楊芳 楊仕梅 羅雪 吳佳海 宋莉

摘 要：熱激蛋白（HSPs）是細胞受逆境誘導產生的一類具有穩(wěn)定蛋白質結構、修復變性蛋白和維護生物膜穩(wěn)定等功能的分子伴侶，同時，在緩解植物高溫傷害和提高熱耐受性等方面有重要的調控作用。根據(jù)百脈根基因組數(shù)據(jù)，利用生物信息學方法對百脈根Hsp70基因（LjHsp70s）家族的基因結構、染色體分布、選擇壓力、順式作用元件、表達特性和系統(tǒng)進化等進行分析。結果表明，LjHsp70s家族有18個成員，分為4類，它們的內含子和外顯子數(shù)量為1～8，含有多個保守基序，分布在6條染色體上，編碼602～703個氨基酸，均編碼酸性親水蛋白;含有激素、光照及脅迫等響應順式作用元件，LjHsp70s在百脈根的根、莖、葉等部位均有表達，但其表達量不同;該家族基因在進化過程中主要受負選擇作用，進化上較為保守，家族成員與擬南芥和煙草的Hsp70基因可分為6組，但是百脈根LjHsp70s基因僅存在于4個亞族中，表明其與擬南芥、煙草的Hsp70s基因家族成員之間進化關系密切，同時也存在一定差異。LjHsp70s基因在百脈根的各個部位均有表達，對百脈根生長發(fā)育過程起著重要的作用，研究結果為解析百脈根LjHsp70s基因功能提供了依據(jù)。

關鍵詞：百脈根;LiHsp70s基因結構;熱激蛋白;生物信息學;功能預測

HSPs has important regulatory effects on relieving high temperature damage to plants and improving heat tolerance. Based on the genomic data of the Lotus japonicus，the bioinformatics method were employed to analyze the gene structure，chromosome distribution，selection pressure，cis-acting elements，expression characteristics and phylogenetic evolution of the Hsp70 gene （LjHsp70s） family. The results showed that the LjHsp70s family had 18 members，which were divided into 4 categories. Their introns and exons ranged from 1 to 8. They contained multiple conserved motifs，distributed on 6 chromosomes，encoded 602～703 amino acids，and all encoded acidic hydrophilic proteins. They contained cis-acting elements such as hormones，light and stress，and LjHsp70s were expressed in roots，stems，leaves，and other parts of the roots，but their expression levels were different. This family of genes were mainly negatively selected during evolution process and were conservative in evolution. The Hsp70 genes of the family members and Arabidopsis and tobacco can be divided into 6 groups，but the LjHsp70s gene was only present in 4 subfamilies，it indicated that it had close evolution relationship with the members of the Hsp70s gene family of Arabidopsis thaliana and tobacco，but there were also some differences. The LjHsp70s gene was expressed in all parts of L. japonicus and played an important role in the growth and development of L. japonicus. The results provide a basis for the analysis of the function of LjHsp70s gene.

Keywords：Lotus japonicus; LjHsp70s gene structure; heat shock protein; bioinformatics; function prediction

熱激蛋白（Heat shock proteins，HSPs）廣泛存在于動物、植物和微生物細胞中，在分子進化上高度保守，不但參與生物體的正常生理代謝過程，還為高溫等逆境誘導細胞產生分子伴侶，對蛋白質結構穩(wěn)定、變性蛋白修復和生物膜穩(wěn)定等起到重要調節(jié)作用[1]。按分子量大小可將HSPs分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和小熱激蛋白五大家族類型。其中，HSP70家族是保守性最高、分布最廣的一類熱激蛋白[2]。

HSPs與逆境脅迫響應相關，細胞受環(huán)境脅迫誘導時會大量產生HSPs，其在減輕逆境因子傷害的同時完成對植物體的修復[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，高溫、干旱、高鹽、高寒、化學物質和激素等多種環(huán)境因子均能誘導植物Hsp70表達而增強抗逆性[5];如臘梅CpHsp70-1基因表達受高溫和低溫誘導，從而增強植株響應敏感性[6]。高溫脅迫初期，花楸樹通過SpHsp70-1基因過表達實現(xiàn)對功能蛋白、結構蛋白及膜蛋白的保護作用，避免高溫脅迫傷害[7]。

