姚輝，鄧林紅，歐陽(yáng)明星

(常州大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程與健康科學(xué)研究院，常州 213164)

1 引 言

哮喘作為全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的一種慢性呼吸道疾病，其發(fā)病率和死亡率正逐年增長(zhǎng)。據(jù)相關(guān)調(diào)查統(tǒng)計(jì)，全球有超過(guò)3億的哮喘病患者，中國(guó)約有3 000萬(wàn)人患有哮喘[1]。氣道平滑肌作為呼吸道的重要組成部分，與哮喘有著密不可分的關(guān)系，例如哮喘的典型特征為氣道高反應(yīng)性(airway hyper-responsiveness，AHR)，其主要成因之一是氣道平滑肌細(xì)胞增生，平滑肌層增厚，引起氣道過(guò)度收縮且無(wú)法自主松弛[2]。實(shí)驗(yàn)研究顯示該過(guò)程中ASM細(xì)胞的力學(xué)性能也發(fā)生了變化，AHR現(xiàn)象也體現(xiàn)為一種生物力學(xué)行為[3]，但其生物力學(xué)機(jī)制尚不清楚。

Fyn作為非受體酪氨酸激酶Src家族的一員(Src family tyrosine kinase，SFKs),在前列腺癌等癌癥病變[4]的病理機(jī)制中起著重要作用。有研究報(bào)道Fyn參與細(xì)胞力學(xué)行為的調(diào)控[5]。ASM 細(xì)胞表達(dá)Fyn激酶[6]，而血小板生長(zhǎng)因子(PDGF)能刺激ASM 細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)ASM 細(xì)胞收縮延長(zhǎng)效應(yīng)[7]。目前，PDGF能否激活A(yù)SM 細(xì)胞中的Fyn激酶，以及細(xì)胞力學(xué)微環(huán)境是否調(diào)節(jié)ASM 細(xì)胞中的Fyn激酶活性，仍未見(jiàn)有報(bào)道。因此，探討平滑肌細(xì)胞的力學(xué)微環(huán)境對(duì)Fyn激酶活性的影響具有一定意義,為進(jìn)一步理解哮喘中氣道細(xì)胞力學(xué)性能改變引起提供線(xiàn)索。

細(xì)胞與胞外基質(zhì)的黏附強(qiáng)度代表了一種細(xì)胞力學(xué)微環(huán)境[8]。纖維粘連蛋白主要分布在細(xì)胞表面和胞外基質(zhì)中，可促進(jìn)傷口的修復(fù)和愈合，調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附、遷移以及生長(zhǎng)分化，本研究通過(guò)改變基底纖維粘連蛋白的黏附強(qiáng)度來(lái)調(diào)節(jié)ASM 細(xì)胞力學(xué)微環(huán)境，初步探討其對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)活性如Fyn激酶的影響。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)是由供體和受體熒光分子之間通過(guò)非輻射的偶極-偶極相互作用產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移的一種量子力學(xué)的現(xiàn)象。近二十年來(lái)，基于FRET原理發(fā)展的技術(shù)已經(jīng)成為監(jiān)測(cè)活細(xì)胞中動(dòng)態(tài)分子活動(dòng)的一種強(qiáng)有力的方法[9]。本研究運(yùn)用FRET技術(shù)，通過(guò)利用我們已開(kāi)展的Fyn FRET分子探針工作[10]，探究PDGF誘導(dǎo)的ASM 細(xì)胞中Fyn激酶的激活，并通過(guò)改變纖連蛋白黏附強(qiáng)度，觀察基底黏附力微環(huán)境對(duì)ASM 細(xì)胞中Fyn活性的影響。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1細(xì)胞種類(lèi)與來(lái)源 大鼠平滑肌細(xì)胞(ASM 細(xì)胞)來(lái)源于6～8周的雌性Sprague Dawley大鼠，采用組織塊貼壁法與酶消化相結(jié)合的方法取得原代細(xì)胞，通過(guò)反復(fù)貼壁法提純ASM 細(xì)胞，鑒定方法為免疫熒光法結(jié)合相差顯微鏡的形態(tài)學(xué)觀察法。

2.1.2主要試劑和儀器 胎牛血清FBS，DMEM低糖培養(yǎng)基，Opti-MEM培養(yǎng)基，0.25%胰蛋白酶，細(xì)胞貼壁消化試劑Accutase，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Fibronectin，Corning公司；激光共聚焦培養(yǎng)皿(20 mm)，NEST公司；FRET顯微鏡平臺(tái)，倒置顯微鏡Primo Vert，德國(guó)Zeiss公司。

