石浩， 胡靜敏， 陳忻， 彭安安

佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，廣東 佛山 528000

前言

金屬礦山開采所引起的環(huán)境問題具有潛伏性、積累性和長(zhǎng)期性。在滿足資源需求的同時(shí)產(chǎn)生大量的尾礦，尾礦的風(fēng)化、氧化及采礦廢棄物處置給礦區(qū)及周邊地區(qū)造成嚴(yán)重的重金屬污染風(fēng)險(xiǎn)。其中，重金屬鎘(Cd)污染的問題近年來備受關(guān)注。根據(jù)2014年公布的全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查結(jié)果，我國(guó)土壤重金屬污染總的超標(biāo)率為16.1%，其中鎘的點(diǎn)位超標(biāo)率位居榜首，達(dá)到7.0%[1]。對(duì)全國(guó)22個(gè)省72個(gè)礦區(qū)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明[2]，我國(guó)土壤Cd的地累積指數(shù)(Igeo)偏高，平均濃度遠(yuǎn)超我國(guó)土壤污染風(fēng)險(xiǎn)管控標(biāo)準(zhǔn)(GB 15618—2018)。鎘元素在地殼中含量極少，無單獨(dú)的礦床，通常與Zn、Pb、Cu、Mn硫化物伴生。土壤中的重金屬鎘一方面是來源于巖石風(fēng)化和火山活動(dòng)等自然因素；另一方面則是由工業(yè)活動(dòng)、污水灌溉、牲畜糞便、磷肥施用等人為因素導(dǎo)致[3]。因此金屬硫化礦特別是鉛鋅礦區(qū)附近的農(nóng)田土壤重金屬鎘污染尤其嚴(yán)重[4,5]。硫化尾礦中的鎘在氧化條件下釋放，隨地表水遷移或滲入地下水，污染整個(gè)礦區(qū)甚至更大區(qū)域，最終可通過食物鏈的富集作用，影響動(dòng)植物和人類健康[6-8]。國(guó)內(nèi)外針對(duì)土壤鎘污染修復(fù)進(jìn)行了諸多嘗試，如物理客土法、玻璃化法、電動(dòng)修復(fù)法、化學(xué)淋洗、改良劑固定等，這些方法存在著修復(fù)成本高、易產(chǎn)生二次污染、易導(dǎo)致土壤退化等缺點(diǎn)，不適合大范圍使用[9-11]；生物法如植物法吸收重金屬有一定的效果，但也存在超積累植物品種的適應(yīng)性、修復(fù)周期和效率問題的瓶頸[10]。數(shù)量龐大、種類繁多的微生物是生物地球化學(xué)循環(huán)的參與者，在土壤重金屬的形態(tài)轉(zhuǎn)化過程中扮演重要角色。采用微生物修復(fù)法操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)且環(huán)境友好，本文就近年來國(guó)內(nèi)外有關(guān)土壤Cd污染的微生物修復(fù)方面的研究和實(shí)踐進(jìn)行綜述。

1 鎘污染土壤的微生物修復(fù)

土壤中的微生物無法直接分解重金屬Cd，但微生物代謝產(chǎn)物及其代謝活動(dòng)產(chǎn)生的能量可作用于Cd的氧化還原或沉淀過程，通過吸附、固定的方式穩(wěn)定土壤中的重金屬Cd，降低其遷移性和生物有效性；或改變鎘的化學(xué)形態(tài)，影響其在土壤可溶相和不溶相之間的平衡，進(jìn)而通過淋溶或植物吸收的方式去除。

1.1 吸附與固定

Cd的微生物固定化可以通過微生物作用下不溶性有機(jī)或無機(jī)化合物對(duì)Cd的沉淀或結(jié)晶，或微生物對(duì)Cd的吸附、吸收和細(xì)胞內(nèi)隔離等來實(shí)現(xiàn)[12-13]。按照作用位置，又可分為胞外作用和胞內(nèi)作用。

