郭陽陽，張 博，范其茹，郝喜英，田淑媛，張曉科，楊松杰

(1.西北農林科技大學農學院，陜西楊凌 712100； 2.安康學院現(xiàn)代農業(yè)與生物科技學院，陜西安康 725000)

小麥(TriticumaestivumL.)在全球廣泛種植，是我國重要的糧食作物[1]。春化特性決定了小麥的冬春習性和抽穗期，與其適應不同氣候條件密切相關。春化基因主要與小麥抽穗和開花有關，可促進其營養(yǎng)生長向生殖生長的過渡，影響小麥的穩(wěn)產和高產[2]。因此，春化基因新等位變異的挖掘和分子標記的開發(fā)，對小麥育種具有十分重要的意義。

迄今為止，在小麥中已發(fā)現(xiàn)了4個主要的春化基因VRN1、VRN2、VRN3和VRN4，相應的分子結構特征也已明確[3-6]。VRN1基因是小麥開花發(fā)育過程中不可缺少的促花因子，與擬南芥(Arabidopsisthaliana)分生組織基因AP1(APETALA1)同源，編碼MADS-box轉錄因子[3]。VRN2基因是一種開花抑制因子，編碼一個含鋅指結構(zinc finger)和CCT結構域的轉錄因子，故又稱其為ZCCT基因[4]。在二倍體小麥(Triticummonococcum)和大麥(HordeumvulgareL.)中，CCT結構域內的突變或完整VRN2基因的缺失，都會使其消除對春化作用的需求，但這種變異在普通小麥中并不常見[7-8]。小麥VRN3基因與擬南芥中調控開花的FT基因同源，其變異主要發(fā)生在7B染色體上，可使小麥表現(xiàn)為春性，研究表明，冬性小麥和春性小麥的VRN3基因編碼區(qū)序列一致，突變主要發(fā)生啟動子區(qū)[5]。VRN1、VRN2、VRN3基因之間相互作用，形成一個調節(jié)性正反饋回路，冬小麥在未經過春化作用和短日照條件下，VRN2基因表達量上調，進而抑制VRN1和VRN3基因的表達；在春化作用下，冬小麥莖端緩慢發(fā)育并誘導VRN1基因的表達[5]，隨著VRN1基因表達量和日照長度的增加，VRN2基因的表達受到抑制，從而解除了VRN2基因對VRN3基因的抑制，VRN3編碼的蛋白與FDL2轉錄因子互作，進一步正向調控VRN1基因的表達，從而加速小麥抽穗和開花[9-10]。VRN4基因是由5A染色體上290 kb的大片段插入到5D染色體上形成的，所以又稱為VRN-D4，插入片段攜帶VRN-A1基因，在編碼區(qū)有一個獨特的SNP變異A/C，使小麥表現(xiàn)為春性[6]。VRN4基因與其他控制春化的基因 (VRN-A1、VRN-B1、VRN-D1和VRN-B3)相互作用，共同參與小麥春化的表達調控[11]。

