鄭佳，楊康卓，張建敏，劉芳，何張?zhí)m，彭志云，趙東

(宜賓五糧液股份有限公司,四川 宜賓，644007)

“千年老窖萬(wàn)年糟，酒好須得窖池老”，泥窖固態(tài)續(xù)糟發(fā)酵是濃香型白酒區(qū)別于其他香型白酒的根本特征之一。窖泥既是濃香型白酒功能微生物又是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)乃至香味物質(zhì)的重要載體[1]，故可稱之為窖池發(fā)酵的菌源和香源。長(zhǎng)期不間斷的發(fā)酵過(guò)程中，窖泥中微生物利用糟醅中的營(yíng)養(yǎng)成分產(chǎn)生有機(jī)酸等香味物質(zhì)，窖泥與糟醅之間的接觸有效實(shí)現(xiàn)了窖泥與糟醅物質(zhì)與能量的互動(dòng)[2-3]，而微生物的代謝功能強(qiáng)弱程度則是影響濃香型白酒酒質(zhì)的關(guān)鍵因素之一。因此，研究窖泥中微生物與香味成分的構(gòu)成及空間分布規(guī)律具有重要的理論與實(shí)際意義。

過(guò)去關(guān)于窖泥香氣成分的研究中，基于乙醇提取法的不同窖齡窖泥香氣成分的研究發(fā)現(xiàn)：仲丁醇含量隨窖齡增加而減少，而己醇、己酸乙酯和己酸異戊酯的含量則不斷增加，有機(jī)酸是任何窖齡窖泥中比例最高的化合物類型[2]；左飛等[3]利用高溫孵育-頂空法設(shè)計(jì)了一種窖泥香氣成分的定性方法；孫夏冰等[4]優(yōu)化了頂空固相微萃取(head space solid-phase microextraction,HS-SPME)分析窖泥中揮發(fā)性成份的方法；范文來(lái)等[5]利用HS-SPME分析了人工窖泥中的揮發(fā)性成分，共檢出184種揮發(fā)性成分，其中酯類78種、酸類11種、醇類18種、芳香族26種以及內(nèi)酯、呋喃、硫化物等。李恒等[6]比較了窖壁和窖底窖泥中香氣成分的差異，認(rèn)為窖壁和窖底泥中酸類和酯類成分在種類和數(shù)量上均存在明顯差異，己酸、己酸丁酯、己酸己酯是窖壁泥的主要特征成分，而窖底泥中含有豐富的己酸甲酯。最近，趙東等[7]研究了以黃水線為分隔依據(jù)的5個(gè)不同位置糟醅與窖泥在香氣成分的關(guān)聯(lián)性。然而，窖泥中香氣成分的空間異質(zhì)性特征的研究還亟待進(jìn)一步詳細(xì)分析。

本研究采集了不同空間位置的濃香型白酒窖泥，探討了窖泥中香氣成分的空間分布規(guī)律；并基于多元統(tǒng)計(jì)分析方法探討了窖泥之間的相互關(guān)系，以期為科學(xué)認(rèn)識(shí)窖泥對(duì)酒質(zhì)的貢獻(xiàn)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

窖泥采集自宜賓五糧液股份有限公司釀酒車間，窖池窖齡15年。

采集方法：參考文獻(xiàn)[8]所述方法，從地面開(kāi)始，沿窖池壁往窖池底部垂直距離間隔30 cm取樣，利用專用窖泥取樣器撥開(kāi)窖泥表面附著的糟醅后，從表層往里層取約3 cm厚度的窖泥，同一層次取3個(gè)平行樣(平行樣點(diǎn)分布在窖墻同一平面上，以窖墻中心點(diǎn)往兩邊間隔50 cm分別取樣)，分別取50 g，混合均勻。全部樣品包括0、30、60、90、120、150、180、210和240 cm共9個(gè)窖泥樣品。

