馬 瑞，劉志輝

氧化石墨烯(Graphene oxide, GO)是石墨烯衍生物，與其不同之處在于二維單層碳原子結(jié)構(gòu)的邊緣和基底面引入大量含氧官能團(tuán)[1]，也正因?yàn)檫@些官能團(tuán)的存在使其容易通過(guò)氫鍵、共價(jià)鍵、靜電相互作用與其他活性生物分子或支架材料結(jié)合，參與生物活性因子的負(fù)載以及復(fù)合材料的構(gòu)建，進(jìn)一步完善了支架材料的理化和生物性能[2-3]，因此GO在骨組織工程領(lǐng)域被廣泛研究。

1 GO對(duì)支架材料性能的影響

1.1 力學(xué)性能

支架材料作為填充骨缺損的三維結(jié)構(gòu)，必須要有一定的機(jī)械強(qiáng)度才能夠維持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。殼聚糖(chitosan, CS)、膠原、藻酸鹽等因生物相容性好而被廣泛研究，但機(jī)械強(qiáng)度低而導(dǎo)致應(yīng)用受限。GO表面富含的大量官能團(tuán)易于與其他材料結(jié)合，因此被廣泛應(yīng)用于復(fù)合材料的制備，進(jìn)而提高材料的機(jī)械性能。Ruan等[4]制備GO-羧基化殼聚糖復(fù)合支架，因CS富含氨基，與GO產(chǎn)生交聯(lián)后，復(fù)合支架的彈性模量和硬度，較對(duì)照組支架分別提高了2.75倍和3.51倍。聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate，PMMA)在生物醫(yī)學(xué)中應(yīng)用廣泛，并首先被用于牙科領(lǐng)域，但不足之處在于其機(jī)械強(qiáng)度低。Paz等[5]分別將質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%～1.0%的GO作為PMMA骨水泥的增強(qiáng)劑加入其中，研究發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≤0.25%時(shí)，PMMA/GO骨水泥的機(jī)械強(qiáng)度得到了顯著提高。根據(jù)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，總結(jié)出GO增強(qiáng)復(fù)合材料機(jī)械性能原因可能如下：一，GO表面富含的官能團(tuán)(例如羧基和羥基)易于與其他材料結(jié)合，增加兩者的交聯(lián)度，交聯(lián)度的增加對(duì)支架原聚合物鏈的移動(dòng)性施加了更大的約束力，提高了界面強(qiáng)度，進(jìn)而支架的機(jī)械性能得以改善[6]；二，GO對(duì)于機(jī)械性能的改善具有濃度依賴(lài)性，當(dāng)濃度過(guò)低時(shí)，無(wú)法形成充分的交聯(lián)，而當(dāng)濃度過(guò)高，GO不能很好地分散在復(fù)合基質(zhì)中，形成單一的聚合物；三，GO作為納米級(jí)填料可以在材料斷裂時(shí)引起裂紋前沿的偏離并阻礙裂紋的擴(kuò)展進(jìn)而提高機(jī)械性能。這就要求在選擇GO來(lái)增加改善支架的機(jī)械性能時(shí)，我們要考慮其濃度以使其與其他材料形成充分的交聯(lián)。

1.2 降解性能

骨支架材料作為異物置入骨缺損區(qū)域，應(yīng)該具有降解性能同時(shí)降解產(chǎn)物無(wú)毒性。研究表明，GO具有兩種生物降解途徑，一種是水性自降解，GO在水中時(shí)不斷地發(fā)生結(jié)構(gòu)的變化，包括碳—碳鍵的斷裂，最后降解為腐殖酸樣結(jié)構(gòu)[7]。另一種是酶促降解[8-9]， Mukherjee[10]發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生一種髓過(guò)氧化物酶，其主要介導(dǎo)GO的降解，而且GO的降解速率對(duì)該酶具有濃度依賴(lài)性，髓過(guò)氧化物酶濃度越高，降解速率越快，而且利用人支氣管上皮細(xì)胞系作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ万?yàn)證了GO降解后的混合物不會(huì)引起遺傳毒性。Purohit等[11]將不同濃度的GO與明膠(gelatin, Gn)、藻酸鹽制備納米復(fù)合支架，研究發(fā)現(xiàn)28 d后，觀察到空白組支架的降解率為57%，而GO組降解率約為30%，而且隨著GO濃度的增加降解速率減慢，該降解速率有利于骨再生。綜上所述，GO是可降解的并且降解產(chǎn)物無(wú)明顯毒性，另外GO與其他材料復(fù)合后會(huì)改善原支架的降解速率，為骨再生提供更有利的條件，但對(duì)于GO在體內(nèi)降解周期以及具體的降解途徑和排泄途徑仍需要進(jìn)一步研究。

