蔡欣，馬曉偉，黎攀，楊運云，杜冰，*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州510642；2.廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司，廣東廣州510663；3.廣東省測試分析研究所，廣東廣州510070）

高血壓是一種在我國患病率較高、致殘率較高的慢性疾病[1]，長期發(fā)展可造成腦、心臟、腎臟等靶器官的嚴重損害[2]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）是一種哺乳動物組織中普遍存在的、含Zn2+的二肽羧肽酶[3]。一方面ACE 可作用于腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)中的血管緊張素I，使之轉(zhuǎn)化為有效的血管收縮劑——血管緊張素II[4]。另一方面ACE 也可使激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（kallikrein-kinin system，KKS）中具有舒張血管緊張作用的激肽失活，KKS 系統(tǒng)處于抑制狀態(tài)，間接導(dǎo)致壓力升高[5]。

研究表明，抑制ACE 的活性，可以有效防止血壓升高[6-7]。合成的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（angiotensinconverting enzyme inhibitor，ACEI）（卡托普利、賴諾普利等）已廣泛用作抗高血壓藥物，但由于這類合成藥物在長期使用過程中常伴有一系列不良反應(yīng)，如咳嗽、水腫、皮疹和腎功能損傷等[8-9]。從天然動植物中提取的ACE 抑制劑，由于其副作用低、安全性高等優(yōu)點，而更受關(guān)注。

體外檢測ACE 抑制率作為評價ACE 活性的一類方法[10]，可方便有效地篩選具有ACE 抑制的組分。三肽Hip-His-Leu（HHL）在ACE 的催化下快速地分解產(chǎn)生馬尿酸和二肽His-Leu（HL），馬尿酸在228 nm 處有特征紫外吸收峰[11]。本研究通過高效液相色譜（high efficiency liquid chromatography，HPLC）測定反應(yīng)體系中馬尿酸的含量，確定ACE 的抑制率[12-13]，進而篩選具有ACE 抑制活性的組分。

美藤果（Plukenetia volubilis L.）又名印加果、南美油藤、星油藤，為大戟科多年生木質(zhì)藤本植物植物[14]，原產(chǎn)于南美亞馬遜地區(qū)的熱帶雨林，后經(jīng)引進在我國云南省成功種植[15]。目前，對其研究主要集中在美藤果油和美藤果蛋白[16-18]，而有關(guān)美藤果果殼的研究一直處于空白狀態(tài)。本文以云南普洱地區(qū)種植的美藤果的果殼為原料，通過HPLC 測定反應(yīng)體系中馬尿酸含量的方法測定ACE 的抑制率，結(jié)合自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rat，SHR）模型，側(cè)重評價美藤果殼提取物的降血壓功效，并對其安全性及有效降壓部位進行初步評價。

1 材料

1.1 原料

美藤果殼：普洱市聯(lián)眾生物資源開發(fā)有限公司。

1.2 試驗試劑

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶、馬尿酸、HHL、卡托普利：美國Sigma 公司；銀杏提取物（含22%銀杏黃酮）、菊花提取物（含3%菊花黃酮）：齊云生物技術(shù)有限公司；硅膠（200 目～300 目）：上海阿拉丁生化科技有限公司；乙腈、三氟乙酸（色譜純）：Hollywell 公司；硼酸、氯化鈉、氫氧化鈉等分析純：廣州化學(xué)試劑廠；鹽酸、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等分析純：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.3 試驗儀器

UltiMateTM3000 高效液相色譜：賽默飛公司；DFT-200C 萬能粉碎機：上海機械有限公司；Centrifuge 5804/5804 R 臺式多功能離心機：德國Eppendorf；ModulyoD真空冷凍干燥機：美國Thermo 公司；BP-2010A 無創(chuàng)血壓儀：北京軟隆生物技術(shù)有限公司；FA2004 電子分析天平：上?？茖W(xué)儀器廠；RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮儀器有限公司；DLSB-低溫冷卻液循環(huán)泵、R210D恒溫水浴鍋：上海豫康有限公司。

1.4 實驗動物

SPF 級昆明小鼠 60 只，SHR 大鼠（雌雄各 3 只），WKY 大鼠（高血壓大鼠對照模型，雌雄各15 只）。

2 方法

2.1 ACE-HHL-ACEI反應(yīng)體系

配制 0.10 mol/L 的硼酸緩沖液（pH 值=8.3）、1.00 mmol/L 馬尿酸溶液、5.00 mmol/L 的 HHL 溶液和1.00 mol/L 的鹽酸溶液待用。0.25 U 的ACE 溶解在2.5 mL 的硼酸緩沖液中。

