劉瀟雅，徐源洲，賀南南，李輝信，胡 鋒，徐 莉

土壤磺胺類抗生素固相萃取–高效液相色譜法的構(gòu)建與優(yōu)化①

劉瀟雅，徐源洲，賀南南，李輝信，胡 鋒，徐 莉*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，南京 210095)

設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)對(duì)紅壤中磺胺甲惡唑(sulfamethoxazole, SMZ)的萃取方法進(jìn)行優(yōu)化，并結(jié)合高效液相色譜，構(gòu)建了固相萃取-高效液相色譜聯(lián)合測(cè)定法(SPE-HPLC)，并將該方法應(yīng)用于不同抗生素以及不同類型土壤中SMZ的提取測(cè)定。結(jié)果表明，在以乙腈–磷酸鹽緩沖液為提取液、提取液量為10 ml、超聲時(shí)間為15 min、9 ml甲醇淋洗固相萃取柱(HLB)的條件下，紅壤中SMZ的提取效果最優(yōu)，0.25 mg/kg的SMZ回收率達(dá)到85.58%，能夠滿足環(huán)境樣品的分析要求。利用該法提取測(cè)定紅壤中不同抗生素包括3種磺胺類抗生素(磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲基嘧啶)和2種四環(huán)素類抗生素(土霉素、鹽酸四環(huán)素)，結(jié)果表明，當(dāng)抗生素濃度為0.25 mg/kg時(shí)，磺胺類抗生素(SAs)的回收率范圍在67.31% ~ 85.58%，四環(huán)素類抗生素(TCs)的回收率范圍在20.81% ~ 59.33%。利用該法分別提取測(cè)定不同類型土壤中的SMZ回收率，得到潮土中SMZ的回收率最大，達(dá)到92.92%，其次為荒漠土、紅壤、紫色土，最低的回收率出現(xiàn)在黃棕壤，僅為53.62%。據(jù)相關(guān)性分析表明，回收率與土壤電導(dǎo)率(EC)、微生物碳氮比(C/N)呈極顯著負(fù)相關(guān)(<0.01)，與陽離子交換量(CEC)、有機(jī)質(zhì)(SOM)呈顯著負(fù)相關(guān)(<0.05)

土壤；固相萃?。桓咝б合嗌V；正交試驗(yàn)；磺胺類；四環(huán)素類

早在20世紀(jì)60年代，抗生素開始被用作飼料添加劑，以提高飼料利用率和促進(jìn)動(dòng)物生長，在畜禽養(yǎng)殖和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中都有大量使用[1]。近年來，抗生素的使用呈上升趨勢(shì)，并且濫用情況十分嚴(yán)重。作為飼料進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)的抗生素大部分隨排泄物排出體外[2]，部分排泄物作為肥料施用于農(nóng)田，從而造成在土壤中抗生素的不斷積累[3-4]，進(jìn)而對(duì)人體健康和生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重的威脅[5]。在被檢測(cè)出的抗生素種類中，四環(huán)素類檢測(cè)出的濃度最高，磺胺類尤其是磺胺甲惡唑在廢水中檢出頻率最大[6]。

磺胺類藥物(sulfonamides，SAs)是一種人工合成的抗菌藥物，因具有“準(zhǔn)”持久性和潛在的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)而備受關(guān)注[7]。它也是應(yīng)用時(shí)間最早、范圍最廣的一類抗生素[8]。我國是磺胺類藥物的主要生產(chǎn)國，并且產(chǎn)量在持續(xù)增長，在20世紀(jì)90年代中期，我國磺胺類藥物產(chǎn)量就己經(jīng)突破1萬噸，2003年產(chǎn)量更是突破2萬噸。目前，土壤磺胺類污染的三大來源分別是醫(yī)藥行業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖和畜牧業(yè)[9]。

與此同時(shí)，我國也是四環(huán)素類抗生素(tetracy-clines，TCs)的生產(chǎn)、銷售和使用大國[10]。由于四環(huán)素類抗生素在畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)的大量使用，導(dǎo)致其產(chǎn)生的動(dòng)物糞便和尿液中含有較高的四環(huán)素活性成分，進(jìn)而危害生態(tài)環(huán)境[11]。

