亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        枯草芽孢桿菌生產(chǎn)β-丙氨酸的基因工程菌構(gòu)建及其優(yōu)化研究

        2020-01-07 00:05:52周潔靜
        生物化工 2020年5期
        關(guān)鍵詞:工程菌丙氨酸枯草

        周潔靜

        (崇左市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,遼寧崇左 532200)

        β-丙氨酸是非蛋白氨基酸[1],不僅是一種醫(yī)藥中間體,可以作為維生素B5、泛酸鈣、胍基丙酸和肌肽等藥物的原材料,還可以作為食品添加劑,改善食物味道,提高產(chǎn)品質(zhì)量。β-丙氨酸在機(jī)體的糖酵解過程中參與輔酶A的合成,而輔酶A在機(jī)體中能夠起到激活機(jī)體免疫力的功能[2],促進(jìn)機(jī)體結(jié)締組織的修復(fù)和形成。β-丙氨酸一般采用化學(xué)方法合成,但這種方法生產(chǎn)的β-丙氨酸中含有大量的無機(jī)鹽雜質(zhì),純度低,純化后去掉雜質(zhì)產(chǎn)量更低[3]。

        β-丙氨酸的合成專利在國外,國內(nèi)使用β-丙氨酸時(shí)需要負(fù)擔(dān)一部分專利費(fèi)用,在大量使用的情況下成本投入也高,運(yùn)用構(gòu)建工程菌的方式生產(chǎn)β-丙氨酸,能夠降低污染,降低成本,雖前期構(gòu)建工程菌用時(shí)長,但工程菌構(gòu)建成功后,后期只需投入細(xì)菌生長所需要的營養(yǎng),憑借細(xì)菌生命周期短但繁殖速度快的特點(diǎn),就能夠得到源源不斷的目的產(chǎn)物。根據(jù)工程菌種的不斷優(yōu)化應(yīng)用,隨著產(chǎn)能的不斷提升,經(jīng)濟(jì)效益也能進(jìn)一步的提高。

        基因工程菌生產(chǎn)氨基酸有較多的優(yōu)勢,比如目的性強(qiáng),工作量小,局限性不多。具體應(yīng)用時(shí)是利用DNA重組技術(shù),對(duì)基因進(jìn)行定向誘變,然后選擇和培育我們需要的基因工程菌。就目前來說,可以利用基因工程菌合成L-色氨酸及其衍生物, L-蘇氨酸, L-異亮氨酸等。

        枯草芽孢桿菌可以在特定條件下產(chǎn)生芽孢,是革蘭氏陽性菌,菌落表面粗糙,繁殖速度快,具有鞭毛,顯微鏡下觀察有活動(dòng)能力[4]。因?yàn)榭莶菅挎邨U菌可以在極端條件下,誘導(dǎo)產(chǎn)生芽孢,抗逆性很強(qiáng),而且芽孢可以表達(dá)許多酶類和生長因子等多種蛋白,所以可應(yīng)用在基因工程菌方面。其作為基因工程受體菌,可表達(dá)出近200種原核和真核生物來源的蛋白基因,所以應(yīng)用比較廣泛。

        1 材料與儀器

        1.1 試劑

        枯草芽孢桿菌,歐科拜克生物科技股份有限公司;大腸桿菌,上海魯微科技有限公司;質(zhì)粒,愛迪基因;載體和引物為自行設(shè)計(jì),由上海生物工程公司合成發(fā)回;限制性核酸內(nèi)切酶,上海聯(lián)邁生物工程有限公司生產(chǎn);熱穩(wěn)定性DNA聚合酶,威海同豐海洋生物科技有限公司生產(chǎn);T4DNA連接酶,北京百奧萊博科技有限公司;膠回收試劑盒,北京索萊寶科技有限公司;PCR產(chǎn)物回收試劑盒Maker蛋白Maker和DNA檢測Maker,上海代軒生物科技有限公司;DNA提取試劑盒、buffer(Mg2+)和DNTp,上海生物工程公司生產(chǎn);蛋白胨、營養(yǎng)瓊脂,分析純,廣東環(huán)凱微生物工程有限公司;酵母膏,分析純,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;NaCl,分析純,天津市鼎盛鑫化工有限公司;蒸餾水。