按表1 進行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后以10 000 g 離心10 min，取 400 μL 上清液，用 0.45 μm 的微孔濾膜過濾，采用高效液相色譜測定生成馬尿酸（Hip）的含量，計算ACE 的抑制率。

表1 ACE 抑制劑活性檢驗的加樣步驟Table 1 Steps to add samples in ACE inhibitory activity assay

高效液相色譜條件[19]：安捷倫SB-C18 色譜柱（5μm×4.6 mm×250 mm），柱溫 25 ℃，流速 1 mL/min，流動相為乙腈-超純水（體積比25 ∶75，各含0.1%的三氟乙酸），檢測波長 228 nm，進樣量 10 μL。

式中：S 為空白對照組中馬尿酸的峰面積；S1 為樣品組中馬尿酸的峰面積。

2.2 美藤果殼降壓提取物（sacha inchi shell water extract，SISE）制備

2.2.1 原料預(yù)處理

取美藤果殼投入汽爆罐，加水浸泡使其含水量約為 50%，在170 ℃、1.0 MPa 下保壓30 s，汽爆處理結(jié)束后收集物料。此工藝條件下物料粉碎度適宜，遇水不易結(jié)塊，符合下一步提取要求。

2.2.2 提取溶劑篩選

精確稱取美藤果殼粉末（過40 目篩）1.0 g 置于碘量瓶中，分別選用水、乙醚、石油醚、氯仿、甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、乙酸乙酯作為提取溶劑。置于60 ℃水浴中振蕩提取2 h，超聲處理30 min 后靜置、離心，取2 mL上清液，揮干后用1 mL 含2%吐溫80 的溶液中，制成濃度為0.1 g/mL 的樣品液。測定各樣品組的ACE 抑制率，測定方法參照2.1。

2.2.3 降壓有效殼層篩選

制備美藤果殼、美藤果外殼、美藤果殼內(nèi)殼和美藤果內(nèi)皮的提取物凍干粉，提取物統(tǒng)一配制成40 mg/mL的樣品液，測定各樣品組的ACE 抑制率，測定方法參照2.1。

2.2.4 美藤果殼提取物制備方法

確定有效殼層和提取溶劑后，采用熱浸提法，將原料汽爆處理后，按照料液比1 ∶40（g/mL）加入提取溶劑，提取溫度105 ℃，提取時間3 h。提取結(jié)束后，將提取液低溫濃縮至1/4 體積后，冷凍干燥制得凍干粉，即為美藤果殼提取物，簡稱為SISE，用于研究。

2.3 美藤果殼提取物毒理學(xué)評價

采用國家標準GB 15193.3-2014《食品安全國家標準急性經(jīng)口毒性試驗》中的限量法。選取SPF 級昆明小鼠60 只，隨機分為實驗組和空白對照組。實驗組灌胃提取物，劑量為12.0 g/Kg·BW，空白組以生理鹽水作對照。灌胃結(jié)束后，觀察期限為7 d，觀察并記錄小鼠狀態(tài)（外觀、行為活動、排泄和死亡情況），測量記錄小鼠體重變化。觀察期結(jié)束后，小鼠稱重、處死、解剖，病理檢查主要臟器（心、肝、脾、腎）并計算臟器指數(shù)[20]。

2.4 美藤果殼降壓提取物與其他ACEI效果對比

制備美藤果殼提取物，另取銀杏提取物、菊花提取物和藥品卡托普利作為陽性對照組，提取物統(tǒng)一配制成40 mg/mL 的樣品液，卡托普利配制成0.5 μg/mL的樣品液，測定各樣品組的ACE 抑制率，測定方法參照2.1。

2.5 美藤果殼提取物體內(nèi)短期降血壓效果評價

將SHR 大鼠分為5 組：陽性對照組、陰性對照組、低、中、高劑量組，每組雌雄大鼠各 3 只；WKY 大鼠，雌雄各3 只作為正常對照組。陽性對照組：卡托普利5 mg/kg·BW；陰性對照組：灌胃蒸餾水；低劑量組：美藤果殼提取物50 mg/kg·BW；中劑量組：美藤果殼提取物100 mg/kg·BW；高劑量組：美藤果殼提取物400 mg/kg·BW；正常對照組：灌胃蒸餾水。