由于土壤介質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且具有多介質(zhì)、多組分的特點(diǎn)，抗生素的精確測(cè)定依舊是一個(gè)挑戰(zhàn)。尹春艷等[12]建立了固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的分析方法，分析蔬菜大棚土壤中抗生素的含量，其加標(biāo)回收率達(dá)40.0% ~ 80.0%。李彥文等[13]利用超聲提取-固相萃取-高效液相色譜紫外檢測(cè)法，提取土壤中3種TCs和6種SAs，得到TCs回收率達(dá)19.35% ~ 96.77%，SAs回收率達(dá)25.81% ~ 93.50%。郭欣妍等[14]利用超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)分析糞便、土壤和水體中25種獸藥抗生素，加標(biāo)回收率可達(dá)50.0% ~ 121.9%。

但受土壤類型、抗生素類型等因素的影響，同一方法對(duì)土壤中抗生素的提取效率并不一致[15]。Blackwell等[16]使用EDTA-McIlvaine緩沖液作為土壤抗生素提取劑，提取不同土壤類型中的磺胺氯達(dá)嗪(sulfachloropyridazine，SCP)，回收率均在68% ~ 85%的范圍內(nèi)，而對(duì)于土霉素(oxytetracycline，OTC)，在含沙土壤中回收率為58% ~ 75%，在含黏土壤中回收率為27% ~ 51%。因此構(gòu)建適宜于多種土壤、多種抗生素提取測(cè)定的方法十分必要。

除了提取方法外，抗生素的主要檢測(cè)方法有高效液相色譜法[17-18]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[19]等。其中高效液相色譜法相比于操作復(fù)雜、成本昂貴的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法，具有成本低、檢測(cè)迅速、可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化或半自動(dòng)化，同時(shí)靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在多個(gè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。

基于以上，本研究以磺胺甲惡唑(sulfametho-xazole, SMZ)為目標(biāo)抗生素，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，調(diào)整不同提取液、提取液用量、超聲時(shí)間及淋洗體積，優(yōu)化紅壤中SMZ的提取方法，并結(jié)合高效液相色譜測(cè)定，構(gòu)建紅壤中SMZ的最適提取測(cè)定條件，并嘗試將該法應(yīng)用于其他SAs和TCs類抗生素的提取測(cè)定，同時(shí)選擇5種不同類型土壤，包括紅壤、潮土、黃棕壤、紫色土及荒漠土，驗(yàn)證提取測(cè)定方法對(duì)不同類型土壤中SMZ的提取測(cè)定效果。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備與試劑

高效液相色譜儀(Agilent 1260，美國，安捷倫公司)；恒溫振蕩器(金壇市江南儀器廠)；超聲波清洗器(昆山禾超聲儀器有限公司)；真空泵、十二孔固相萃取裝置(東康科技有限公司)；pH計(jì)(德國，Sartorius公司)；HLB固相萃取柱(60 mg/3 ml，美國，Waters 公司)；電子天平(SHIMADZU公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國BUCHI公司)；超純水儀(南京易普易達(dá)發(fā)展有限公司制造)；離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；冷凍干燥機(jī)。

磺胺嘧啶(sulfadiazine，SDZ)、磺胺甲惡唑(sulfa-methoxazole，SMZ)、磺胺甲基嘧啶(sulfamerazine，SMR)、磺胺二甲基嘧啶(sulfamethazine，SDMD)、鹽酸土霉素(oxytetracycline hydrochloride，OTC)、鹽酸四環(huán)素(tetracycline hydrochloride，TC)標(biāo)準(zhǔn)品均購自Sigma公司，純度均大于98%。甲醇、乙腈及甲酸為色譜純。磷酸、磷酸二氫鈉、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA Na2)、檸檬酸、磷酸氫二鈉、甲酸、鹽酸等為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

標(biāo)準(zhǔn)品母液配制：準(zhǔn)確稱取以上抗生素標(biāo)準(zhǔn)品各0.010 0 g，先加入少量甲醇將抗生素溶解，再用超純水稀釋定容至100 ml容量瓶，配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，并放置在4 oC避光保存。

乙腈-磷酸鹽緩沖液配制：準(zhǔn)確吸取1.35 ml磷酸，加入31.2 g磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)溶于1 L超純水中，混合搖勻(pH = 3.0)，再與乙腈等體積混合。