2 GO對(duì)細(xì)胞行為的改善

在骨組織工程中，種子細(xì)胞在支架材料上的粘附是細(xì)胞增殖及成骨分化形成新生組織修復(fù)骨缺損的基礎(chǔ)，而支架材料上細(xì)胞的增殖分化決定了骨重建的成功與否。良好的細(xì)胞粘附是細(xì)胞具有紡錘狀的形態(tài)以及絲狀偽足的延伸，而評(píng)估骨支架材料對(duì)干細(xì)胞成骨分化的影響通常是在分子水平上進(jìn)行，Runx2作為骨轉(zhuǎn)錄因子，在成骨細(xì)胞形成和分化中扮演重要角色，骨鈣素(osteocalcin, OC)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、骨鈣蛋白(osteocalcin, Ocn)、Ⅰ型膠原(type Ⅰ collagen, COL-Ⅰ)可以作為干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的標(biāo)記物[12-13]。GO對(duì)細(xì)胞粘附、增殖以及成骨分化能力的影響主要通過(guò)以下幾個(gè)方面發(fā)揮作用的。

2.1 對(duì)蛋白的吸附

研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)于支架材料的粘附需要一種媒介，而血清蛋白(紐蛋白、纖維連接蛋白等)可以扮演這種角色[14]，GO的基面和邊緣上存在的環(huán)氧基、羧基和羥基可通過(guò)共價(jià)鍵、靜電鍵和氫鍵與蛋白質(zhì)發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的粘附，Lee等[15]驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)，他們將間充質(zhì)干細(xì)胞分別在GO膜和聚二甲基硅氧烷膜(polydimethylsiloxane,PDMS)上培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)GO吸附高達(dá)25%的血清蛋白，而PDMS上的吸附率<1%，所以GO組的細(xì)胞觀察到絲狀偽足的延伸和突出，而PDMS組細(xì)胞呈圓形態(tài)。Luo[16]通過(guò)靜電紡絲技術(shù)將GO摻入聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米纖維中，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組支架的蛋白質(zhì)吸附能力以及對(duì)地塞米松、抗壞血酸預(yù)濃縮能力明顯提高，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組ALP、COL-Ⅰ、OC以及Ocn成骨標(biāo)志物也表達(dá)升高。這也提示GO通過(guò)增加蛋白吸附能力進(jìn)一步促進(jìn)了干細(xì)胞的成骨分化。

2.2 親水性的提高

材料的親水性與蛋白質(zhì)的吸附是相輔相成的[17]。GO表面富含的含氧官能團(tuán)不僅賦予材料高親水性，同時(shí)又可作為蛋白質(zhì)吸附位點(diǎn)來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞的粘附和增殖。Saravanan等[18]將不同比例的GO、CS與Gn復(fù)合構(gòu)建復(fù)合支架，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，因?yàn)镚O的存在，GO-CS-Gn支架親水性增強(qiáng)，蛋白質(zhì)吸附能力也有所提高，光鏡下細(xì)胞具有延伸的偽足且增殖良好。同時(shí)也上調(diào)了Runx2和成骨細(xì)胞分化標(biāo)記基因的表達(dá)，證明了GO通過(guò)增加材料親水性促進(jìn)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的潛能。