春化基因啟動子區(qū)或第一內含子區(qū)發(fā)生的插入或缺失突變，可以使小麥具有春性生長習性。目前，在VRN1基因中已發(fā)現(xiàn)多種等位變異類型。顯性等位變異Vrn-A1a、Vrn-A1b和Vrn-D1c的突變均發(fā)生在啟動子區(qū)，能夠促進小麥提前抽穗和開花[12-13]，顯性等位變異Vrn-A1c、Vrn-B1a、Vrn-B1b、Vrn-B1c、Vrn-B1d和Vrn-D1a均是由第一內含子大片段的缺失導致小麥生長習性的改變，使小麥抽穗和開花時間提前[14-17]。目前，已在VRN-B3位點發(fā)現(xiàn)4種等位變異，包括隱性等位變異vrn-B3和顯性等位變異Vrn-B3a、Vrn-B3b、Vrn-B3c。與隱性等位變異vrn-B3相比，顯性等位變異Vrn-B3a在起始密碼子上游-591 bp處有一個5 295 bp反轉座子的插入，攜帶插入片段的轉基因小麥比攜帶隱性vrn-B3的小麥開花時間顯著提前[5]；顯性等位變異Vrn-B3b在5’UTR區(qū)有一個890 bp的插入序列，使小麥抽穗時間延遲[18]；顯性等位變異Vrn-B3c在Vrn-B3a插入片段的基礎上，有20 bp和4 bp兩個片段的缺失，但二者的轉錄水平并沒有明顯差異[18]。與VRN1基因的等位變異相比，VRN-B3位點發(fā)現(xiàn)的顯性等位變異數(shù)量相對較少，因此，需要進一步挖掘春化基因的新等位變異。這些等位變異不僅可以提高小麥的遺傳多樣性和廣泛適應性，也為下一步深入研究春化基因啟動子區(qū)域的突變在小麥花期調控中的作用提供了材料。VRN-B3位點的分子標記雖然已經被開發(fā)，但仍需多次PCR檢測才能區(qū)分出該位點不同等位變異類型，工作量大且過程繁瑣，因此，構建高效多重PCR分子標記體系就顯得尤為重要。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，普通小麥地方品種和尚頭在VRN-B3位點擴增出的條帶與目標條帶大小不一致，可能為一種新的等位變異。為了明確新等位變異的分子組成特點，本研究克隆得到該變異材料VRN-B3基因全長序列，并構建多重PCR體系；同時檢測微核心種質資源，以明確VRN-B3位點不同等位變異的地理分布規(guī)律；通過分析溫室種植的和尚頭與冬性品種京冬8號雜交后代群體的基因型和表型，揭示新等位變異對小麥抽穗期的影響，以期豐富我國小麥春化基因的遺傳多樣性，加快廣適小麥的育種步伐。

1 材料與方法

1.1 材 料

普通小麥品種和尚頭(含Vrn-A1a、Vrn-B1a、vrn-D1、Vrn-B3d)由寧夏農林科學院農作物研究所陳東升研究員提供，262份中國微核心種質資源和對照品種遼春10號(含Vrn-B3a)、短紅芒麥(含Vrn-B3b)由甘肅農業(yè)科學院楊芳萍研究員提供，京411(含vrn-B3)由本實驗室保存。中國春及其第7同源群缺體-四體系由中國農業(yè)科學院作物科學研究所夏先春研究員贈予，用于引物染色體定位。和尚頭、京冬8號(含vrn-A1、vrn-B1、vrn-D1、vrn-B3)及其組合F2代收獲于西北農林科技大學試驗田，F(xiàn)3代用于新等位變異效應分析。

1.2 方 法

1.2.1Vrn-B3d等位變異的克隆

采用CTAB法[19]提取小麥幼嫩葉片基因組DNA。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查找中國春VRN-B3序列(GenBank No. DQ890162)，并設計擴增該基因全長的特異性引物(表1)。利用引物Vrn-B3d-2F/R、VRN4-B-NOINS-F/R和Vrn-B3d-1 600 bp-F/R，以和尚頭和京冬8號的基因組DNA為模板進行PCR擴增，PCR反應體系為50 μL，其中ddH2O 18 μL，2×Phanta Max Buffer 25 μL，10 mmol·L-1dNTP Mix 1 μL，上、下游引物各 2 μL，P505高保真酶(Vazyme，南京) 1 μL，模板DNA 1 μL。PCR反應程序為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，退火15 s(具體退火溫度見表1)，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分辨擴增產物。將PCR產物純化回收，連接至載體pEASY-Blunt Zero Cloning Vector(全式金，北京)，轉化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆送奧科鼎盛生物科技有限公司(楊凌)進行測序。

1.2.2 基因結構分析、分子標記開發(fā)、多重PCR體系的構建及其利用

通過DNAMAN 8進行序列比對，找出新變異Vrn-B3d與VRN-B3位點已知等位變異vrn-B3(GenBank No. DQ890162)、Vrn-B3a(GenBank No. DQ890165)、Vrn-B3b(GenBank No. JN627519)和Vrn-B3c(GenBank No. JQ082311)的序列差異部分。通過PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預測插入片段的順式作用元件。利用Oligo 7設計特異性引物VRN-B3d-F和 VRN-B3d-R(表1)，用于區(qū)分vrn-B3和Vrn-B3d序列。PCR反應體系為20 μL，其中ddH2O 8 μL，2 × ES Taq Master Mix 10 μL(康為世紀，北京)，上游引物和下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分辨擴增產物。