EDTA-McIlvaine緩沖液配制：稱取12.9 g檸檬酸、27.5 g磷酸氫二鈉、37.2 g乙二胺四乙酸二鈉，溶于水中并定容到1 L，混合搖勻(pH = 4.0)

1.2 基質(zhì)加標(biāo)試驗(yàn)

取10 g自然風(fēng)干、研磨粉碎并過100目篩的土壤，并根據(jù)加標(biāo)試驗(yàn)的要求，向處理的土樣中加入0.01、0.25、2 mg/kg的4種SAs(SDZ、SMZ、SMR、SDMD)和2種TCs(OTC、TC)標(biāo)樣(將土壤濕度調(diào)節(jié)為最大持水量的70%)，拌好抗生素的土樣過夜，且過夜時(shí)間大于15 h，以保證抗生素與土壤樣品達(dá)到吸附–解吸平衡，每個(gè)處理設(shè)置4個(gè)重復(fù)。

1.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在抗生素提取過程中，提取液、提取液量、超聲時(shí)間、HLB柱淋洗體積會(huì)影響土壤中抗生素的提取效果[20-21]。因此，本試驗(yàn)選擇以上4個(gè)因素，設(shè)置了4因素3水平L9(34)的正交試驗(yàn)。因素各水平如表1，從中確定從紅壤中提取SMZ的最佳條件。

1.4 提取和凈化方法

準(zhǔn)確稱取土樣1 g，并加入0.4 g乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)和一定體積提取液，混合超聲振蕩提取后，3 500 r/min離心10 min，取上清液，該步驟反復(fù)提取3次，合并提取液，濃縮至5 ml，加超純水稀釋至約18 ml，以保證乙腈含量低于5%[22]。之后，混合上清液以1.0 ml/min的速率通過 HLB柱(使用前需先用6 ml甲醇、6 ml超純水活化)進(jìn)行凈化富集，然后用6 ml超純水清洗HLB柱并在真空條件下干燥30 min，最后用甲醇洗脫柱子，并收集洗脫液。將收集到的洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用1 ml甲醇復(fù)溶，并過0.45 μm有機(jī)濾膜，收集到棕色瓶中，–20℃冷藏待測(cè)。

1.5 不同土壤SMZ加標(biāo)回收率試驗(yàn)

選擇5種不同土壤樣品，包括紅壤、潮土、黃棕壤、紫色土及荒漠土，自然風(fēng)干、研磨粉碎并過100目篩，后按照1.2基質(zhì)加標(biāo)方法制得濃度為0.25 mg/kg的SMZ實(shí)際土壤加標(biāo)樣品，進(jìn)行不同土壤類型加標(biāo)回收率試驗(yàn)，每個(gè)處理設(shè)置4個(gè)重復(fù)。土壤基本理化性質(zhì)見表2。

表1 正交試驗(yàn)因素和水平

表 2 土壤的基本理化性質(zhì)

1.6 樣品測(cè)定

1.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將標(biāo)準(zhǔn)品母液用高純水稀釋成0.02、0.1、0.25、0.5、1、2 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。HPLC待測(cè)，以質(zhì)量濃度()為橫坐標(biāo)，峰面積()為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，同時(shí)得到其線性方程的相關(guān)系數(shù)(2)。

1.6.2 高效液相色譜測(cè)定條件 色譜柱：Shim- packVp-ODS(250 mm × 4.6 mm, 5 μm)；紫外檢測(cè)器，波長270 nm；流動(dòng)相：乙腈︰0.1% 甲酸(80:20)；流量1.0 ml/min；進(jìn)樣量20 μl；柱溫25 ℃。

1.6.3 準(zhǔn)確度測(cè)定 回收率通常用來表示分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，指測(cè)定值與真實(shí)值之間的接近程度，實(shí)測(cè)添加量與標(biāo)準(zhǔn)添加量之比。

1.6.4 方法精密度測(cè)定 精密度是指按照某一方法重復(fù)測(cè)定同一均質(zhì)樣品所得測(cè)定值之間的接近程度，表示分析結(jié)果的重復(fù)性，通常用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviations，RSD)表示，偏差越小說明精密度越高，而當(dāng)精密度越高，則表明偶然誤差越小。試驗(yàn)選取0.25 mg/L與2 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行連續(xù)6次進(jìn)樣，考察各組分的遷移時(shí)間和校正峰面積的重復(fù)性。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