        1.2 培養(yǎng)基配方

        蛋白胨10 g、酵母膏5 g、氯化鈉10 g、瓊脂20 g,用可溶性淀粉調(diào)節(jié)溶液pH至7.0,蒸餾水定容至1000 mL。

        1.3 儀器

        0.1 ~2.5 μL移液槍、0.5~10 μL移液槍,Eppendorf;ULPHW-I型ULPHW超低有機(jī)物(TOC)超純水機(jī),四川優(yōu)普超純科技有限公司;LDZM-40KCS型高壓滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠;veriti96PCR儀,美國ABI;DYCZ-24KF型四板垂直電泳儀,北京六一生物科技有限公司;HH-2恒溫水浴鍋,上海力辰邦西儀器科技有限公司;S-450D型細(xì)胞超聲波破碎儀,美國BRANSON;VM200型漩渦振蕩儀,托摩根生物科技有限公司;DCW-3510臥式低溫恒溫槽,上海左樂儀器有限公司。

        2 工程菌構(gòu)建過程

        2.1 引物設(shè)計(jì)與反應(yīng)體系

        用primer5.0設(shè)計(jì)能夠擴(kuò)增出panD基因的引物,用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取枯草芽孢桿菌基因組DNA,反應(yīng)體系50 μL:模板2 μL、上下引物各1.5 μL、10 倍 Buffer(Mg2+)5.5 μL、dNTPs 2 μL、Taq 酶 0.5 μL、超純水 37 μL。

        將混合體系放入PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增,溫度設(shè)置為:預(yù)變性95℃,5min;變形94 ℃,30 s;退火58 ℃,30 s,30個(gè)循環(huán);延伸72 ℃,30 s;終延伸72 ℃,10 min;保存 4 ℃;

        2.2 檢測回收與篩選

        進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測,用膠回收試劑盒回收panD片段,將回收的片段與3種載體分別連接,并制備好大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞。為了將3種重組構(gòu)建載體和片段的連接物成功轉(zhuǎn)移至大腸桿菌內(nèi),需提前制備好LB培養(yǎng)基滅菌冷卻后,在無菌條件下最大程度上接種2%的菌液,經(jīng)過培養(yǎng)箱培養(yǎng)后通過藍(lán)白斑篩選法篩選出成功轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌落,挑取菌落,再次進(jìn)行PCR驗(yàn)證,用試劑盒提取其中的質(zhì)粒進(jìn)行測序[5]。

        2.3 工程菌構(gòu)建

        實(shí)驗(yàn)中選取Hind Ⅲ和EcoR I兩個(gè)酶切位點(diǎn)分別對(duì)質(zhì)粒和表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切,使表達(dá)載體和細(xì)菌質(zhì)粒具有相同的末端,并用T4噬菌體連接酶連接[6]。將構(gòu)建好的基因表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌內(nèi),得到能夠產(chǎn)生β-丙氨酸蛋白的工程菌。

        2.4 工程菌優(yōu)化

        對(duì)枯草芽孢桿菌中提取的目的基因進(jìn)行優(yōu)化,主要針對(duì)其密碼子panD進(jìn)行序列優(yōu)化,提高目的片段和大腸桿菌的融合度[7]。相應(yīng)提升目的基因的表達(dá)和擴(kuò)增速度,PCR擴(kuò)增時(shí)設(shè)計(jì)程序由40 s改為30 s,隨著試劑和儀器的更新,縮短反應(yīng)體系時(shí)間也不會(huì)對(duì)反映效果造成影響[8]。一套反應(yīng)結(jié)束能有15 min的結(jié)余,節(jié)省了時(shí)間,提高了工作效率。

        2.5 蛋白表達(dá)

        得到工程菌后應(yīng)立即檢驗(yàn)β-丙氨酸是否能夠進(jìn)行正常表達(dá),菌液接種培養(yǎng)基后,37 ℃條件下,設(shè)置搖床以180 r/min的速度對(duì)菌液進(jìn)行搖床震蕩培養(yǎng)。每隔一段時(shí)間對(duì)菌液進(jìn)行檢測,當(dāng)菌液檢測OD值達(dá)到0.5左右時(shí)停止培養(yǎng),向培養(yǎng)基中加入IPTG誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)隔夜。收集繁殖后的菌體,用超聲破碎儀進(jìn)行細(xì)菌的細(xì)胞破碎,隨后通過超速離心得到上清液和沉淀物,用SDS-PAGE進(jìn)行目的蛋白的檢測。也可以選擇將重組菌液直接接種于自動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,30 ℃左右培養(yǎng)過夜。經(jīng)過誘導(dǎo)之后的菌液中加入10 mL L型天冬氨酸在相同的條件下進(jìn)行培養(yǎng)和全細(xì)胞轉(zhuǎn)化,1 h后取1 mL菌樣加入1 mol/L的氫氧化鈉溶液0.1 mL終止反應(yīng)。

        3 結(jié)果與分析

        取800 μL樣品,根據(jù)試劑說明書要求,加入A、B衍生劑,旋渦震蕩儀震蕩3 min,靜置45~60 min,用等體積的正丁醇對(duì)轉(zhuǎn)化的菌液進(jìn)行萃取,萃取后的液體用HPLC的方法檢測β-丙氨酸。

