車海彥　曹學(xué)仁　賀延恒　羅大全

摘 ?要：2018年11月—2019年3月，在海南省三亞、樂東、東方、儋州、澄邁、?？?、萬寧和五指山共8個市縣，采集疑似病毒病的葉片樣本302份，采用小RNA深度測序和RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，黃瓜樣品中存在黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）、甜瓜黃斑病毒（Melon yellow spot virus， MYSV）、黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber green mottle mosaic virus， CGMMV）、煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus， TMV）和瓜類褪綠黃化病毒（Cucurbit chlorotic yellows virus， CCYV）共5種病毒，檢出率分別為32.79%、31.46%、23.18%、9.61%和2.65%。病毒的復(fù)合侵染率為11.28%，有8種復(fù)合侵染類型，以其中2種病毒復(fù)合侵染為主。明確了海南島黃瓜病毒病主要種類及發(fā)生分布情況。

關(guān)鍵詞：海南島;黃瓜病毒病;小RNA深度測序;病原鑒定;分布

中圖分類號：S436.421.1 ? ? ?文獻標識碼：A

Distribution and Identification of Viruses from Cucumber in Hainan Island

CHE Haiyan， CAO Xueren， HE Yanheng， LUO Daquan*

Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Pests Comprehensive Governance for Tropical Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract： From November 2018 to March 2019， a total of 302 suspected virus-infected cucumber leaf samples were collected from 8 regions （Sanya， Ledong， Dongfang， Danzhou， Chengmai， Haikou， Wanning and Wuzhishan） in Hainan Island. Five viruses were detected including Cucumber mosaic virus （CMV）， Melon yellow spot virus （MYSV）， Cucumber green mottle mosaic virus （CGMMV）， Tobacco mosaic virus （TMV） ， and Cucurbit chlorotic yellows virus （CCYV） by small RNA deep sequencing and RT-PCR. The detection rate was 32.79%， 31.46%， 23.18%， 9.61% and 2.65%， respectively. Detection rate of co-infection was 11.28%. There were 8 kinds of co-infection types， and the co-infection of two viruses occurred most often. The distribution and species of viruses from cucumber in Hainan were clarified.

Keywords： Hainan Island; cucumber virus disease; small RNA deep sequencing; pathogen identification; distribution

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.11.019

黃瓜（Cucumis sativus L.）是我國各地普遍種植的重要蔬菜。病毒病是黃瓜生產(chǎn)的重要病害之一，嚴重影響黃瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)。據(jù)報道，侵染葫蘆科作物的病毒種類有86種，其中暫定種有17種，類病毒有1種，共涉及到15個科、24個屬[1]。侵染我國黃瓜的病毒主要有黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）、煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus， TMV）、黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber green mottle mosaic virus， CGMMV）、甜瓜黃斑病毒（Melon yellow spot virus， MYSV）、西瓜花葉病毒（Watermelon mosaic virus， WMV）、瓜類褪綠黃化病毒（Cucurbit chlorotic yellows virus， CCYV）、小西葫蘆黃花葉病毒（Zucchini yellow mosaic virus， ZYMV）、番木瓜環(huán)斑病毒（Papaya ring spot virus， PRSV）等，而且隨著氣候變化和種植模式的改變，各地病毒病的毒源種類也不斷發(fā)生變化[2-9]。

黃瓜是海南冬季重要的北運蔬菜之一，2017年海南島黃瓜種植面積8144 hm2，年產(chǎn)20.46萬t（海南統(tǒng)計年鑒2018），主要種植在三亞、萬寧和澄邁等市縣。2018—2019年對海南島黃瓜病毒病的發(fā)生情況進行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大約90%黃瓜種植地在生長期間都受病毒不同程度的侵染，有的田塊病毒病發(fā)生率高達100%。本文通過小RNA深度測序和RT-PCR技術(shù)對侵染海南黃瓜的病毒種類、復(fù)合侵染及發(fā)生分布情況進行研究，以期為海南黃瓜病毒病的綜合防控提供理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?樣品采集

2018年11月—2019年3月，在海南省三亞、樂東、東方、儋州、澄邁、?？?、萬寧和五指山共8個市縣，采集疑似病毒病的葉片樣本302份，置于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 ?感病黃瓜葉片樣品sRNAs高通量測序及分析

將4個不同癥狀的病樣混合，在液氮中研磨，采用TRIzol? Reagent （Invitrogen）提取樣品總RNA，采用TruseqTM Small RNA sample prep Kit （Illumina）構(gòu)建文庫，采用6% Novex TBE PAGE gel， 1.0 mm （Invitrogen）回收文庫，用TBS380 （Picogreen）微型熒光劑進行定量，在cBot上進行橋式PCR擴增，生成clusters，然后在Hiseq2000測序平臺進行SE50測序。測序獲得的原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)控分析后，獲得clean small RNA序列，將質(zhì)控獲得的RNA-seq高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)進行拼接，將拼接結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLASTn和BLASTx比對，鑒定病毒的種類。sRNAs高通量測序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.3 ?RT-PCR驗證與田間采集樣品的檢測