1.1.1 胞外作用

Cd2+的胞外作用是細(xì)胞表面的活性基團(tuán)或胞外聚合物與Cd離子間發(fā)生的物理化學(xué)反應(yīng)，包括靜電吸附、離子交換和絡(luò)合反應(yīng)等[14]。外界環(huán)境中的Cd最先接觸到微生物的胞外聚合物(EPS)。胞外聚合物是由多糖、蛋白質(zhì)和少量的脂類、核酸等構(gòu)成的有機(jī)高分子聚合物，胞外聚合物表面具有大量疏水區(qū)，且含有豐富的羧基、羰基、羥基、磷?；⒘蛩岣?、磷酸根等負(fù)電性官能團(tuán)[15]，能夠與Cd結(jié)合形成生物固定。付林波[16]對(duì)比提取EPS前、后的黃孢原毛平革菌(PhanerochaetechrysosporiumBKMF 1767(CCTCC AF96007))吸附重金屬Cd的情況，發(fā)現(xiàn)未提取胞外聚合物的菌體吸附量明顯優(yōu)于提取后的菌體。魏德州等[17]采用透射電鏡、紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)細(xì)胞與Cd離子的吸附過程主要與細(xì)胞多糖中的羥基、羧基及蛋白質(zhì)中的氨基有關(guān)。Zhang等[18]采用透射電鏡和X-射線能譜分析發(fā)現(xiàn)Cd在Burkholderiafungorum細(xì)胞表面的沉積，結(jié)合紅外光譜分析和X射線粉末衍射揭示了胞外多糖對(duì)Cd的吸附效果。張海鷗等[19]發(fā)現(xiàn)深海菌株SCSE425-7的可溶性胞外多糖能提高細(xì)菌的抗Cd水平，菌株SCSE709-6產(chǎn)生的不可溶性的胞外聚合物能夠有效螯合Cd離子。鐵載體是微生物產(chǎn)生的低分子有機(jī)化合物，可在濃縮Fe轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞的同時(shí)通過絡(luò)合作用影響Cd的生物可利用性。晉銀佳等[20]證實(shí)熒光假單胞菌代謝產(chǎn)生的鐵載體能夠絡(luò)合固定Cd2+，減少油麥菜對(duì)鎘的吸收。

微生物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜上存在的羥基(-OH)、羧基(-COOH)以及巰基(-SH)等活性基團(tuán)可通過絡(luò)合、配位結(jié)合以及離子交換等化合反應(yīng)吸收Cd2+[21, 22]。Zhang等發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁上氨基基團(tuán)會(huì)與Cd2+發(fā)生絡(luò)合[18]。余雪梅等[23]用FTIR分析耐鎘芽孢桿菌Bacillussp. PFYN01吸附Cd2+后的菌株表面，發(fā)現(xiàn)與Cd2+結(jié)合的官能團(tuán)有酰胺基(N-H)、羧基(COOH)、羥基(O-H)、烴基(C-H)、羰基(C=O)等，說明細(xì)菌胞外的多聚糖、蛋白質(zhì)和脂肪酸等參與了吸附過程。林雁冰[24]通過能譜分析發(fā)現(xiàn)放線菌細(xì)胞表面形成的沉積物中存在大量的Cd，紅外光譜分析表明主要與-OH、-NH2、-COOH、-CO-NH-、-CN等功能基團(tuán)有關(guān)。Huang[25]發(fā)現(xiàn)蠟狀芽孢桿菌RC-1細(xì)菌的活細(xì)胞和死細(xì)胞對(duì)Cd2+都具有生物吸附能力，分別達(dá)24.01 mg/g和31.95 mg/g。