百脈根（Lotus japonicus）又名五葉草、牛角花，是世界上廣泛栽培的多年生豆科牧草之一，具有營養(yǎng)豐富、抗旱耐寒、適口性好、采食率高等優(yōu)點，是一種優(yōu)質牧草及水土保持植物。隨著地球“溫室效應”的加劇，高溫脅迫對植物生長發(fā)育的影響日益受到重視，Hsp70家族作為抗高溫等逆境脅迫的主要分子伴侶之一，在植物的生長發(fā)育及抵抗逆境脅迫過程中起著重要的作用，所以對Hsp70基因功能的研究也越來越受人們的關注[8]。目前已從芝麻、向日葵、玉米、煙草等植物中鑒定出Hsp70s基因，然而關于百脈根中LjHsp70基因的信息還未見報道。本文通過百脈根全基因組序列分析對LjHsp70s基因家族進行鑒定，旨在為進一步分析其功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.2 LjHsp70s基因家族成員篩選

利用來自Pfam數(shù)據(jù)庫的隱馬爾科夫模型對百脈根全基因組數(shù)據(jù)庫進行比對，使用Hmmsearch軟件篩選符合模型的所有百脈根蛋白序列。使用 Pfam（http：//pfam.xfam.org/）在線工具（參數(shù)默認）除去無LjHsp70典型結構域的序列，篩選百脈根LjHsp70s基因家族蛋白序列。

1.3 系統(tǒng)進化分析

將檢索得到的百脈根、擬南芥和煙草的Hsp70蛋白序列通過軟件 Clustal X[9]進行Hsp70蛋白序列比對，然后利用MEGA 7.0 [10]軟件構建NJ（Neighbor-joining）系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值設置為1000，其他參數(shù)為系統(tǒng)默認值;使用FigTree（http：//tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/）軟件展示系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 結構特征和染色體定位分析

利用在線工具GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）對LjHsp70s家族成員進行基因結構分析，從百脈根數(shù)據(jù)庫獲取LjHsp70s基因在染色體上的位置信息，并用在線工具MG2C制作染色體定位圖。

1.5 Hsp70蛋白的理化性質及結構分析

利用 ExPASy中的ProtParam [11]軟件對LjHsp70s蛋白的理化性質進行分析，主要包括蛋白質大小、相對分子質量、理論等電點、不穩(wěn)定系數(shù)、信號肽和亞細胞定位等指標。利用軟件SOPMA [12]對LjHsp70s蛋白的二級結構進行分析。

1.6 基因選擇壓力分析

利用Blast建庫比對和 KaKs_Calculator[13] 工具，對百脈根LjHsp70s基因核苷酸的同義替換率（Ks）和非同義替換率（Ka）進行計算，獲得基因Ka/Ks比率，進行選擇壓力分析。

1.7 基因順式作用元件分析

利用工具 bedtools[14]獲得LjHsp70s基因上游2000 bp序列，利用在線網(wǎng)站 PlantCARE[15]對獲得的序列進行預測，并對主要的順式作用元件進行探究。

1.8 基因表達特性分析

為探究LjHsp70s基因在百脈根中的表達情況，從百脈根芯片數(shù)據(jù)庫下載百脈根在不同組織中基因表達數(shù)據(jù)，選取花、根、莖等5個組織的基因表達數(shù)據(jù)，利用TBtools （https：//www.biorxiv.org/content/early）進行作圖分析。

2 結果與分析

2.1 百脈根LjHsp70s基因家族成員與進化

利用來自Pfam數(shù)據(jù)庫的隱馬爾科夫模型（登錄號：PF00012）同百脈根基因組數(shù)據(jù)庫比對，得到112條序列。根據(jù)Hsp70s家族蛋白分子量范圍為66～78 kDa[16]，去掉不滿足條件的序列，最終篩選得到18條

