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(1.貴州省動物疫病預防控制中心，貴州 貴陽 550008；2.貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025；3.貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

豬瘟(Classical swine fever，CSF)是1種急性、高度傳染性疫病，是豬的主要傳染病之一，臨床表現(xiàn)為實質(zhì)器官出血、壞死和梗死。慢性病例呈纖維素性壞死性腸炎，后期常伴有副傷寒、巴氏桿菌病等繼發(fā)感染[1～4]。目前豬瘟的急性暴發(fā)式流行已得到控制，但仍不斷有散發(fā)豬瘟的報道，有的豬瘟病例呈現(xiàn)非典型性癥狀，甚至通過胎盤感染而引起繁殖障礙[5～7]。豬瘟病毒(CSFV)是具有囊膜的單股正鏈RNA病毒，長度為12.3 kb，僅含有1個大的開放閱讀框架(ORF)，編碼1個含3 898個氨基酸殘基的多聚前體蛋白，其前體蛋白被加工成CSFV蛋白的順序依次為NPRO、C、E0、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B[8～11]。其中C、E0、E1、E2為其結構蛋白，但只有EO和E2囊膜糖蛋白能夠誘導機體產(chǎn)生中和抗體。E2囊膜糖蛋白是豬瘟病毒的主要結構蛋白，是抗豬瘟病毒感染的主要保護性抗原。因此，E2基因的研究能較好地反映豬瘟病毒的進化與疫苗免疫效果相關關系。本研究通過擴增豬瘟病毒貴州株E2基因片段，通過克隆、測序和序列分析，了解其基因變異性和進化關系，旨在掌握貴州省豬瘟散發(fā)病例病原進化信息，為疫苗選擇與防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料(1)豬瘟病料組織樣本，采自貴州省某養(yǎng)殖場臨床病例。(2)陽性對照樣本為豬瘟弱毒疫苗，由貴州瑞特新科農(nóng)牧有限公司提供。

1.2 試劑RT-PCR擴增試劑、RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ、200 bp Marker、pMD19-T載體等均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物設計與合成針對CSFVE2基因序列信息，設計CSFVE2基因特異性引物1對，引物序列見表1，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

表1 引物序列信息

1.4 CSFVE2基因的RT-PCR擴增按照RNA提取試劑盒說明書方法提取組織樣本和豬瘟疫苗的總RNA，將提取的總RNA反轉錄為cDNA。以cDNA為模板，建立PCR反應體系50 μL：2×TaqMasterMix 25.0 μL，引物P1、P2各2.0 μL，DNA模板4.0 μL，滅菌ddH2O 17.0 μL。反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性40 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳觀察結果。

1.5 CSFVE2基因克隆與測序將目的基因進行膠回收，目的基因與pMD19-T載體連接轉化感受態(tài)細胞，應用PCR和雙酶切技術對重組質(zhì)粒進行篩選，陽性質(zhì)粒由大連寶生物有限公司進行測序。

1.6 目的基因序列分析采用DNAStar和Mega 5.0軟件對CSFVE2基因變異、核苷酸同源性和系統(tǒng)進化分析。

2 結果

2.1 CSFVE2基因的RT-PCR擴增結果由圖1可見，組織樣本中擴增獲得大小約1 343 bp的基因片段，與預期擴增大小相符。

圖1 CSFV E2基因RT-PCR檢測結果M：200 bp Marker；1：陽性對照；2：臨床病料樣本

2.2 CSFVE2基因克隆與篩選由圖2可見，重組質(zhì)粒PCR檢測顯示擴增出約1 343 bp的目的基因，與預期大小相符。由圖3可見，重組質(zhì)粒DNA經(jīng)Hind Ⅲ和BamH Ⅰ雙酶切可見約2 600 bp的載體條帶和1 343 bp的目的基因條帶。PCR和雙酶切鑒定結果均說明目的基因已成功克隆。

圖2 CSFV E2重組質(zhì)粒PCR鑒定M：200 bp Marker；1、2：重組質(zhì)粒

圖3 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定M：200 bp Marker；1：空載體對照；2：PCR產(chǎn)物對照；3：重組質(zhì)粒