1.1.2 胞內(nèi)作用

細(xì)胞內(nèi)部作用主要是指微生物細(xì)胞對(duì)金屬鎘的累積。微生物利用細(xì)胞代謝活動(dòng)提供的能量通過親脂滲透、離子通道、細(xì)胞內(nèi)吞、離子泵、絡(luò)合后滲透、載體運(yùn)輸?shù)葯C(jī)制將胞外Cd運(yùn)輸?shù)桨麅?nèi)，然后經(jīng)生物沉淀過程固定、儲(chǔ)存在脂質(zhì)囊泡，或與細(xì)胞內(nèi)金屬硫蛋白等發(fā)生結(jié)合轉(zhuǎn)化[26]。Rani等[27]發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)seudomonasputida62BN能顯著降低植物與土壤中Cd的含量，且P.putida62BN細(xì)胞內(nèi)積累了大量的Cd。黃飛[28]發(fā)現(xiàn)在Cd2+濃度>20 mg/L時(shí)，蠟狀芽孢桿菌(BacilluscereusRC-1)胞外Cd2+吸附量遠(yuǎn)大于胞內(nèi)積累量，吸附過程以胞外吸附為主；而在Cd2+濃度<20 mg/L下時(shí)，胞內(nèi)積累量大于胞外吸附量，吸附過程以胞內(nèi)積累為主。金屬硫蛋白(Metallothionein, MT)是一種半胱氨酸含量高、熱穩(wěn)定好的蛋白質(zhì)，含有大量極易與重金屬Cd離子結(jié)合的巰基[29]，與微生物對(duì)重金屬的累積、及其重金屬環(huán)境耐受能力等相關(guān)。Suleman等[30]發(fā)現(xiàn)金屬硫蛋白基因重組大腸桿菌E.coliBL21 DE3對(duì)Cd2+的吸附量與比對(duì)照提高19倍。湯曉燕[31]將金屬硫蛋白表達(dá)在酵母(Saccharomycescerevisiae)細(xì)胞表面后，重組菌對(duì)Cd2+的吸附去除率提高了19.39%。張弛等[32]將融合表達(dá)金屬硫蛋白基因的工程菌用于污水重金屬處理，發(fā)現(xiàn)MT工程菌對(duì)Cd2+有較好的親和性。Kuroda等[33]將酵母源金屬硫蛋白展示在S.cerevisiae的細(xì)胞表面，其Cd2+的吸附能力提高到27.1 nmol/mg細(xì)胞干重，為對(duì)照的12倍。

1.2 溶解與活化

微生物的代謝活動(dòng)產(chǎn)生大量的低分子有機(jī)酸，如甲酸、乙酸、檸檬酸、乙二酸、草酸等，這些有機(jī)酸改變土壤pH值，釋放出可絡(luò)合溶解的鎘離子和含鎘礦物中的鎘元素，促進(jìn)鎘進(jìn)入土壤液相，增加其遷移性，該方式有利于減少重金屬對(duì)局部土壤的危害。早在20世紀(jì)80年代，真菌分泌的氨基酸、有機(jī)酸和其他代謝產(chǎn)物可以溶解重金屬及含重金屬的礦物就有文獻(xiàn)報(bào)道[34]。Chanmugathas等[35]發(fā)現(xiàn)土壤微生物能夠在土壤濾瀝過程中通過分泌有機(jī)酸絡(luò)合并溶解土壤中的重金屬Cd。王京文等[36]研究發(fā)現(xiàn)接種耐鎘菌株Arthrobactersp. m6后，礦區(qū)土壤中水溶態(tài)Cd增加2倍，可交換態(tài)增加16%，鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)和有機(jī)物結(jié)合態(tài)的Cd不同程度的下降，菌株使土壤難溶態(tài)Cd向生物有效態(tài)轉(zhuǎn)化。Xu等[37]采用Cd污染土壤中分離到的異養(yǎng)菌和礦井酸性廢水中分離到的自養(yǎng)菌混合浸出處理Cd重度污染稻田土壤，得到了較好的Cd去除率(32.09%)，且發(fā)現(xiàn)自養(yǎng)和異養(yǎng)菌株的協(xié)同代謝活性可能是除pH和ORP(氧化還原電位)外的Cd去除決定因素。Hao等[38]采用混合營(yíng)養(yǎng)嗜酸菌的兩步生物淋溶去除了污染稻田土壤總Cd的34%和有效Cd的87%，且盆栽實(shí)驗(yàn)接種混合菌的空心菜組織Cd濃度提高了78%。土壤中重金屬常以硫化物或磷酸鹽的形式存在，微生物分泌有機(jī)酸促進(jìn)重金屬硫化物或磷酸鹽溶解獲取硫和磷等營(yíng)養(yǎng)元素的同時(shí)，也提高了生物有效態(tài)重金屬的含量。楊卓等[39]發(fā)現(xiàn)巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)和膠質(zhì)芽孢桿菌(Bacillusmucilaginosus)混合微生物制劑產(chǎn)生的有機(jī)酸能促進(jìn)土壤有效態(tài)磷、鉀的釋放，使土壤中Cd的有效態(tài)含量提高15.02%，同時(shí)促進(jìn)印度芥菜(Brassicajuncea)的生長(zhǎng)及其地上部分Cd的含量增加17.93%。Wei等[40]發(fā)現(xiàn)富集的鐵氧化微生物[主要為Alicyclobacillusferripilum(46.4%)和Alicyclobacillusaeris(35.6%)]浸出處理12 d可去除豬糞中90.5%的Cd，使生物有效磷含量上升25.9%，能較好地保留肥料性能且環(huán)境友好。