本試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)處理均采用Microsoft Office Excel 2010及SPSS 18.0，圖形繪制均采用Origin 9.0。其中，正交試驗(yàn)方差分析采用單因素ANOVA分析，相關(guān)性采用Pearson分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 正交試驗(yàn)優(yōu)化SMZ提取條件

土壤組分復(fù)雜，提取液的選擇以及提取液用量、超聲時(shí)間及HLB柱淋洗體積均會(huì)影響抗生素提取效率。為提高抗生素提取效果，尋求提取SMZ的最優(yōu)組合，依據(jù)表1正交試驗(yàn)因素和水平表，設(shè)計(jì)4因素3水平L9(34)的正交試驗(yàn)處理為：A1B1C1D1、A1B2C2D2、A1B3C3D3、A2B1C2D3、A2B2C3D1、A2B3C1D2、A3B1C3D2、A3B2C1D3、A3B3C2D1，共 9組，結(jié)果表明9種處理下土壤SMZ平均回收率在18.16% ~ 85.58%，在以乙腈-磷酸鹽緩沖液為提取液、提取液量為10 ml、超聲時(shí)間為15 min、9 ml甲醇淋洗固相萃取柱(HLB)的條件下，紅壤中SMZ的提取效果最優(yōu)，0.25 mg/kg的SMZ回收率達(dá)到85.58%，能夠滿足環(huán)境樣品的分析要求(表3)。

表3 正交試驗(yàn)中9種處理的平均回收率

本研究的最佳提取液為乙腈-磷酸鹽緩沖液，加入乙腈的提取液提取效率得到改善，這是因?yàn)橄啾绕渌軇?，乙腈的極性較強(qiáng)，同時(shí)磷酸溶液作為離子抑制劑可以有效消除色譜峰圖拖尾的現(xiàn)象，從而進(jìn)一步提高測(cè)定效率。這與王娜[8]、郭欣妍等[14]的結(jié)果一致，但本研究中SMZ回收率，與之相比要高，這與本研究優(yōu)化的提取液體積、超聲時(shí)間和固相萃取柱淋洗體積等條件有關(guān)[23-27]。提取液量過少會(huì)造成抗生素提取不完全，而過多又會(huì)造成雜質(zhì)含量提高，檢測(cè)效果不佳。超聲萃取可加快抗生素快速脫離土壤樣品，但超聲過短，目標(biāo)抗生素未完全脫離，會(huì)造成分離不徹底；而時(shí)間過長，則會(huì)損壞目標(biāo)抗生素，并且浪費(fèi)時(shí)間。本研究最佳超聲時(shí)間是15 min，與李云輝等[28]研究結(jié)果一致。

通過正交試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果直觀分析(表4)?？芍饕蛩貙?duì)SMZ回收率的影響主次因素依次為：提取液>HLB柱淋洗體積>提取液量>超聲時(shí)間。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析表

注：表示因素的試驗(yàn)指標(biāo)和，表示各因素的極差。

采用SPSS18.0軟件對(duì)正交試驗(yàn)進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表5所示，可知提取液(>3.55)和HLB柱淋洗體積(>3.55)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響，這與直觀分析中的結(jié)果相一致。而相比于提取液與HLB柱淋洗體積，提取液量與超聲時(shí)間對(duì)結(jié)果存在一定影響，但均未達(dá)到顯著性。因此，正交試驗(yàn)可以通過直觀分析方法分析不同因子的貢獻(xiàn)率，同時(shí)可以運(yùn)用方差分析法對(duì)此進(jìn)行驗(yàn)證。

表5 正交試驗(yàn)方差分析

注：*表示該因素對(duì)試驗(yàn)影響顯著(<0.05)。從分布表中查出臨界值α(fj, fE)，比較值與臨界值的大小，若是F>α(fj, fE)，因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響；若是F<α(fj,fE)，因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無顯著影響。

2.2 方法線性關(guān)系、檢測(cè)限及精密度

將標(biāo)準(zhǔn)品母液用高純水稀釋成0.02、0.1、0.25、0.5、1、2 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，在HPLC檢測(cè)條件下，對(duì)目標(biāo)抗生素OTC、TC、SDZ、SMZ、SMR及SDMD進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)能夠在22 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)快速分離TCs和SAs，其中各目標(biāo)抗生素的色譜峰如圖1，發(fā)現(xiàn)各目標(biāo)抗生素的峰形對(duì)稱，分離效果良好。