2.3 孔隙率增加

支架材料良好的孔隙率可以促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸和代謝廢物的清除，為細(xì)胞的附著、增殖和分化提供更有利的微環(huán)境[19]，Zhou等[20]制備了聚(3-羥基丁酸酯-co-4-羥基丁酸酯)(Poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate),P34HB)/GO納米纖維支架，與P34HB支架的孔隙率(73.83±2.17)%相比，P34HB/GO支架的孔隙率高達(dá)(88.85±2.48)%，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證明，高孔隙率組支架上附著的細(xì)胞形態(tài)更大且分布更廣，細(xì)胞活力以及增殖能力更高，并且ALP、Ocn等高表達(dá)，表現(xiàn)出良好的成骨分化能力。這可能是因?yàn)榭紫堵实奶岣咴黾恿酥Ъ艿谋砻娣e，為細(xì)胞提供更廣闊的生長(zhǎng)空間，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的增殖、粘附能力。

2.4 GO的濃度

許多研究學(xué)者提出單純GO能否對(duì)細(xì)胞的增殖、分化產(chǎn)生影響，Elkhenany 等[21]做出驗(yàn)證，他們將山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種在涂覆有GO的培養(yǎng)板上，發(fā)現(xiàn)即使培養(yǎng)基中不含糖皮質(zhì)激素和生長(zhǎng)因子，干細(xì)胞仍被誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞分化，并可觀察到茜素紅染色的骨礦化結(jié)節(jié)，表明單純GO可作為成骨誘導(dǎo)物觸發(fā)有關(guān)成骨分化的分子信號(hào),誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化。但另外其他實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GO的濃度過(guò)高時(shí)反而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不利影響，魏常博等[22]將不同濃度 GO與乳牙牙髓干細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果顯示，低濃度組細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形并顯示出良好的粘附能力，與對(duì)照組相比增殖能力明顯提高，并且早期就促進(jìn)了成骨相關(guān)蛋白R(shí)unx2高表達(dá)，而高濃度組則導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這可能是由于豐富氧化基團(tuán)賦予GO良好的親水性有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)，但過(guò)高濃度GO可能導(dǎo)致高強(qiáng)度的氧化應(yīng)激, 損傷細(xì)胞;同時(shí)GO表面存在的未氧化區(qū)域會(huì)從細(xì)胞脂膜中抽取磷脂分子, 進(jìn)而損傷細(xì)胞[23]。

2.5 機(jī)械能力提高

最近一些研究表明細(xì)胞底物的機(jī)械性能可以改變細(xì)胞反應(yīng)，從而影響細(xì)胞表面相互作用以及細(xì)胞生長(zhǎng)和活力[24-25]。Haugh等[26]發(fā)現(xiàn)當(dāng)支架機(jī)械強(qiáng)度增加后，細(xì)胞增殖和遷移能力也相應(yīng)明顯提高。Liang等[27]也證實(shí)這一結(jié)論，當(dāng)GO復(fù)合到支架材料中，機(jī)械性能最高組細(xì)胞的粘附增殖生長(zhǎng)能力也相應(yīng)的增加，這表明支架的機(jī)械性質(zhì)與細(xì)胞增殖活性密切相關(guān)。

2.6 對(duì)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的緩釋

生長(zhǎng)因子在血管的形成和干細(xì)胞成骨分化中起積極的促進(jìn)作用，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)作為應(yīng)用最廣泛的成骨因子，可誘導(dǎo)干細(xì)胞以及多非骨組織來(lái)源的細(xì)胞株，如多能纖維細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，進(jìn)而誘導(dǎo)新骨的形成[28]。除上述作用外，該生長(zhǎng)因子可能在血管生成過(guò)程中也發(fā)揮一定的作用[29]。其中研究最為廣泛的BMP-2已被納入美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)并被批準(zhǔn)應(yīng)用于骨再生的治療。但BMP-2誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化往往需要數(shù)周，所以理想的支架材料作為生長(zhǎng)因子的載體應(yīng)該在不損害其活性的情況下將其持續(xù)釋放[30]。GO因其高比表面積以及特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)可以作為負(fù)載這些蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)的載體，并且將其持續(xù)釋放[31]。因此Zhang等[32]將BMP-2負(fù)載在GO上，然后與聚乳酸-羥基乙酸共聚物-β-磷酸三鈣復(fù)合，實(shí)現(xiàn)了在不破壞BMP-2生物活性的同時(shí)對(duì)BMP-2的持續(xù)釋放，ALP、RUNX-2、Ocn和COL-Ⅰ表達(dá)水平明顯提高，促進(jìn)了干細(xì)胞的成骨分化。