樣品前處理參考文獻(xiàn)[8]所述方法，即取100 g窖泥置于-20 ℃中完全冷凍，再用攪拌機(jī)攪拌均勻，待測(cè)。

1.1.2 試劑和儀器

丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸-2-苯乙酯、十四酸乙酯、棕櫚酸乙酯、乙酸、丁酸、3-甲基丁酸、2-甲基丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、丁醇、異戊醇、己醇、庚醇、辛醇、苯乙醇、苯酚和對(duì)甲酚，均為GC純，上海TCI公司。4-甲基吲哚和4-辛醇(GC純，內(nèi)標(biāo))，美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

50/30 μm CAR/DVB/PDMS Stableflex纖維萃取頭，美國(guó)Supelco公司；氣質(zhì)聯(lián)用儀，7890B-5977B MSD，美國(guó)Agilent公司；多功能自動(dòng)進(jìn)樣器，PAL RTC，瑞士CTC公司；DB-WAX石英毛細(xì)管色譜柱(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)，J&W Scientific，美國(guó)Agilent公司。

1.2 頂空固相微萃取(HS-SPME)方法

參考文獻(xiàn)[7]所述方法。稱取2 g窖泥于20 mL頂空瓶中，加入定量?jī)?nèi)標(biāo)(4-辛醇，5.5 mg)，50 ℃水浴中平衡15 min，再插入纖維萃取頭吸附萃取45 min，隨后導(dǎo)入GC進(jìn)樣口中熱解析5 min，利用GC/MS分析其中香氣成分。每個(gè)樣品做2個(gè)重復(fù)。

1.3 氣質(zhì)聯(lián)用(GC/MS)條件

氣相色譜條件為：進(jìn)樣口溫度230 ℃，載氣(He)流速1 mL/min，不分流模式進(jìn)樣，質(zhì)譜連接線溫度250 ℃；升溫程序?yàn)椋浩鹗贾鶞?0 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件為：質(zhì)譜EI源，電子轟擊能量70 eV；離子源溫度200 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃；質(zhì)量數(shù)掃描范圍35～350 amu。

1.4 香氣成分的定量

香氣成分的定量采用內(nèi)標(biāo)法[7]測(cè)定，參考內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度，以待測(cè)成分與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比計(jì)算待測(cè)成分的半定量信息，單位以μg/g表示。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用R軟件繪制主要香氣成分的熱圖；利用SIMCA 14.1軟件完成樣品的偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)[9]。

2 結(jié)果與討論

2.1 窖泥香氣成分的總離子流圖

實(shí)際生產(chǎn)中，在經(jīng)歷長(zhǎng)期不間斷的發(fā)酵后，不同空間位置的窖泥感官差異十分顯著；同時(shí)，在對(duì)窖壁和窖底窖泥香氣成分的比較研究中，酯類和酸類物質(zhì)在兩者間的差異顯著[6]。為了更進(jìn)一步認(rèn)識(shí)窖泥中香氣成分的空間分布規(guī)律，本研究以30 cm為尺度，從窖池頂部到底部的9個(gè)不同位置進(jìn)行取樣，利用HS-SPME-GC/MS分析了窖泥中香氣成分的空間分布情況。如圖1所示，窖泥中香氣成分的指紋圖譜存在高度相似性，但是在各成分的豐度存在顯著差異，如總離子流圖中16～20 min、27～40 min等區(qū)域在不同空間的窖泥中差異性顯著。