按受試劑量對各組大鼠給藥，以灌胃后0、0.25、0.5、1、2、4、6 h 為測定時間點，分別測定各組在各血壓監(jiān)測時間點對應(yīng)的血壓值，測定時每只大鼠測定3 次并取平均值[21]。

2.6 美藤果殼降血壓有效成分篩選

采用2.2.4 方法制備美藤果殼提取物濃縮液。依次采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別收集各有機相萃取層，保留最終剩余的水層。各萃取層揮干后分別制成濃度為0.10 g/mL 的樣品液。測定各樣品組的ACE 抑制率，測定方法參照2.1。

取上述方法中活性最高的萃取物0.5 g，以90%甲醇溶解后經(jīng)硅膠柱，氯仿/甲醇梯度洗脫，設(shè)置100 ∶0、9 ∶1、7 ∶3、5 ∶5、3 ∶7、1 ∶9、0 ∶100 7 個梯度，每個梯度3 個柱體積，柱體積為100 mL。參照2.1 方法測定7 個餾分的ACE 抑制率。

3 結(jié)果與分析

3.1 ACE-HHI-ACEI體系的建立

馬尿酸標準曲線的高效液相色譜圖見圖1。

圖1 馬尿酸標準曲線的高效液相色譜圖Fig.1 Chromatogram of the standard solution of hippuric acid

在本試驗色譜條件，能有效分離濃度為0.005 mmol/L～0.5 mmol/L 的馬尿酸標準溶液，馬尿酸的出峰時間為4.147 min。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，得線性方程為y=1 714.3x+1.113 8，R2=0.999 7，馬尿酸標準曲線線性關(guān)系良好。

3.2 美藤果殼提取溶劑和有效殼層的篩選

3.2.1 提取溶劑篩選

不同溶劑美藤果殼提取物的ACE 抑制率見圖2。

圖2 不同溶劑美藤果殼提取物的ACE 抑制率Fig.2 ACE inhibition rate of extracts by different extraction solvent

如圖2 所示，選擇極性不同的提取溶劑對美藤果殼進行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水提取物效果最好，而甲醇、乙醇提取物的效果也優(yōu)于其他有機試劑，這可能由于美藤果殼中的降壓有效成分含有一定的親水基團（如羥基），使其在水、醇類溶劑中溶出率更高。因此，最終選定水作為提取美藤果殼降血壓物質(zhì)的溶劑，其提取物簡稱為SISE。

3.2.2 美藤果殼有效殼層篩選

不同美藤果殼層提取物的ACE 抑制率見圖3。

圖3 不同美藤果殼層提取物的ACE 抑制率Fig.3 ACE inhibition rate of extracts from different shell parts

通過比較美藤果殼各殼層的提取物的ACE 抑制活性，發(fā)現(xiàn)美藤果果殼提取物的ACE 抑制率顯著優(yōu)于其他單一殼層，這可能是因為在提取過程中果殼的內(nèi)外兩層中的物質(zhì)會發(fā)生反應(yīng)，從而表現(xiàn)出協(xié)同作用[22]；外殼提取物的ACE 抑制率優(yōu)于內(nèi)殼，這可能是因為外殼提取液中物質(zhì)更為豐富，而內(nèi)殼主要是木質(zhì)纖維，有效成分少。因此選定美藤果殼作為提取研究的對象。

3.3 提取物降壓活性評價

3.3.1 SISE 對ACE 的抑制效果評價

SISE 與其他ACEI 的ACE 抑制率見圖4。

圖4 SISE 與其他ACEI 的ACE 抑制率Fig.4 ACE inhibition rate of SISE and other ACEI

如圖4 所示，在同等濃度下，SISE 的ACE 抑制率顯著（P＜0.05）高于其他天然的ACEI。而且SISE（40 mg/mL）的抑制效果也要優(yōu)于卡托普利（0.5 mg/mL）。美藤果殼提取物在抑制ACE 活性方面具有優(yōu)勢，純化分離其有效降壓成分具有深遠意義。