        本實(shí)驗(yàn)通過上述方法一共構(gòu)建了3種工程菌,3種工程菌進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)一號(hào)重組工程菌的表達(dá)量最差,可溶性最低;2號(hào)重組工程菌可溶性最好,表達(dá)量較差;3號(hào)工程菌可溶性一般,表達(dá)量最高。從三種工程菌的表達(dá)量和可溶性的差異性來分析原因可能是:(1)不同載體和枯草芽孢桿菌的目的基因親和力有差異。(2)某些載體上自帶的蛋白標(biāo)簽對(duì)重組蛋白的表達(dá)途徑產(chǎn)生阻礙作用。(3)工程菌受體和構(gòu)建的基因表達(dá)載體融合度不夠,導(dǎo)致表達(dá)量較少。

        本實(shí)驗(yàn)對(duì)工程菌的最初構(gòu)造目的就是能夠得到大量的β-丙氨酸,故在做篩選時(shí)目的蛋白的表達(dá)量是首要考量,雖然3號(hào)菌種的可溶性稍差一些,但是綜合考量下,目前情況下第三種工程菌為最優(yōu)選擇。

        4 結(jié)論

        本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建工程菌的方式來生產(chǎn)β-丙氨酸,在降低了污染,保護(hù)了環(huán)境的同時(shí)也降低了投入成本。雖然前期構(gòu)建工程菌時(shí)的篩選選育等過程用時(shí)長,但工程菌構(gòu)建成功后,后期只需投入細(xì)菌生長所需要的營養(yǎng),憑借細(xì)菌生命周期短但繁殖速度快的特點(diǎn),就能夠得到源源不斷的目的產(chǎn)物。這種產(chǎn)能方式能夠與機(jī)械化流程相結(jié)合,節(jié)省人工成本,高效獲得目的產(chǎn)物,根據(jù)工程菌種的不斷優(yōu)化應(yīng)用,產(chǎn)能不斷提升,經(jīng)濟(jì)效益能夠有進(jìn)一步的提高。

        猜你喜歡
        工程菌丙氨酸枯草
        石油烴微生物降解基因及其工程菌應(yīng)用研究進(jìn)展
        枯草芽孢桿菌在養(yǎng)雞生產(chǎn)中的應(yīng)用
        湖南飼料(2021年4期)2021-10-13 07:32:46
        無償獻(xiàn)血采血點(diǎn)初篩丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶升高的預(yù)防及糾正措施研究
        歲末
        核桃JrLFY基因表達(dá)載體的構(gòu)建及工程菌的篩選
        菌絲霉素NZ2114畢赤酵母工程菌高效發(fā)酵工藝的研究
        廣東飼料(2016年1期)2016-12-01 03:43:01
        纖維素酶基因克隆與表達(dá)研究進(jìn)展
        丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶快速檢測在血站血液采集前應(yīng)用的意義研究
        二水合丙氨酸復(fù)合體內(nèi)的質(zhì)子遷移和氫鍵遷移
        相分離法在丙氨酸分離中的應(yīng)用
        亚洲精品无码高潮喷水在线| 亚洲国产性夜夜综合另类 | 97影院在线午夜| 亚洲欧美日韩精品高清| 一区二区日本免费观看| 国产精品天天看天天狠| 久久精品人人做人人综合| 亚洲欧美一区二区三区国产精| 日本激情久久精品人妻热| 99re6在线视频精品免费下载| 国产免国产免费| 亚洲V在线激情| 国产麻豆国精精品久久毛片| 99国产精品久久久久久久成人热| 精品人妻va出轨中文字幕| 九九99国产精品视频| 国产三级视频在线观看国产 | 亚洲日韩在线中文字幕综合| 欧美巨大性爽| 噜噜噜色97| 成人国产精品三上悠亚久久| 人妻少妇乱子伦精品无码专区电影| 久99久热只有精品国产男同| 久久综合激激的五月天| 人妻少妇不满足中文字幕| 日日碰狠狠添天天爽无码| 国产精品爽爽va在线观看网站| 少妇人妻在线伊人春色| 狠狠色狠狠色综合网| 欧美性猛交内射兽交老熟妇| 欧美丝袜激情办公室在线观看| 日本在线观看一二三区| 亚洲图片日本视频免费| 亚洲欧美日韩专区一| 成人性生交大片免费看i| 亚洲精品久久激情国产片| 76少妇精品导航| 免费国产在线精品三区| 亚洲精品一区二区三区52p| 精品国产午夜理论片不卡| 久久99精品久久久66|