LjHsp70s家族成員蛋白序列。為進一步了解LjHsp70s家族基因的進化特性，將百脈根（18條）與模式植物擬南芥（18條）和煙草（60條）的96條Hsp70s蛋白序列構建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。結果表明，96條Hsp70s基因共分為6個亞族，百脈根LjHsp70s僅存在于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ四個亞族中，其中，Ⅰ類最多，包含了14個家族成員，其亞細胞均定位于細胞質上;Ⅱ類有2個成員，亞細胞定位于細胞質和線粒體;Ⅲ、Ⅳ類最少，僅各包含了1個成員，亞細胞分別定位于細胞核、內質網(wǎng)，這種分布位置的差異性表明LjHsp70s不同成員之間存在著多樣性。然而，百脈根LjHsp70s家族成員在Ⅳ和Ⅵ類群中的缺失，表明其與擬南芥和煙草Hsp70s基因家族成員在分布和進化上存在一定差異，這可能和百脈根屬于豆科植物有關。研究發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)發(fā)育樹進化枝尖端較短的枝節(jié)表明，聚類的植物Hsp70s家族成員的氨基酸保守性較強，各家族成員間進化關系較密切。在I組進化群體中，8條LjHsp70s聚成一個獨立的亞群，推測在豆科植物中，可能會在I類中形成一個亞類。

2.2 基因結構和保守結構域分析

運用在線網(wǎng)站GSDS對18條LjHsp70s基因進行結構分析，結果表明，百脈根LjHsp70s基因各成員之間外顯子和內含子數(shù)量不同，均分布于1～8之間。在18條LjHsp70s基因家族成員中，LjHsp70-15的內含子和外顯子數(shù)目最多，均為8個;數(shù)目最少的是LjHsp70-17，僅有1個內含子和外顯子。此外，LjHsp70-2、LjHsp70-3、LjHsp70-5、LjHsp70-8、LjHsp70-9、LjHsp70-10和LjHsp70-11等7條基因具有1個內含子和2個外顯子，其中，LjHsp70-1注釋到3和5非翻譯區(qū)（UTR）。

利用MEME在線工具對LjHsp70s基因家族的蛋白序列進行分析（圖3），根據(jù)其保守性的強弱，依次命名為motif1～motif10。除去LjHsp70-11和LjHsp70-18缺失motif9，LjHsp70-16缺失motif5和motif7以外，其他家族成員均分布著10條motif結構，說明它們可能具有相似的功能。

2.3 基因的染色體定位

為充分了解百脈根LjHsp70s基因家族的組成和分布形式，根據(jù)其在染色體上的定位信息，制作染色體分布圖（圖4），以 Chr0 代表對所有不能定位到染色體的基因所虛構的一條染色體[17]。百脈根LjHsp70s基因家族18個成員分布于6條染色體內，在染色體中分布的位置有所不同，大多數(shù)分布于染色體的兩端;其中每條染色體中的LjHsp70s基因個數(shù)有所差異，1號染體上分布最多，含有7個家族成員，并且LjHsp70-5、LjHsp70-6、LjHsp70-7、LjHsp70-8四個基因以串聯(lián)重復出現(xiàn);6號染色體上含有3個家族成員，4號染色體上含有2個家族成員，2號和3號染色體上分布最少，僅有1個基因家族成員，將4個不能確定位置的成員歸納于Chr0染色體上。