3.3.2 SISE 短期降血壓功效評價

SISE 短期降血壓效果見圖5。

圖5 SISE 短期降血壓效果Fig.5 Short-term anti-hypertensive effect of SISE

如圖5 所示，SHR 大鼠經(jīng)低劑量（50 mg/kg·BW）和中劑量（100 mg/kg·BW）的給藥后其收縮壓未顯著降低，而經(jīng)高劑量（400 mg/kg·BW）的 SISE 給藥 0.5 h后收縮壓顯著降低，給藥1 h 后SHR 大鼠收縮壓由166 mmHg 顯著降低至135 mmHg，說明SISE 具有降血壓的功效。與陽性對照組相比，高劑量（400 mg/kg·BW）的SISE 短期內(nèi)降壓維持時間（用藥后0.5 h 至4h）比400 mg/kg·BW 的卡托普利（用藥后 0.5 h 至 1 h）長。

3.4 美藤果殼提取物毒理學(xué)評價

3.4.1 SISE 小鼠急性毒理學(xué)實驗

美藤果殼屬于新物質(zhì)，須對其進行安全性評價。以最大給藥量12 g/kg 灌胃小鼠，觀察期內(nèi)，小鼠飲食、活動均未受影響，排泄正常，身體各處未見異常分泌物或其他不良反應(yīng)。觀察期結(jié)束后7 d 內(nèi)未出現(xiàn)死亡或其他臨床異常表現(xiàn)。

3.4.2 SISE 對小鼠體重和臟器的影響

在觀察期內(nèi)，實驗組和空白組小鼠體重逐漸增加，且體重變化水平未見明顯差異見圖6 A 和圖6B，說明灌胃SISE 未影響小鼠體重增長。解剖后觀察小鼠主要臟器，未見明顯損傷或病變，計算其臟器指數(shù)亦未見明顯差異見圖6 C。依據(jù)國家標準的毒物分級判斷SISE 為食品級無毒。

圖6 各組小鼠觀察期內(nèi)體重變化及主要臟器指數(shù)Fig.6 Changes of weight in mice during observation period and organ index

3.5 美藤果殼降血壓成分有效部位的分離純化

3.5.1 萃取分離

不同萃取層的ACE 抑制率見圖7。

本研究進一步篩選了SISE 依次經(jīng)不同極性的有機溶劑萃取后，ACE 抑制率最高的萃取部位。圖7 表明，正丁醇萃取物具有最佳的ACE 抑制作用，ACE 抑制率達到53.83%，顯著高于石油醚、氯仿、乙酸乙酯等有機溶劑萃取物的抑制率，因此選取正丁醇萃取物進行進一步的分離純化。

圖7 不同萃取層的ACE 抑制率Fig.7 ACE inhibition rate of extracts by different extraction solvent

3.5.2 硅膠柱層析

本研究還進一步篩選了正丁醇萃取物中降血壓成分的有效部位，不同洗脫組分的ACE 抑制率見圖8。

圖8 不同洗脫組分的ACE 抑制率Fig.8 ACE inhibition rate of extracts from different elution component

如圖8，采用氯仿/甲醇（7 ∶3）洗脫得的組分 ACE抑制效果最佳，ACE 抑制率達到97.77%，這對后續(xù)分離純化單體提供了方向。

4 結(jié)論

本研究以ACE-HHL-ACEI 反應(yīng)體系為體外模型，篩選最佳提取溶劑和殼層，并結(jié)合SHR 大鼠模型，初步評價了美藤果殼提取物的降血壓功效體外實驗表明，美藤果殼提取物對ACE 活性抑制率為74.18%，顯著高于其他天然ACEI（菊花、銀杏提取物）。動物實驗表明，高劑量（400 mg/kg·BW）的 SISE 顯著降低了SHR 大鼠的血壓水平，用藥1 h 后SHR 大鼠收縮壓由166 mmHg 降低至135 mmHg。體內(nèi)外實驗結(jié)果初步證實了SISE 具備降血壓功效。急性經(jīng)口毒性試驗表明SISE 屬于食品級無毒，且在觀察期內(nèi)對實驗組小鼠體重、臟器功能無不良影響。

本研究還對SISE 有效降壓成分進行初步分離，體外實驗表明其有效降壓成分主要集中在正丁醇萃取物中，其ACE 抑制率為53.83%；正丁醇萃取物經(jīng)硅膠柱，氯仿/甲醇梯度洗脫，氯仿/甲醇（7 ∶3）組分的 ACE抑制效果最佳。本研究初步證實了美藤果殼水提取物的降壓功效，且發(fā)現(xiàn)有效降壓成分主要集中在正丁醇萃取物中，為進一步研究和開發(fā)美藤果殼作為天然降血壓藥物奠定了基礎(chǔ)。