(從左至右目標(biāo)抗生素依次為：鹽酸四環(huán)素(TC)、土霉素(OTC)、磺胺甲惡唑(SMZ)、磺胺甲基嘧啶(SMR)、磺胺二甲基嘧啶(SDMD)、磺胺嘧啶(SDZ))

與此同時(shí)，分析得出6種抗生素濃度()與峰面積()的線性關(guān)系，其決定系數(shù)2均大于0.99，并且在3倍信噪比(S/N = 3)下計(jì)算2種TCs及4種SAs的方法檢測(cè)限，得到OTC為10.83 μg/kg，TC為16.02 μg/kg，SDZ為7.69 μg/kg，SMZ為4.86 μg/kg，SMR為6.32 μg/kg，SDMD為5.74 μg/kg(表6)。同時(shí)在10倍信噪比(S/N =10)下所對(duì)應(yīng)的濃度計(jì)算定量限，得到OTC為16.77 μg/kg，TC為21.46 μg/kg，SDZ為13.98 μg/kg，SMZ為9.13 μg/kg，SMR為12.58 μg/kg，SDMD為11.27 μg/kg。同時(shí)選取0.25 mg/L與2 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行連續(xù)6次進(jìn)樣，考察各組分的遷移時(shí)間和校正峰面積的重復(fù)性，得到2種TCs及4種SAs的保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均低于0.31%，峰面積的RSD均低于1.44%(表6)，分離效果、重現(xiàn)性較好。

2.3 不同目標(biāo)抗生素的加標(biāo)回收率(%)及精密度

取空白土樣，分別制得濃度為0.02、0.25、2 mg/kg的4種SAs(SDZ、SMZ、SMR、SDMD)和2種TCs(OTC、TC)標(biāo)樣，按1.4方法處理后，進(jìn)行HPLC測(cè)定，并記錄各化合物的色譜峰面積，計(jì)算各待測(cè)化合物在空白土樣的方法回收率(表7)。同時(shí)，為保證測(cè)定過程的穩(wěn)定性，每隔25個(gè)樣品進(jìn)行1次標(biāo)準(zhǔn)工作液的校正。

表6 不同目標(biāo)抗生素的線性方程、決定系數(shù)、方法檢測(cè)限及精密度

表7 目標(biāo)抗生素的加標(biāo)回收率(%)及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n = 3)

綜合以上結(jié)果表明，利用上述優(yōu)化的提取和凈化方法(即提取SMZ最佳組合A2B1C2D3)，當(dāng)加標(biāo)水平為0.25 mg/kg時(shí)各目標(biāo)化合物的加標(biāo)回收率最適合。SDZ的加標(biāo)回收率為67.31%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為7.73%；SMZ的加標(biāo)回收率為85.58%，RSD為1.76%；SMR的加標(biāo)回收率為70.94%，RSD為1.87%；SDMD的加標(biāo)回收率為68.31%，RSD為2.85%；OTC的加標(biāo)回收率為59.33%，RSD為1.12%；TC的加標(biāo)回收率為20.81%，RSD為4.57%。其中，該方法對(duì)4種磺胺類抗生素的添加回收率均高于65%，具有較高的準(zhǔn)確性，RSD均小于10，具有較高的精密度，說明該方法較適用于環(huán)境樣品中磺胺類抗生素的檢測(cè)。

土壤對(duì)抗生素的吸附緊密程度會(huì)影響對(duì)抗生素的提取效率?？股乇旧淼幕瘜W(xué)性質(zhì)是重要因素之一。土壤與抗生素的吸附與抗生素在土壤–水界面之間的平衡系數(shù)Kd值有關(guān)，TCs具有較高的Kd值，與土壤表現(xiàn)出較好的親和力，易通過陽離子鍵橋、表面配位螯合體以及氫鍵等作用機(jī)制吸附在土壤中，表現(xiàn)出較強(qiáng)的土壤滯留性，不易從土壤中吸附出來[29-31]。而SAs的Kd值較低，在土壤中的吸附能力較弱，易從土壤中吸附出來[29-31]。因此TCs能較長時(shí)間穩(wěn)定地殘留在土壤基質(zhì)中，并且降低了其提取回收率。