2.4 蛋白的理化特性分析

對百脈根LjHsp70基因家族蛋白特征進行分析（表1），結果表明LjHsp70編碼蛋白的理化性質存在較大差異;在組成蛋白長度的氨基酸數(shù)量上，最大為703aa（LjHsp70-11），最小為602aa（LjHsp70-17）;蛋白分子質量也存在一定的差異，從67.66（LjHsp70-17）～75.93（LjHsp70-7）不等。除了LjHsp70-5、LjHsp70-6.1和LjHsp70-9以外，LjHsp70編碼蛋白的等電點位均小于8，表明大多數(shù)LjHsp70基因家族可能編碼弱酸性蛋白，在酸性亞細胞環(huán)境中發(fā)揮作用。在18條LjHsp70蛋白中，總平均親水性（GRAVY）均為負值，表明LjHsp70基因家族編碼蛋白均為親水性蛋白，其中以LjHsp70-15最大，為-0.457;LjHsp70-2最小，為-0.193。不穩(wěn)定指數(shù)介于28.22（LjHsp70-15）～40.82（LjHsp70-16）之間，為不穩(wěn)定蛋白。亞細胞定位表明，百脈根Hsp70 蛋白主要定位于細胞質中，其家族成員數(shù)量為15 個;另外3 個成員分別定位于內質網(wǎng)、細胞核、線粒體。

對LjHsp70s基因編碼蛋白的二級結構預測結果表明（表2），在18條LjHsp70基因家族成員中，主要包括α-螺旋、無規(guī)則卷曲和延伸鏈三種。其中LjHsp70蛋白的α-螺旋和無規(guī)則卷曲比例最高，分別為37.23%～41.96%、37.97%～44.58%;其次是延伸鏈，為15.06%～21.1%。

2.5 選擇壓力分析

利用非同義替換（Ka）和同義替換（Ks）的比值反映選擇壓力是否作用于氨基酸的各位點上。對來源于LjHsp70s基因家族間親緣關系最近的6個基因成員進行 Ka/Ks 分析（表3），結果顯示該基因對之間的 Ka/Ks 比值均小于1，表明百脈根Hsp70s基因家族在進化時主要受負選擇作用[18]。

2.6 順式作用元件分析

為預測百脈根LjHsp70s基因順式作用元件，通過提取基因上游2000 bp序列進行分析。結果顯示，百脈根LjHsp70s基因家族除了最基本的CAAT-box外，還包括大量其他順式作用元件，主要包括參與赤霉素反應性順式作用元件TATC-box和P-box、低溫響應順式作用元件LTR、晝夜節(jié)律調控順式作用調控元件circadian、細胞周期調控順式作用元件MSA-like、防御和壓力反應順式作用元件TC-rich repeats、分生組織表達順式作用調控元件CAT-box、胚乳表達順式調控元件GCN4_motif、脫落酸反應順式作用元件ABRE、生長素響應順式作用元件TGA-element以及光響應順式作用元件G-box、AE-box和TCCC-motif等（圖5）。分析表明，百脈根LjHsp70s基因啟動子包括大量與激素響應、光響應、脅迫響應、生長發(fā)育相關的順式作用元件，并且這些順式作用元件廣泛參與百脈根的生長發(fā)育過程，對植物的生長起著促進和保護作用。

2.7 表達特性分析

通過比對百脈根LjHsp70s基因在不同組織中表達數(shù)據(jù)，所得結果表明，百脈根LjHsp70s其因家族成員在根、莖、葉、花、種子五個組織中具有不同的表達模式（圖6）。其中，LjHsp70-1、LjHsp70-10、LjHsp70-15和LjHsp70-18在所有被檢測組織中均有表達，表明它們在百脈根生長和發(fā)育多個過程中都起著作用。并且不同基因具有不同的組織表達特異性，LjHsp70-18在百脈根的花、葉、莖中表達量較高，而LjHsp70-10在葉、莖、根中表達量較高，它們在百脈根的花、葉、莖以及根的發(fā)育過程中可能起著重要作用。