微生物具有較強(qiáng)的分解代謝能力和較高的代謝速率，修復(fù)重金屬污染成本低，環(huán)境污染小，相關(guān)理論研究和實(shí)踐探索已取得一定進(jìn)展。但由于土壤微生物代謝活動(dòng)對(duì)土壤環(huán)境條件變化的敏感，外源功能微生物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)、生長(zhǎng)代謝調(diào)控、與土著微生物的相互作用等機(jī)制較為復(fù)雜，單純的微生物技術(shù)在實(shí)地修復(fù)應(yīng)用時(shí)往往與實(shí)驗(yàn)室結(jié)果出現(xiàn)較大差別。而微生物方法與其他修復(fù)方法的綜合運(yùn)用可克服單項(xiàng)修復(fù)技術(shù)的局限，提高污染土壤的修復(fù)速率與效率，成為近年來許多研究者新的選擇。

2 微生物-植物協(xié)同修復(fù)

微生物-植物協(xié)同修復(fù)是利用植物及其相關(guān)微生物的相互作用規(guī)律來實(shí)現(xiàn)土壤鎘污染的原位修復(fù)。微生物主要通過促進(jìn)植物對(duì)Cd吸收，進(jìn)而移除植物的可收割部分實(shí)現(xiàn)土壤重金屬濃度的降低；或通過穩(wěn)定土壤中的鎘，以及抑制植物對(duì)鎘的吸收而降低農(nóng)作物中Cd的含量?jī)煞N方式來實(shí)現(xiàn)，是一種較為“經(jīng)濟(jì)的、非侵入性”的方法[41]。

2.1 微生物促進(jìn)植物生長(zhǎng)和鎘的累積

植物與其生長(zhǎng)環(huán)境中的微生物關(guān)系密切。許多微生物進(jìn)化出耐受高Cd2+濃度的能力，即使在高濃度的Cd環(huán)境下，抗Cd的植物促生菌(Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)仍具有分泌吲哚乙酸、鐵載體和ACC脫氨酶的能力，后者能促進(jìn)植物生長(zhǎng)獲得更大的生物量和更好的Cd吸收效果，如黃文[42]從某礦區(qū)重金屬污染土壤中分離篩選出一株能產(chǎn)生表面活性劑的假單孢菌屬細(xì)菌Pseudomonassp. LKS06，在促進(jìn)龍葵的生長(zhǎng)同時(shí)顯著提高植物對(duì)鎘的富集能力，使其根和地上部鎘的總累積量最高分別比對(duì)照增加36.7%和42.4%。嗜酸性微生物的活動(dòng)往往改變土壤的酸堿環(huán)境，有利于重金屬Cd的溶解和遷移，如劉衛(wèi)敏[43]添加氧化亞鐵硫桿菌菌液到礦區(qū)土壤盆栽的黑麥草，顯著増加了根際土壤的酸溶態(tài)Cd含量，且黑麥草地上和地下部分Cd含量最大增量分別達(dá)347.45%和743.94%。與植物共生的微生物如菌根真菌等在幫助植物在促進(jìn)宿主營(yíng)養(yǎng)吸收的同時(shí)，有可能將積累的Cd轉(zhuǎn)移到高等植物中，如高玉倩[44]接種濃度2.5%的叢枝菌根真菌摩西球囊霉菌根(Glomusmosseae)促進(jìn)了鴨跖草對(duì)尾礦中Cd的吸收。