此外，土壤理化性質(zhì)也會(huì)影響抗生素的回收率，如楊曉蕾[32]研究表明TCs在酸性、黏粒含量較高的土壤中吸附性強(qiáng)。而本文中對(duì)抗生素加標(biāo)回收率的研究，采用的是紅壤，紅壤為黏壤土、pH偏酸(pH = 4.83)，因此TCs也表現(xiàn)出較低的回收率。

2.4 不同土壤中抗生素加標(biāo)回收率

2.4.1 不同土壤加標(biāo)回收率 如圖2所示，將SMZ施入于不同土壤后，潮土的回收率最大，達(dá)到92.92%，分別高于紅壤、黃棕壤、紫色土及荒漠土7.33%、39.30%、32.89%、6.62%，且黃棕壤的回收率最低，為53.62%。

潮土與荒漠土中SMZ回收率最高，這與土壤pH較高有關(guān)，王娜[8]發(fā)現(xiàn)，pH>6.5使得SMZ陰離子比例大大增加，吸附性減弱，提高回收率。而這兩種土壤pH均大于6.5，因此SMZ回收率較高。而紫色土的pH同樣大于6.5，但其回收率卻依然較低，這可能與土壤其他性質(zhì)有關(guān)，如顆粒組成等[33-34]。

紅壤中SMZ加標(biāo)回收率居中，這可能是紅壤與其他土壤相比黏粒含量較高，并且有機(jī)質(zhì)含量較低的原因。許靜等[35]研究發(fā)現(xiàn)江西紅壤黏粒含量較高，SAs在其土壤中的吸附性增強(qiáng)，易與土壤結(jié)合，不利于轉(zhuǎn)化，同時(shí)因紅壤中有機(jī)質(zhì)含量較低，影響了土壤微生物活性，從而增加了SMZ的穩(wěn)定性。

(圖中小寫字母不同表示不同土壤間SMZ加標(biāo)回收率差異顯著(P<0.05))

黃棕壤提取效率最低，這與其較低的pH有關(guān)，SMZ在pH 4 ~ 6.5范圍內(nèi)的主要存在形式為中性分子，而這些中性分子形態(tài)的有機(jī)分子容易與土壤有機(jī)質(zhì)發(fā)生吸附，同時(shí)黃棕壤的有機(jī)質(zhì)含量最高，這也有利于提高土壤微生物種群的數(shù)量和生物活性，增強(qiáng)對(duì)SMZ的降解作用，進(jìn)而進(jìn)一步影響了黃棕壤中SMZ的穩(wěn)定性與提取效率，致使黃棕壤中SMZ的回收率低。

2.4.2 土壤性質(zhì)與抗生素回收率的關(guān)系 為了進(jìn)一步證明土壤性質(zhì)與抗生素回收率的關(guān)系，進(jìn)行了相關(guān)性分析。表8為SMZ加標(biāo)回收率與5種土壤的pH、陽離子交換量(CEC)、有機(jī)質(zhì)(SOM)、電導(dǎo)率(EC)及微生物碳氮比(C/N)的相關(guān)系數(shù)?？梢钥闯?，土壤EC、C/N與回收率呈極顯著負(fù)相關(guān)，其中，EC：2=–0.660、<0.01，C/N：2=–0.746、<0.01。CEC、SOM與回收率呈顯著負(fù)相關(guān)，其中，CEC：2=–0.547、<0.05，SOM：2= –0.544、<0.05。SOM與回收率呈負(fù)相關(guān)性，與前面的討論相一致，而CEC又是土壤重要的理化性質(zhì)，會(huì)受土壤有機(jī)質(zhì)影響，有機(jī)質(zhì)含量高的土壤，CEC較高，也會(huì)為抗生素提供更多的結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)對(duì)抗生素的吸附，從而減少回收率。同時(shí)，CEC也會(huì)決定EC大小，因?yàn)殡妼?dǎo)率的產(chǎn)生和離子交換相關(guān)，從而EC也表現(xiàn)出與回收率的負(fù)相關(guān)。

表8 不同土壤性質(zhì)與SMZ加標(biāo)回收率相關(guān)性(Pearson 分析法)