利用文獻[5]和本研究開發(fā)的分子標記構建多重PCR體系，即用兩條上游引物VRN4-B-INS-F、VRN-B3d-F和一條共用下游引物 VRN-B3d-R(表1)，構建可同時檢測出VRN-B3位點五種等位變異類型的多重PCR體系。使用此多重PCR檢測262份中國微核心種質資源，可獲得VRN-B3位點的基因組成類型。多重PCR的體系、程序和電泳條件與引物對VRN-B3d-F和 VRN-B3d-R相同。

表1 VRN-B3位點的克隆和多重PCR分子標記體系的引物信息

1.3 溫室種植、基因型和抽穗期鑒定

2017年11月將小麥品種和尚頭和京冬8號及其F2群體(組合)種植在高溫長日照溫室(溫度為20～24 ℃，日照時長為16 h)，種植材料均未經過春化處理。F2群體春化基因VRN-A1、VRN-B1和VRN-B3位點的檢測參考Yan等[5,12]和Fu等[14]的引物。通過PCR檢測，從F2群體中篩選出基因型組成為vrn-A1+vrn-A1+vrn-B1+vrn-B1+Vrn-B3d+vrn-B3的單株(即僅VRN-B3位點為雜合基因型而其他位點為隱性基因型)。收獲其種子后，于2018年11月繼續(xù)種植在溫室，獲得F3代單株，共計97份。小麥生長開始抽穗時，記載各個單株的抽穗期。單株主莖穗抽出葉鞘1/2時記為抽穗日期，從播種到抽穗的天數(shù)作為單株的抽穗期。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 19.0對抽穗期進行顯著性分析，用Excel處理和分析數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 Vrn-B3d等位變異的序列組成

利用引物對Vrn-B3d-2F和 Vrn-B3d-2R擴增不同品種中VRN-B3基因的編碼區(qū)基因組序列，在京冬8號、和尚頭、中國春以及缺四體N7AT7D和N7DT7B均擴增出預測的1 397 bp條帶，而N7BT7D無擴增條帶，說明設計的引物位于7B染色體上(圖1A)。Yan等[5]報道，VRN-B3基因也被定位在7B染色體上[5]，且本研究擴增片段大小也與預期結果一致，驗證了新設計引物的有效性和特異性。將獲得的PCR產物進行測序，獲得的序列與已知等位變異vrn-B3、Vrn-B3a、Vrn-B3b和Vrn-B3c進行序列比對，發(fā)現(xiàn)和尚頭和京冬8號與4種已知等位變異的編碼區(qū)基因組序列完全相同。

利用引物對VRN4-B-NOINS-F和VRN4-B-NOINS-R克隆不同品種中VRN-B3基因啟動子區(qū)序列，該引物對位于隱性等位變異vrn-B3基因起始密碼子下游17 bp至起始密碼子上游 -1 125 bp序列位置。在和尚頭中該引物對擴增出 1 302 bp的條帶，明顯比對照京冬8號和中國春擴增的條帶大(圖1B)。為了進一步分析啟動子遠上游序列，設計引物對Vrn-B3d-1 600 bp-F和 Vrn-B3d-1 600 bp-R，該對引物位于隱性等位變異vrn-B3基因起始密碼子上游-941 bp至 -2 280 bp序列位置。在京冬8號、和尚頭、中國春以及缺四體N7AT7D和N7DT7B均擴增出預測的 1 339 bp條帶，而N7BT7D無擴增條帶，表明新設計的引物定位在7B染色體上，條帶大小也與預期結果一致，驗證了新設計引物的有效性和特異性(圖1C)。測序結果表明，使用引物對Vrn-B3d-1 600 bp-F和Vrn-B3d-1 600 bp-R在和尚頭和京冬8號中擴增出的序列組成完全相同。