3 抗菌性能

細(xì)菌感染是造成骨重建失敗的常見(jiàn)原因。因此，賦予骨支架材料一定的抗菌性能是非常有必要的。研究發(fā)現(xiàn)[33]GO不僅可以抑制多種細(xì)菌(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等)的附著，而且本身也具有一定的抗菌活性。關(guān)于GO的抗菌機(jī)制目前主要存在以下幾種學(xué)說(shuō)，①膜應(yīng)力和磷脂提取學(xué)說(shuō)：GO納米片尖銳的邊緣會(huì)使細(xì)菌胞膜的完整性受損，胞內(nèi)的RNA隨之流出，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡[34-35]。②氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)：氧化應(yīng)激會(huì)干擾細(xì)菌的新陳代謝并破壞細(xì)胞的基本功能,其主要通過(guò)依賴(lài)于活性氧(reactive oxygen species, ROS)引起細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)失活，脂質(zhì)過(guò)氧化，線粒體功能障礙和細(xì)胞膜逐漸崩解，并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，GO表面含有的含氧基團(tuán)(例如—COOH和—OH)可增加ROS的產(chǎn)生，進(jìn)而使細(xì)菌的活性受到影響[36-37]。③誘捕學(xué)說(shuō)：聚集的GO片會(huì)覆蓋細(xì)菌，將細(xì)菌與周?chē)h(huán)境相隔離，阻礙其空氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸送，但這只是抑菌而非殺菌，GO片去除后，細(xì)菌仍可以繼續(xù)增殖[38]。此外，研究發(fā)現(xiàn)利用GO特有的電子結(jié)構(gòu)以及高表面積優(yōu)點(diǎn)可將其作為抗菌藥物載體，使抗菌藥物能在病灶區(qū)進(jìn)行局部釋放，進(jìn)一步而提高抗菌性能。Li[39]利用GO表面的—OH及—COOH基團(tuán)與巴洛沙星中的甲氨基和羧基形成的強(qiáng)氫鍵作用將兩者結(jié)合，后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到了巴洛沙星的持續(xù)釋放，抗菌實(shí)驗(yàn)則表明GO可協(xié)同增強(qiáng)巴洛沙星的抗菌作用。Jiang等[40]利用聚乙烯亞胺(polyethyleneimine, PEI)修飾的GO作為鹽酸四環(huán)素(tetracycline hydrochloride, TCH)的載體及釋放平臺(tái)，與大腸桿菌和金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)材料負(fù)載的TCH可持續(xù)釋放，并展現(xiàn)了良好的抗菌效果。綜上，GO不僅本身具有一定的抗菌性能，還可以作為載體負(fù)載抗菌藥物產(chǎn)生協(xié)同抗菌作用，這為提高骨支架材料的抗菌性能提供了一個(gè)新的方向。

4 小結(jié)與展望

我們對(duì)有關(guān)GO在骨組織工程中對(duì)支架性能提高，細(xì)胞行為影響，抗菌能力加強(qiáng)做了系統(tǒng)的闡述。提示GO可用于強(qiáng)度低，親水性差材料的改進(jìn)，可以負(fù)載生物活性蛋白或藥物進(jìn)行緩釋?zhuān)瑸楣墙M織工程中成骨困難以及感染問(wèn)題的解決開(kāi)辟新的道路，為承重骨缺損開(kāi)發(fā)更有利的支架。但對(duì)于GO在骨組織工程中的應(yīng)用仍然存在一些重要挑戰(zhàn)。第一，GO的潛在長(zhǎng)期毒性應(yīng)進(jìn)一步研究。第二，我們對(duì)GO-細(xì)胞相互作用及其內(nèi)部機(jī)制的理解還不完善，許多假設(shè)仍有待檢驗(yàn)。第三，在確定GO是否為促進(jìn)植入物或支架材料表面改性的納米材料之前，應(yīng)先將GO與目前成功的植入物或支架材料的成骨作用進(jìn)行比較。最后，GO對(duì)體內(nèi)細(xì)胞、組織或器官的確切影響及其代謝途徑尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。