2.3 CSFVE2基因序列測定與分析

2.3.1CSFVE2基因測序與變異分析：將經(jīng)PCR鑒定為陽性重組質(zhì)粒的E2基因克隆菌送至寶生物工程(大連)有限公司進行基因序列測定，并應用DNAStar生物軟件對測得的序列與國內(nèi)豬瘟經(jīng)典毒株進行相應比較。結果：測序獲得1 343 bp的CSFVE2基因片段，大小與預期擴增結果完全一致，命名為：CSFV貴州株GZPD。其堿基相對于shimen株發(fā)生了53個堿基突變，占總核苷酸數(shù)的3.9%(53/1 343)；相對于HCLV株發(fā)生了8個堿基突變，占總核苷酸數(shù)的0.6%(8/1 343)；與shimen、HCLV 2種經(jīng)典毒株核苷酸序列相比較，20個堿基同時發(fā)生突變，占總核苷酸數(shù)的1.5%(20/1 343)。

2.3.2CSFVE2基因核苷酸同源性分析：將CSFV貴州株GZPDE2基因的核苷酸測序結果與國內(nèi)外的CSFV-GZ-2009、C-strain、C-ZJ-2008、GPE、HCLV、HuBei、Koslov、Shimen經(jīng)典毒株進行核苷酸同源性分析，結果見表2：CSFV貴州株GZPDE2基因的核苷酸與國內(nèi)毒株CSFV-GZ-2009、C-ZJ-2008、HuBei等毒株E2基因之間存在較高的同源性，為94.9%～99.9%；與國外毒株GPE、Koslov的核苷酸同源性為95.1%～95.3%。

圖4 豬瘟病毒貴州株GZPD與參考毒株 E2基因核苷酸序列的同源性

2.3.3CSFVE2基因進化樹分析：將CSFV貴州株GZPDE2基因的核苷酸測序結果與國內(nèi)外CSFV參考株E2基因進行系統(tǒng)進化分析，結果見圖5：CSFV貴州株GZPDE2基因與參考毒株HuBei、C-ZJ-2008、C-strain、HCLV處于同一進化分支，而與shimen、CSFV-GZ-2009、Koslov、GPE處于不同進化分支。

圖5 CSFV E2核苷酸分子進化樹

3 結論

本試驗通過對豬瘟病毒貴州株GZPD的E2基因進行序列測定，與現(xiàn)有疫苗株序列同源性及進化樹分析，表明其E2基因存在一定變異。研究結果可為貴州豬瘟疫苗的選擇及免疫防控提供參考依據(jù)。

4 討論

近年來，各地報道豬瘟病例臨床癥狀呈現(xiàn)不典型性，且現(xiàn)有疫苗免疫后保護率也參差不齊。岳宗吉等[12]對16個省市48個發(fā)病豬場進行調(diào)查，表明規(guī)模豬場主要發(fā)生臨床癥狀不典型的豬瘟，發(fā)病多見于3月齡以下的仔豬，發(fā)病率和死亡率普遍較高。豬瘟在同一豬場中育肥豬和種豬發(fā)病率較低，母豬多為隱性感染，部分表現(xiàn)出繁殖障礙，隱性感染母豬是仔豬的重要傳染源。王在時[13]對8個省19個豬場采集樣品15 736份調(diào)查表明，豬瘟平均帶毒率為11.58%，湖南、浙江、甘肅、新疆、湖北、山東等地帶毒率頗為相似。龐金蘭等[14]對貴州省黔西縣豬瘟免疫抗體進行監(jiān)測，結果發(fā)現(xiàn)免疫期最長的為5個月，最短為1個月。這些研究結果均提示可能存在豬瘟病毒變異，現(xiàn)有疫苗免疫效果不佳的現(xiàn)象。本研究結果也顯示豬瘟病毒貴州流行株存在一定變異，但這是否是導致疫病發(fā)生和免疫效果差的主要原因，還需進一步研究確定。