A：引物Vrn-B3d-2F和 Vrn-B3d-2R擴增 VRN-B3基因編碼區(qū)；B：引物VRN4-B-NOINS-F和VRN4-B-NOINS-R擴增 VRN-B3基因啟動子區(qū)；C：引物Vrn-B3d-1 600 bp-F和 Vrn-B3d-1 600 bp-R擴增 VRN-B3基因啟動子區(qū)；M：DL2000；1：京冬8號；2：和尚頭；3：中國春；4：N7AT7D；5：N7BT7D；6：N7DT7B。

從圖2可以看出，在普通小麥品種和尚頭VRN-B3位點發(fā)現(xiàn)一個新的等位變異，與隱性等位變異vrn-B3相比，新等位變異在起始密碼子上游-875 bp處有一個160 bp的插入，且與已知等位變異Vrn-B3a、Vrn-B3b和Vrn-B3c都不同，將新等位變異命名為Vrn-B3d(圖2)。

灰色圖形代表插入序列，黑色線條代表啟動子區(qū)序列。

為了明確Vrn-B3d啟動子區(qū)160 bp插入片段中所含有的順式作用元件，使用PlantCare在線網(wǎng)站進行預測，結果表明，160 bp插入片段包括3種順式作用元件，分別為CAAT-box(提高啟動子啟動效率)、G-box(光響應元件)和TATA-box(基因轉錄的核心啟動子元件)。

2.2 分子標記的開發(fā)、多重PCR的構建和應用

基于Vrn-B3d變異序列，開發(fā)設計一對引物Vrn-B3d-F和Vrn-B3d-R，用于區(qū)分vrn-B3和Vrn-B3d(表1)。利用中國春第7同源群缺體-四體系對引物特異性進行驗證，發(fā)現(xiàn)在京冬8號(vrn-B3)以及缺四體N7AT7D和N7DT7B中均擴增出1168 bp的條帶，在和尚頭中擴增出 1 328 bp的條帶，而N7BT7D無擴增條帶，這與預期結果相同，表明設計的引物有效可行(圖3)。

M：DL2000；1：京冬8號；2：和尚頭；3：N7AT7D； 4：N7BT7D；5：N7DT7B。

為了提高檢測效率，利用兩條上游引物VRN4-B-INS-F、VRN-B3d-F和一條共用下游引物 VRN-B3d-R，構建多重PCR分子標記檢測體系，即通過一次PCR可同時檢測出VRN-B3位點的五種等位變異Vrn-B3a、Vrn-B3c、Vrn-B3b、Vrn-B3d和vrn-B3。從圖4可以看出，4份對照品種遼春10號(Vrn-B3a)、短紅芒麥(Vrn-B3b)、和尚頭(Vrn-B3d)和京411(vrn-B3)擴增的條帶分別為1 695、2 058、1 328和1 168 bp，條帶大小與單一PCR擴增結果完全一致，說明構建的多重 PCR體系穩(wěn)定可靠。

M：DL2000；1：遼春10號；2：短紅芒麥；3：和尚頭；4：京411。

利用此多重PCR分子標記體系，檢測262份中國微核心種質資源春化基因VRN-B3位點，發(fā)現(xiàn)甘麥8號等245份材料擴增出1 168 bp的特異性條帶，說明這些材料攜帶隱性等位變異vrn-B3，占93.5%；葛爾紅麥等15份材料擴增出2 058 bp的特異性條帶，說明這些材料攜帶顯性等位變異Vrn-B3b，占5.7%；春麥和紅冬麥2份材料擴增出1 328 bp的特異性條帶，說明這2份材料攜帶新等位變異Vrn-B3d，占0.8%；微核心種質中未檢測到攜帶Vrn-B3a和Vrn-B3c兩種顯性等位變異的材料。