1.3.1 ?RNA提取及cDNA合成 ?黃瓜葉片樣品的總RNA提取采用天根生化科技（北京）有限公司的植物總RNA提取試劑盒。使用北京全式金生物技術(shù)有限公司的TransGen TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix將提取的葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.3.2 ?RT-PCR驗證與檢測 ?MYSV、CCYV、CMV、TMV和CGMMV的檢測引物序列見表1，引物合成委托北京六合華大基因科技有限公司完成。PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL，其中含有2×Taq PCR Mastermix 12.5 μL、10 μmol/L的上游引物和下游引物各1 μL，cDNA 1 μL和滅菌ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性45 s，X ℃退火45 s（退火溫度見表1），72 ℃延伸45 s，循環(huán)35次;72 ℃延伸10 min。

1.3.3 ?PCR產(chǎn)物克隆和測序 ?PCR擴增的特異性片段產(chǎn)物經(jīng)純化回收后與pMD18-T Simple載體連接，轉(zhuǎn)化到Escherichia coli Competent Cell DH5α中，利用PCR反應(yīng)篩選陽性克隆。委托北京六合華大基因科技有限公司測序。

1.3.4 ?序列分析 ?測序結(jié)果采用NCBI中BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行比對分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?黃瓜病毒病田間癥狀表現(xiàn)

在海南，感染黃瓜病毒病的植株在田間常表現(xiàn)為中上部葉片皺縮、花葉、黃斑、葉脈扭曲、

葉肉褪綠、黃脈、葉邊緣向上卷曲、黃化、葉脈褪綠、葉片變小和植株矮化等癥狀，同一感病植株上往往同時表現(xiàn)多種癥狀。用于小RNA深度測序的4個樣品田間癥狀見圖1。

2.2 ?感病黃瓜葉片sRNAs高通量測序和分析

黃瓜樣品經(jīng)sRNAs高通量測序后獲得27 887 686條raw reads，質(zhì)控后得到17 449 815條clean reads，將質(zhì)控后獲得的序列進行拼接組裝，得到12 356個contigs，將拼接結(jié)果與NCBI病毒庫進行比對，獲得5種病毒的825個contigs，MYSV、CCYV、CMV、TMV和CGMMV分別為477、331、10、5和2個contigs，與NCBI中相應(yīng)病毒的核苷酸序列相似性分別為89.04%～100%、93.88%～ 100%、95.51%～97.01%、99.60%～100%和100%。

2.3 ?sRNAs高通量測序結(jié)果的RT-PCR驗證

為了驗證sRNAs高通量測序鑒定病毒結(jié)果的可靠性，利用MYSV、CCYV、CMV、TMV和CGMMV特異性引物對樣品進行了RT-PCR檢測，擴增到了預(yù)期大小的片段，PCR產(chǎn)物測序后經(jīng)Blast比對分析，與NCBI中發(fā)布的相應(yīng)病毒的核苷酸序列相似性在98.83%～100%之間，說明所測樣品中確實存在上述5種病毒，驗證了sRNAs高通量測序結(jié)果的可靠性。將MYSV、CCYV、CMV、TMV和CGMMV共5種病毒的測序結(jié)果提交到GenBank，登錄號依次為MN615290、MN615291、MN615292、MN615293和MN615294。

2.4 ?黃瓜葉片樣本的病毒檢測結(jié)果

采用RT-PCR對采集的302份疑似病毒感染的葉片樣品分別進行MYSV、CCYV、CMV、TMV和CGMMV檢測，結(jié)果表明（表2，圖2），266?份樣品中檢測到病毒。5種病毒檢出率從高到低依次為CMV 32.79%、MYSV 31.46%、CGMMV 23.18%、TMV 9.61%和CCYV 2.65%。CMV和CGMMV在采樣的8個市縣均有分布，TMV分布在三亞、樂東、東方、澄邁、?？诤腿f寧共6個市縣，MYSV分布在三亞、樂東、東方、澄邁和萬寧共5個市縣，CCYV在三亞、澄邁、?？?、萬寧和五指山共5個市縣零星分布。三亞、澄邁和萬寧樣本中檢測出的病毒種類最多，為5種;樂東、東方和?？跇悠分芯鶛z測到4種病毒;五指山樣品中檢測到3種病毒;儋州樣品中檢測到2種病毒。

