上述所有指標，選擇符合發(fā)酵肉制品標準要求且產(chǎn)酸較好，NaCl和NaNO2耐受性最好的菌株即H8為目標菌株，進行下一步試驗。

2.6 菌株在不同溫度條件下的生長能力

發(fā)酵肉制品的發(fā)酵溫度一般為15～40 ℃[33]。由圖4可知，不同溫度條件下菌株的生長能力存在顯著性差異(P<0.05)，在10 ℃條件下生長受到抑制，20～40 ℃均能較好的生長，且在30 ℃條件下生長最好，而在李建等[34]的研究中，其優(yōu)勢菌株在40 ℃條件下生長最好，這種差異可能是由菌株的不同引起的。

2.7 菌株在不同pH條件下的生長能力

隨著發(fā)酵的進行，發(fā)酵肉制品的pH不斷降低，所以要求菌株對酸有一定程度的耐受性。由圖5可知，菌株在不同pH值條件下的生長存在顯著性差異(P<0.05)。菌株在pH 4.0時仍能較好的生長，適合作為肉制品發(fā)酵劑潛在菌株。

2.8 菌株的生長曲線和產(chǎn)酸曲線

如圖6所示，0～2 h內(nèi)為延滯期，時間較短，在此期間內(nèi)，生長速度和產(chǎn)酸速度較慢。2～7 h內(nèi)為對數(shù)生長期，此階段OD600由0.19增加至2.25。此外，該菌株的產(chǎn)酸能力較強，其中主要在對數(shù)生長期產(chǎn)酸較多。菌株生長速度和產(chǎn)酸速度快有助于在肉制品中的快速定植、生長及產(chǎn)酸，從而抑制其他腐敗微生物的生長，保證產(chǎn)品的質(zhì)量[35]。

2.9 菌株鑒定

2.9.1 形態(tài)及生理生化鑒定

菌株H8呈乳白色圓形菌落，直徑1～2 cm，表面光滑凸起；鏡檢結(jié)果如圖7所示，為革蘭氏陽性球菌，無鞭毛、無芽孢。生理生化鑒定結(jié)果如表2所示，根據(jù)形態(tài)及生理生化鑒定結(jié)果，對照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，初步將H8菌株鑒定為片球菌屬細菌。

注：“-”表示反應呈陰性；“+”表示反應呈陽性。

2.9.2 分子生物學鑒定結(jié)果

經(jīng)16S rDNA測序，得到長度為1 246 bp的H8菌株16S rDNA序列。用BLAST進行序列同源性比對，并利用MEGA 6.06構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖8。

由系統(tǒng)發(fā)育樹可知，H8菌株與戊糖片球菌親緣關(guān)系最近，這與形態(tài)及生理生化鑒定結(jié)果一致，由此可以進一步將H8菌株歸屬于戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)。

3 結(jié)論

本實驗以云南火腿為原料，初步篩選得到20株革蘭氏陽性，過氧化氫酶陰性、符合乳酸菌基本特征且具有明顯溶鈣圈的菌株。通過研究菌株的產(chǎn)酸能力、發(fā)酵特性及對NaCl和NaNO2的耐受性，得到1株性能較好的菌株，經(jīng)形態(tài)學、生理生化和分子生物學鑒定為戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)。該菌株在不同pH和不同溫度條件下的生長能力均符合發(fā)酵肉制品菌株的基本要求，且該菌株生長速度和產(chǎn)酸速度較快，生長延滯期短，可作為肉制品發(fā)酵劑的潛在菌株。