2.2 窖泥香氣成分的空間分布

2.2.1 分組分布規(guī)律

進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)窖泥香氣成分的分組空間分布規(guī)律，如圖2所示，窖泥香氣成分的總含量隨窖池深度增加而增加，窖池頂部(0 cm)的總含量為444 μg/g，而窖池底部(240 cm)的總含量是0 cm處的3.38倍，達(dá)到1 502 μg/g。一般地，濃香型窖池內(nèi)90～120 cm是黃水線的位置，0 cm到90 cm/120 cm部分處于窖池上層，與窖泥接觸的糟醅的含水量較120 cm以下的糟醅低。酸類和酯類是窖泥中最主要的2種成分類型，含量范圍分別為：156.3～670.6 μg/g和153.3～649.9 μg/g，顯而易見(jiàn)，這2個(gè)最重要的成分類型的總含量隨窖池深度的增加而增加，而醇類成分的含量并未呈現(xiàn)顯著的空間異質(zhì)性。這可能是由于窖池的特殊結(jié)構(gòu)-即頂部較大、底部適當(dāng)小的地穴式結(jié)構(gòu)[10]，黃水是糟醅發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物[11]，而窖池內(nèi)不同空間層次的糟醅之間物質(zhì)的交換主要是通過(guò)黃水在重力的作用下自然下滲，下層窖泥吸收與之接觸的糟醅中的香氣成分[12]，故下層窖泥香氣成分明顯高于中上層窖泥。

2.2.2 主要香氣成分的空間分布規(guī)律

篩選出窖泥中關(guān)鍵的香氣成分進(jìn)行空間變化情況研究。由圖3可知，己酸、丁酸、庚酸、辛酸、己酸乙酯、己酸己酯是窖泥中含量較高的成分，這與先前的研究結(jié)果一致[7]。基于香氣成分含量的聚類分析可知(圖3)，0～90 cm的窖泥樣品劃歸為第一類，120～240 cm的窖泥樣品劃歸為第二類。同時(shí)，第二類窖泥中己酸、丁酸、辛酸、庚酸、己酸己酯和己酸乙酯的含量普遍高于第一類。

特別是己酸、丁酸、己酸乙酯是濃香型白酒的主要的有機(jī)酸和乙酯成分[13]，分別具有典型的“酸味、臭腳丫味”和“菠蘿、類似香蕉”等復(fù)合香氣特征[14]。本研究中，除120 cm窖泥以外，這3種成分的含量隨窖池深度的增加而增加，尤其是窖池底部(240 cm)，含量達(dá)到最大值，分別為168.38、220.33和133.98 μg/g(圖3)，與過(guò)去研究結(jié)果相吻合[15]。這可能是因?yàn)椋阂环矫?，乙酸、己酸和丁酸等濃香型白酒中占?yōu)勢(shì)的有機(jī)酸是由窖泥中梭菌屬(Clostridium)[16]細(xì)菌代謝產(chǎn)生；另一方面，窖池內(nèi)的厭氧程度也是隨著窖池深度而增加，為Clostridium細(xì)菌等厭氧菌群的增殖代謝提供了較為理想的環(huán)境，因而深度越深，己酸和丁酸的含量越高。

本研究中，不同空間窖泥中己酸、丁酸和乙酸的含量排序?yàn)榧核?丁酸>乙酸，這與過(guò)去關(guān)于不同質(zhì)量等級(jí)窖泥的研究結(jié)果類似[15]，這可能是由于本研究中窖池窖齡在15年左右，屬于新窖向老窖老熟轉(zhuǎn)化的過(guò)程期，不同類型有機(jī)酸的含量隨窖池使用時(shí)間的增加而逐步調(diào)整。

此外，本研究中，醇類成分(除乙醇外)雖然不是窖泥中的優(yōu)勢(shì)香氣成分，值得注意的是正己醇是醇類成分中含量最高的成分，含量范圍從0 cm處16.83 μg/g到240 cm處31.28 μg/g，但無(wú)顯著的增減規(guī)律。正己醇具有典型的“割青草”香氣，又具有一定的甜味，是濃香型白酒的重要醇類物質(zhì)。