2.2 微生物抑制植物對(duì)Cd的吸收

重金屬鎘對(duì)人類健康的最大威脅來自食物鏈的累積，因此，降低農(nóng)作物可食用部分鎘的積累是解決鎘污染土壤持續(xù)安全生產(chǎn)的有效途徑之一。叢枝菌根真菌可將鎘轉(zhuǎn)化為毒性較小的不活躍形式來增強(qiáng)水稻抗Cd的能力，通過菌絲將鎘滯留在根部抑制其轉(zhuǎn)移，同時(shí)還能改善植株的磷營(yíng)養(yǎng)狀況，增加根系磷的吸收[45]。羅方舟等[46]發(fā)現(xiàn)接種叢枝菌根真菌摩西球囊霉(Glomusmosseae，GM)能同時(shí)降低旱稻對(duì)Cd的富集和轉(zhuǎn)運(yùn)能力，從而顯著降低其各部分Cd含量，特別是籽粒中的Cd含量被降低了26.8%～57.1%。Li等[47]發(fā)現(xiàn)水稻(OryzasativaL.)與兩種叢枝菌根真菌Rhizophagusintraradices(RI)和Funneliformismosseae(FM)共生能夠降低植株地上部和根系的Cd濃度，縮小在植株嫩枝和根部中無機(jī)態(tài)和水溶性態(tài)Cd的濃度和比例。胡振琪[48]研究發(fā)現(xiàn)，接種叢枝菌根真菌Glomusdiaphanum使玉米的生物量增加了5.79倍，地上部分鎘含量降低了53.9%，地上部分磷含量增加了4.6倍。

微生物-植物共修復(fù)可以彌補(bǔ)微生物修復(fù)技術(shù)與植物修復(fù)技術(shù)兩者在土壤污染物修復(fù)中的不足,提高生物修復(fù)效率，但實(shí)際應(yīng)用中構(gòu)建合適的微生物和植物的修復(fù)模式是其重點(diǎn)和難點(diǎn)[49]，離大規(guī)模推廣尚有一定距離。

3 微生物-土壤調(diào)理劑聯(lián)合修復(fù)

添加土壤調(diào)理劑的原位穩(wěn)定化技術(shù)是目前修復(fù)重金屬污染土壤中較普遍且廉價(jià)高效的技術(shù)之一。土壤調(diào)理劑可通過沉淀、吸附、絡(luò)合或氧化還原作用調(diào)控土壤的理化性質(zhì)，從而改變土壤中重金屬的賦存形態(tài)，降低其生物有效性、水溶性及擴(kuò)散性等性質(zhì)，減少重金屬對(duì)土壤環(huán)境的危害和影響；同時(shí)，土壤微生態(tài)環(huán)境和土壤微生物群落多樣性也得到改善和提高[50]。土壤微生物是表征土壤功能的敏感指標(biāo)，微生物數(shù)量的增加和多樣性的改善對(duì)土壤解毒和植物生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，因此，微生物菌劑配合土壤調(diào)理劑使用，是土壤重金屬污染修復(fù)特別是農(nóng)業(yè)用地修復(fù)的有效的戰(zhàn)略之一[51]。