在檢測到病毒的266份樣品中，236份樣品為單一病毒侵染，30份樣品為2～3種病毒復(fù)合侵染，復(fù)合侵染率為11.28%。有8種復(fù)合侵染類型，以2種病毒復(fù)合侵染為主。2種病毒的復(fù)合侵染類型為MYSV+CGMMV/CCYV/CMV，TMV+CMV/CG-M?MV和CCYV+CMV，3種病毒的復(fù)合侵染類型為CMV+TMV+CGMMV和MYSV+CMV+TMV（圖3）。

3 ?討論

本研究在采集的302份海南黃瓜葉片樣品中共發(fā)現(xiàn)MYSV、CMV、CGMMV、TMV和CCYV 5種病毒，分屬4個科，即番茄斑萎病毒科（Tospoviridae）、雀麥花葉病毒科（Bromoviridae）、植物桿狀病毒科（Virgaviridae）和長線形病毒科（Closteroviridae）。在田間，不同病毒的傳播方式不同，MYSV主要通過棕櫚薊馬（Thrips palmi）傳播[12]，CMV主要通過蚜蟲以非持久性方式傳播[13]，CGMMV主要通過種子和機械操作傳播[14]，TMV主要靠帶有病毒的汁液傳播[15]，CCYV主要通過煙粉虱[Bemisia tabaci （Gennadius）]傳播[16]。研究發(fā)現(xiàn)不僅同一田塊不同植株上的病毒種類可能存在差異，同一植株上也可能存在2～3種病毒的復(fù)合侵染，病毒種類和傳播途徑的多樣化增加了海南黃瓜病毒病的防控難度，應(yīng)加強種子種苗的病毒檢測、病毒病害的田間監(jiān)測以及蚜蟲、棕櫚薊馬、煙粉虱等傳毒昆蟲的防控。

2004年在日本甜瓜上首次發(fā)現(xiàn)CCYV[17]，目前中國臺灣、湖南、海南、河南、新疆、山東等地均有發(fā)生[16，18-22]。本研究首次在海南黃瓜上發(fā)現(xiàn)CCYV的侵染，檢出率為2.65%，僅在海南部分地區(qū)發(fā)生，但由于煙粉虱在海南周年發(fā)生，繁殖力強，極易導(dǎo)致CCYV在海南的快速蔓延，所以田間要加強CCYV的監(jiān)測和煙粉虱的防控，掌握CCYV的田間發(fā)生規(guī)律，以減緩CCYV在海南的擴展蔓延速度。

海南黃瓜病毒種類為MYSV、CMV、CGMMV、TMV和CCYV，而北京順義和昌平黃瓜病毒種類為CMV、WMV和ZYMV，山東黃瓜病毒種類為CMV、WMV、ZYMV和PRSV，深圳黃瓜病毒種類為CMV、WMV和PRSV，重慶黃瓜病毒種類為CMV、南瓜花葉病毒（Squash mosaic virus， SqMV）、蕪菁花葉病毒（Turnip mosaic virus， TuMV）、WMV和ZYMV，上述地區(qū)黃瓜樣品中均存在2種或2種以上病毒的復(fù)合侵染現(xiàn)象[2-6]。不同省份黃瓜病毒種類不完全相同，這可能與當(dāng)?shù)氐臍夂驐l件、種植模式和栽培品種等有關(guān)。CMV、TMV在本研究和2013—2014年[23]樣品中檢出率分別為32.79%、9.61%和63.30%、21.33%;CGMMV在本研究樣品中的總檢出率為23.18%，在儋州、澄邁、萬寧、五指山的檢出率為36.36%～45.45%，三亞、樂東和東方零星發(fā)生，而2013—2014年樣品中，CGMMV總檢出率為22.67%，主要發(fā)生在三亞和樂東;MYSV在本研究和2017年[12]樣品中，三亞、樂東、東方、萬寧的檢出率分別為67.39%、50.00%、15.38%、37.14%和50.00%、6.67%、3.33%、0.00%。與2013—2014年和2017年樣品的檢測結(jié)果相比，2018—2019年樣品中CMV和TMV的檢出率降低。CGMMV總檢出率雖然變化不大，但分布范圍發(fā)生了變化。MYSV的檢出率明顯升高，萬寧樣品首次檢測到MYSV，MYSV的發(fā)生范圍擴大，危害日益嚴重。同一地區(qū)，黃瓜病毒病的毒源種類和分布不斷發(fā)生變化，因此，加強田間黃瓜病毒病的監(jiān)測，對于黃瓜病毒病的綜合防控具有重要意義。

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收稿日期 ?2019-11-08;修回日期 ?2019-12-30

基金項目 ?海南省重大科技計劃項目（No. zdkj201813）;中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費專項（No. 19CXTD-33）。

作者簡介 ?車海彥（1976—），女，博士，副研究員，研究方向：植物病毒與植原體病害;*通信作者（Corresponding author）：羅大全（LUO Daquan），E-mail：luodaquan@163.com。