3 結論與討論

Hsp70作為逆境脅迫下產生的一類功能型蛋白，在調控植物生長發(fā)育、抗逆性以及作為分子伴侶方面起著重要的作用。目前，Hsp70s基因家族在許多植物中均已獲得報道，如在谷子中發(fā)現(xiàn)有25個GmHsp70基因[19];野生花生中發(fā)現(xiàn)A. duranensis和A.ipansis分別有 34 、35個Hsp70基因[20];在玉米中發(fā)現(xiàn)有35個ZmHsp70基因[21];芝麻中有21個SiHsp70基因[22]。對Hsp豆科牧草中70的了解極為有限，導致其對豆科牧草高溫耐受品種高效應用及育種工作的限制，所以，在前人研究的基礎上，本研究應用生物信息學方法從百脈根數(shù)據(jù)庫中鑒定得出18條LjHsp70s基因完整的編碼序列，并且這18條LjHsp70s基因的功能域為PF00012.20。構建系統(tǒng)發(fā)育樹有助于分析Hsp70s基因在不同物種間的進化關系，本研究以百脈根、擬南芥和煙草共96個Hsp70s基因構建了系統(tǒng)發(fā)育樹，96個Hsp70s基因家族被分為6個亞族，但是百脈根LjHsp70s基因僅存在于4個亞族中，表明其與擬南芥和煙草Hsp70s基因家族成員之間進化關系密切，也存在一定差異。

通過對百脈根LjHsp70s基因家族進行染色體定位分析，18個成員不均勻的分布在6條染色體上，并且部分基因存在串聯(lián)重復現(xiàn)象。趙鵬松等[23]認為串聯(lián)重復在一定程度上可以減輕由染色體突變或是遺傳引起的功能喪失，并且在基因功能的多樣性和特異性中起著作用。Motif結構分析表明，LjHsp70蛋白只有極少數(shù)的成員存在Motif丟失，證明其蛋白高度保守的這一特點。但是Hsp70s基因家族成員存在可變C-末端結構域、底物結合結構域（SBD）和N-末端核苷酸結合結構域（NBD）。研究發(fā)現(xiàn)，N-末端核苷酸結合結構域可執(zhí)行調節(jié)功能[24]。C-末端結構域的結構復雜，承擔了在附著和釋放底物期間發(fā)生結構變化，而底物結合結構域則與在非天然基板中表達的疏水區(qū)域密切相關[25]。根據(jù)HSP70蛋白存在的可變結構域推測百脈根LjHsp70s基因功能可延伸，雖然只分為4個亞族，但是其通過不同的編輯和結合方式，同樣可以承擔更多的功能。對百脈根LjHsp70蛋白特性進行分析，其主要為酸性的親水性蛋白，在酸性亞細胞環(huán)境中發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，Hsp70屬于親水性蛋白質，有利于提高植物抵抗非生物脅迫的能力[26]。亞細胞定位結果分析，大多數(shù)LjHsp70s基因家族成員分布于細胞質中，其原因可能與它們承擔的功能相關，即位于細胞質中的LjHsp70s成員在協(xié)同參與信息傳遞到細胞核中起著一定的作用，從而調控基因在細胞核內的表達[27]。在I組進化群體中，8條LjHsp70s聚成的獨立亞群，其亞細胞均定位于細胞質，推測這8條基因在百脈根生長發(fā)育過程中承擔了協(xié)助蛋白折疊、阻止蛋白聚集、維持細胞器前體蛋白結構的功能[28]。

對LjHsp70s基因上游的TC-rich repeats、circadian、ABRE、TATC-box和P-box等多個順式作用元件進行分析。結果顯示，百脈根中LjHsp70s基因的表達可能受到光響應、脅迫響應、赤霉素及脫落酸等作用元件的調控，并且通過這些順式作用元件參與了植物的生長發(fā)育，對植物的生長起著保護和促進作用。例如，脫落酸（ABA）是參與非生物脅迫反應的必需植物激素，參與干旱脅迫的代謝調控[29];研究表明，ABA可通過控制氣孔關閉和基因表達調控通路[31]，通過對百脈根LjHsp70s家族基因不同時期組織器官的表達特性分析結果表明，有16條LjHsp70s基因在植物體內各個部位以及不同時期均可以表達，其表達具有廣譜性，在一定程度上反映了LjHsp70s基因在百脈根生長發(fā)育過程中的重要性。

本文通過對百脈根LjHsp70s基因家族成員進行鑒定和生物信息學分析，較為系統(tǒng)地揭示了百脈根LjHsp70s基因的理化性質、順式作用元件及進化特性，為該基因功能研究及分子調控提供了理論依據(jù)。

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