常用的土壤調(diào)理劑有黏土礦物、磷酸鹽化合物、石灰、金屬氧化物、有機(jī)廢物和生物炭等。功能微生物聯(lián)合生物炭(Biochar，BC)使用，近年來在重金屬污染土壤修復(fù)應(yīng)用領(lǐng)域備受關(guān)注[52-54]。生物炭是厭氧或限氧條件下生物質(zhì)熱轉(zhuǎn)化的富碳材料，一般為堿性，且具有多孔結(jié)構(gòu)、比表面積大、表面活性位點(diǎn)多等特點(diǎn)，能夠調(diào)節(jié)土壤pH值，有很強(qiáng)的重金屬吸附親和力[55]。研究表明，作為土壤調(diào)理劑，生物炭可通過表面豐富的羥基、羧基和酚基以及芳族結(jié)構(gòu)上的π電子富集域等有機(jī)官能團(tuán)來捕集可溶性Cd，從而降低其遷移率和生物利用度[55-57]。生物炭的多孔性和表面特性可為土壤微生物生長(zhǎng)與繁殖提供良好的棲息環(huán)境與養(yǎng)分，增加微生物豐度，因此，生物炭的加入可改變土壤性質(zhì)、土壤酶活性和微生物群落結(jié)構(gòu)[58]，對(duì)重金屬污染土壤的原位生物修復(fù)有積極意義。Tu等[59]以玉米秸稈生物炭負(fù)載耐重金屬假單胞菌Pseudomonassp. NT-2作用于污染礦山土壤，75 d盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，5%生物炭菌劑的施用可使土壤pH維持在7.2～7.5之間，與單一生物炭調(diào)理劑相比可顯著提高Cd殘?jiān)鼞B(tài)的比例、降低可交換態(tài)和碳酸鹽結(jié)合態(tài)的比例。Wu等[60]把植物促生菌Serratiamarcescensstrain SNB6成功地固定在生物炭上組合成復(fù)合生化材料(BCM)，并結(jié)合超累積植物香根草(ChrysopogonzizanioidesL.)構(gòu)建了生物炭-促生菌-超累積植物的土壤重金屬鎘污染修復(fù)體系，該體系顯著可提高土壤可提取態(tài)Cd的比例、香根草的生物量和鎘含量，同時(shí)生物炭與菌株表面的官能基團(tuán)也有助于Cd的固定化，為重金屬Cd的現(xiàn)場(chǎng)治理提供了一條新的途徑。但由于目前關(guān)于生物炭異質(zhì)性、環(huán)境穩(wěn)定性以及對(duì)其他環(huán)境因子的影響機(jī)制的研究還有待完善[61,62]，微生物與生物炭在土壤修復(fù)過程中的作用機(jī)制及效果等還有待進(jìn)一步研究。

4 展望

土壤鎘污染是一個(gè)全球性問題。由于鎘在地殼中含量極少，通過微生物活動(dòng)改變土壤結(jié)構(gòu)、pH值、氧化還原態(tài)、土壤酶等物理生化性質(zhì)影響重金屬Cd的溶解性和生物有效性，實(shí)現(xiàn)土壤原位修復(fù)的是相對(duì)經(jīng)濟(jì)、環(huán)境友好的選擇。綜觀國(guó)內(nèi)外有關(guān)研究，篩選具有一定Cd耐受能力的功能微生物，對(duì)其在Cd的吸附、固定或者促進(jìn)溶解改變Cd的生物有效性方面的功能、以及在一定環(huán)境下與其他微生物互作來實(shí)現(xiàn)土壤重金屬Cd修復(fù)的過程進(jìn)行研究，仍是當(dāng)前該項(xiàng)技術(shù)的關(guān)鍵。由于礦山土壤環(huán)境的特殊性，礦山及周邊重金屬污染往往是伴生的多種重金屬的復(fù)合污染，有些區(qū)域還受到選礦藥劑的影響，如鉛鋅礦周邊Cu、Cd、Pb、Zn、As等重金屬污染可能同時(shí)存在且相互影響，Cd、As在土壤中具有相反的地球化學(xué)行為[63]等，單一微生物菌劑的使用或單純的微生物修復(fù)方法難以在實(shí)際應(yīng)用中達(dá)到理想效果，多種方法的聯(lián)合使用來提高修復(fù)效率，如利用根際和共生微生物與超累積植物的互作或采用土壤調(diào)理劑(如生物炭等)與功能微生物配合使用等，具有較大發(fā)展空間。此外，隨著基因工程和納米技術(shù)的發(fā)展，在風(fēng)險(xiǎn)可控的前提下采用轉(zhuǎn)基因方法將重金屬Cd抗性基因引入微生物細(xì)胞及其相關(guān)植物細(xì)胞，表達(dá)天然螯合劑、功能蛋白質(zhì)或與Cd的形態(tài)轉(zhuǎn)化相關(guān)的酶等來增強(qiáng)功能微生物的修復(fù)能力，也將是重要發(fā)展方向。