2.3 新等位變異 Vrn-B3d對小麥抽穗期的影響

3 討 論

VRN3基因在小麥開花過程中起重要作用，VRN3蛋白可以從葉片轉移到莖尖分生組織，使莖尖處的VRN1基因表達量上調，促進小麥由營養(yǎng)生長向生殖生長的轉變[5]。本研究在和尚頭VRN-B3位點發(fā)現(xiàn)一個新的等位變異Vrn-B3d，測序結果表明，新變異在啟動子區(qū)有160 bp的插入片段。前人研究表明，VRN-B3位點的結構變異主要發(fā)生在啟動子區(qū)，影響小麥抽穗和開花的時間[5，18]。Zhang等[13]認為啟動子區(qū)順式作用元件種類和數(shù)量的增加是基因表達量上調的主要原因，從而促進小麥提前開花。Yan等[5]研究表明，Vrn-B3a在啟動子區(qū)插入一個大片段的反轉座子后，能使小麥抽穗和開花時間顯著提前。Chen等[18]研究表明，顯性等位變異Vrn-B3b在啟動子區(qū)插入890 bp的片段后，小麥抽穗和開花時間顯著延遲。本研究中新等位變異Vrn-B3d在啟動子區(qū)有160 bp的插入片段，可以使小麥延遲2 d抽穗，與Vrn-B3b延遲效應的趨勢一致，但可能因為Vrn-B3d中插入的160 bp片段較短，僅增加了三種普通的順式作用元件CAAT-box、G-box和TATA-box，對基因的調控作用沒有達到閾值[20]，因此對小麥抽穗期延遲作用不顯著。另外，擬南芥中調控開花的FT基因在其他發(fā)育過程如植株坐果、營養(yǎng)生長、氣孔開放都有一定的作用[21]，而VRN-B3作為FT的同源基因，相應方面的功能有待進一步研究。

分子標記具有穩(wěn)定、效率高及成本低等優(yōu)點，現(xiàn)已成為育種工作者優(yōu)先選擇的遺傳標記。近些年來，分子標記發(fā)展迅速，為發(fā)掘小麥材料中春化基因的變異位點提供了可能性。本試驗根據(jù)Vrn-B3d基因的序列特點，開發(fā)了檢測新等位變異Vrn-B3d的分子標記。同時，根據(jù)VRN-B3位點目前已知的等位變異序列組成，構建多重PCR分子標記檢測體系，共用下游引物 VRN-B3d-R位于起始密碼子上游53 bp處，上游引物VRN4-B-INS-F位于Vrn-B3a和Vrn-B3c插入片段中，另一條上游引物 Vrn-B3d-F位于vrn-B3、Vrn-B3b和Vrn-B3d共有序列區(qū)域內，此多重體系可同時檢測出VRN-B3位點的五種等位變異，能夠進一步提高檢測效率及發(fā)現(xiàn)新等位變異的幾率。分子標記輔助育種技術現(xiàn)已被廣泛應用，多重PCR體系能夠快速、高效地篩選出目的基因，加快小麥選育進程。

環(huán)境差異地區(qū)的小麥品種具有不同的春化基因組成類型，以適應當?shù)氐臍夂颦h(huán)境和耕作條件[22-23]。利用本研究開發(fā)的多重PCR體系檢測262份核心種質資源，初步明確了VRN-B3基因在全國小麥資源的分布規(guī)律。檢測結果表明，在全國范圍內VRN-B3基因主要以隱性等位變異vrn-B3(93.5%)為主，與Zhang等[24]的研究結果一致；未在核心種質材料中發(fā)現(xiàn)攜帶Vrn-B3a和Vrn-B3c的品種，說明含這兩種基因型的品種在我國小麥種質資源中占比極少。攜帶Vrn-B3b的15份核心種質分布在河北、河南和陜西等地，這與Chen等[18]的研究結果相同，同時本研究在寧夏和西藏的品種中也發(fā)現(xiàn)Vrn-B3b的存在，可為這些地區(qū)的引種和育種提供理論依據(jù)。在兩個新疆品種中發(fā)現(xiàn)了新等位變異Vrn-B3d。新疆地區(qū)春季氣溫偏低，且溫度波動幅度較大，小麥容易因凍害而減產。本研究發(fā)現(xiàn)的新變異能在一定程度上延遲小麥抽穗，說明Vrn-B3d對低溫環(huán)境不敏感，攜帶新變異Vrn-B3d的品種需要較長時間的低溫處理才能抽穗，能夠避免凍害，從而更好適應新疆地區(qū)的氣候，對提高小麥產量有積極作用。