2.3 基于香氣成分的窖泥PLS-DA分析

為了進(jìn)一步考察隨著窖池深度的變化，不同窖泥中香氣成分的差異以及樣品之間的關(guān)聯(lián)性。根據(jù)圖3的聚類分析結(jié)果，將不同空間的窖泥設(shè)置為不同的組別建立PLS-DA模型，觀察組間差異情況，并試圖探索與之關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵香氣成分。PLS-DA模型R2值與Q2值越大,表明PLS-DA模型的預(yù)測(cè)能力越準(zhǔn)確與真實(shí)[17]。本研究中，將0 cm與30～90 cm構(gòu)建PLS-DA模型，以及將120 cm與150～240 cm所涉及的樣品建立PLS-DA模型，結(jié)果如圖4所示。圖4-a和圖4-b的R2Xcum與Q2cum分別為(0.951、0.994)和(0.905、0.877)，表明PLS-DA模型能真實(shí)反應(yīng)窖泥樣品各組之間的分組情況。圖4-a和4-b中，基于t[1]和t[2]軸上的載荷值，不同空間位置窖泥能夠很好的分開(kāi)，例如圖4-a中，30和60 cm處窖泥分別位于t[1]負(fù)半軸，而0和90 cm則分別位于t[1]正半軸。

通過(guò)PLS-DA的載荷圖尋找與各樣品關(guān)聯(lián)的差異性關(guān)鍵香氣成分(圖4-b和圖4-d)。圖4-b中，組別1(0 cm)窖泥與苯酚正相關(guān)，組別2(30和60 cm)窖泥與肉豆蔻酸乙酯、13-甲基肉豆蔻酸乙酯和辛酸己酯正相關(guān)，組別3(90 cm)窖泥與2-甲基丁酸、3-甲基丁酸、乙酸和壬酸正相關(guān)；圖4-d中，組別1(240 cm)窖泥與2-乙基苯酚、癸酸丙酯、己酸己酯和異戊醇等正相關(guān)，組別2(210 cm)窖泥與(R)-(-)-2-戊醇、十三酸乙酯和乙酸正相關(guān)，組別3(120 cm)窖泥與己酸甲酯正相關(guān)，組別4(150和180 cm)窖泥與辛酸己酯、3-甲基丁酸辛酯和壬酸正相關(guān)。根據(jù)篩選的主要關(guān)聯(lián)香氣成分含量繪制熱圖，圖5-a中，0 cm窖泥中苯酚含量較高；肉豆蔻酸乙酯、13-甲基肉豆蔻酸乙酯和辛酸己酯在30和60 cm窖泥中含量較高；2-甲基丁酸、3-甲基丁酸、乙酸(圖3)和壬酸在90 cm窖泥中的含量較高。圖5-b中，2-乙基苯酚和異戊醇在240 cm窖泥中含量最低，己酸己酯(圖3)和癸酸丙酯在240 cm窖泥中的含量較高；(R)-(-)-2-戊醇在210 cm窖泥中含量最低，十三酸乙酯和乙酸在210 cm窖泥中的含量較高；己酸甲酯在120 cm窖泥中的含量較高；辛酸己酯、3-甲基丁酸辛酯和壬酸在150和180 cm窖泥中含量較高。

3 結(jié)論

濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中，窖泥中不僅棲息了數(shù)以億計(jì)(109個(gè)/g)的特殊微生物，而且在糟醅與窖泥相接觸的界面，不斷地發(fā)生微生物、香氣物質(zhì)等相互交換。本文探討了窖泥中香氣成分的空間分布規(guī)律，結(jié)果表明，窖泥中蘊(yùn)含較高含量的有機(jī)酸，尤其是己酸、丁酸和庚酸，且窖池深度是決定有機(jī)酸含量的重要因素，深度越深，有機(jī)酸含量越高；同時(shí)，己酸己酯可能是窖泥中己醇和己酸在酯化酶作用下產(chǎn)生。因此，進(jìn)一步利用基因組學(xué)技術(shù)與代謝組學(xué)技術(shù)研究窖泥微生物群落與窖泥特征香氣成分的關(guān)聯(lián)性研究將為優(yōu)質(zhì)窖泥的篩選及質(zhì)量控制提供較強(qiáng)的理論及實(shí)踐基礎(chǔ)。