注： **表示相關(guān)性達(dá)到<0.01 顯著水平(雙側(cè))；*表示相關(guān)性達(dá)到<0.05 顯著水平(雙側(cè))。

此外，土壤不同性質(zhì)之間存在相關(guān)性，土壤SOM是影響CEC的重要因素，土壤CEC能夠反映土壤的保肥供肥能力，SOM與CEC呈正相關(guān)性；SOM、CEC又分別與微生物生物量C、N呈極顯著正相關(guān)[36-37]。

土壤理化性質(zhì)會(huì)直接影響抗生素在土壤中的穩(wěn)定性。如SOM增加，可以促進(jìn)對(duì)抗生素的吸附，同時(shí)提高土壤微生物種群的數(shù)量和生物活性，降低抗生素的穩(wěn)定性，進(jìn)而降低抗生素的回收率。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了固相萃取-高效液相色譜分析方法檢測(cè)土壤中4種SAs和2種TCs，結(jié)果顯示，整個(gè)分析檢測(cè)方法的檢測(cè)限為2.38 ~ 12.57 μg/kg。該方法對(duì)SAs有較好的提取分離檢測(cè)效果，靈敏度高以及穩(wěn)定性也較好。土壤中SAs的加標(biāo)回收率是67.31% ~ 85.58%，且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于8%，表明其準(zhǔn)確度和精密度能夠滿足環(huán)境樣品的分析要求。比較了不同土壤中SMZ回收率，其中，潮土中SMZ的回收率最大，達(dá)到92.92%，其次為荒漠土、紅壤、紫色土及黃棕壤，且黃棕壤的回收率最低，為53.62%。SMZ回收率與土壤EC、C/N呈極顯著負(fù)相關(guān)(<0.01)，與CEC、SOM呈顯著負(fù)相關(guān)(<0.05)。

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Optimization and Detecting Sulfamethoxazole in Soils Using Solid Phase Extraction-High Performance Liquid Chromatography

LIU Xiaoya, XU Yuanzhou, HE Nannan, LI Huixin, HU Feng, XU Li*

(College of Resources and Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

In this paper,an orthogonal experiment was designed tooptimize the extraction method ofsulfamethoxazole (SMZ) in red soil and a solid phase extraction-high performance liquid chromatography (SPE-HPLC) method was built for SMZ detection. The method was used to determine different antibiotics including SMZ from different soils. The results showed that the optimal extraction conditions for SMZ in the red soil was 10 ml acetonitrile-phosphate buffer as the extracting solution, ultrasonic oscillation time for 15 min and 9 ml methyl alcohol elution. The recovery of 0.25 mg/kg SMZ was 85.58%, indicating this method applicable for the environmental sample analysis. Meanwhile, this method was used to extract other antibiotics, including three sulfa antibiotics (sulfadiazine, sulfamerazine, sulfadimidin) and two tetracycline antibiotics (oxytetracycline, tetracycline), the average recoveries of 0.25 mg/kg sulfas and tetracyclines were 67.31%–85.58% and 20.81%–59.33%. Under HPLC with UV detection, the detection limit of SMZ was 2.38 μg/kg, showed a good accuracy. Simultaneously, the detection limits of sulfa and tetracycline antibiotics were between 2.38~12.57 μg/kg, indicating this method better suited to detect sulfa antibiotics in soil according to the laboratory quality control standard. Besides, the method was also used to test SMZ recoveries from different soil types, the largest SMZ recovery rate (92.92%) was obtained in fluvo-aquic soil, followed by desert soil, red soil and purple soil, while the lowest recovery rate (53.62%) were in yellow-brown soil. The correlation analysis showed that a significant negative correlation between recovery rate and soil EC, C/N (<0.01), and CEC, SOM (<0.05).

Soil; Solid-phase extraction; High performance liquid chromatograph; Orthogonal experiment; Sulfonamide; Tetracycline

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(KYZ201626)，公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(201503121)和中國博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目(2016M591856)資助。

xuli602@njau.edu.cn)

劉瀟雅(1992—)，女，江蘇淮安人，碩士研究生，主要從事抗生素污染土壤的化學(xué)–微生物聯(lián)合修復(fù)研究。E-mail: 18260068658@163.com

X830.2

A

10.13758/j.cnki.tr.2019.06.012