2.2 方法

2.2.1ASM 細(xì)胞轉(zhuǎn)染Fyn FRET 探針 根據(jù)此前的研究結(jié)論[17], 本研究中使用膜定位的Fyn FRET探針,便于精確檢測(cè)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)上的Fyn激酶活性。轉(zhuǎn)染前12 h，用胰蛋白酶消化ASM 細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，1 000 rpm離心5 min去除胰蛋白酶，計(jì)算細(xì)胞數(shù)量使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度約為60～80%，六孔板的每個(gè)孔以2 mL 10% FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染時(shí)六孔板中每個(gè)孔的細(xì)胞轉(zhuǎn)染2.5 μg DNA。轉(zhuǎn)染后12 h，用1×PBS清洗細(xì)胞一次，換成2 mL含有0.5% FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基，在血清饑餓條件下培養(yǎng)24～36 h。

2.2.2Fibronectin濃度梯度實(shí)驗(yàn)設(shè)置 實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)ibronectin濃度梯度設(shè)定為1.25、2.5、5、10、20、40 μg/mL。用1×PBS稀釋Fibronectin(1 mg/mL)儲(chǔ)液，在每個(gè)共聚焦皿的玻璃底部(直徑2 cm)加500 μL稀釋后的溶液，在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4 h。將轉(zhuǎn)染Fyn FRET 探針的ASM細(xì)胞傳到共聚焦皿上，以0.5% FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)貼壁6～8 h后，在5 h內(nèi)完成所有樣品的FRET顯微鏡成像實(shí)驗(yàn)，避免細(xì)胞本身分泌的胞外基質(zhì)蛋白極大改變預(yù)設(shè)的Fibronectin黏附強(qiáng)度差異。

2.2.3FRET顯微鏡采集ASM 細(xì)胞圖像數(shù)據(jù) 顯微鏡成像前，用Accutase消化液消化轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到鋪設(shè)有Fibronectin的共聚焦皿中，繼續(xù)培養(yǎng)在含0.5% FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基中。FRET顯微鏡的ECFP成像通道的熒光濾片參數(shù)為激發(fā)436/20,分光455,發(fā)射 480/40；FRET成像通道的熒光濾片參數(shù)為激發(fā)436/20,分光455,發(fā)射535/30(Zeiss)。在實(shí)驗(yàn)拍攝過(guò)程中，5～6 min之間通過(guò)外接導(dǎo)管給細(xì)胞樣品加入1 mL含PDGF(終濃度 50 ng/mL)的DMEM低糖培養(yǎng)基(0.5% FBS)。

2.2.4FRET圖像數(shù)據(jù)的定量分析 FRET顯微鏡采取的細(xì)胞圖像數(shù)據(jù)分析依據(jù)我們此前的研究[10]。研究數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±S.E.M.)”表示，采用統(tǒng)計(jì)分析軟件GraphPad Prism 6進(jìn)行方差分析，用t-test分析數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異，以P<0.05為具有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 PDGF刺激誘導(dǎo)ASM 細(xì)胞中Fyn激酶的激活

大鼠氣道平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染Fyn FRET探針 DNA質(zhì)粒后24～48 h，通過(guò)熒光顯微鏡的GFP通道可觀察到在普通細(xì)胞培養(yǎng)皿上，約5～10%的細(xì)胞已成功表達(dá)Fyn FRET 探針，見(jiàn)圖1(a)，滿(mǎn)足后續(xù)FRET實(shí)驗(yàn)所需要的轉(zhuǎn)染效率。然后我們檢測(cè)了PDGF刺激對(duì)Fyn的活性影響，見(jiàn)圖1(b)，PDGF的刺激能顯著引起ASM 細(xì)胞中Fyn FRET的反應(yīng)。多個(gè)細(xì)胞中的FRET變化定量分析顯示PDGF能誘導(dǎo)Fyn的快速激活，5 min內(nèi)達(dá)到高活性的平臺(tái)期，見(jiàn)圖1(c)。統(tǒng)計(jì)的平均結(jié)果顯示，代表細(xì)胞中Fyn激酶相對(duì)活性的FRET比值(ECFP/FRET)從刺激前的0.347，升高到了PDGF刺激5 min后的0.744，變化率達(dá)到了約110%，見(jiàn)圖1(d)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PDGF能快速高效地激活A(yù)SM 細(xì)胞中Fyn激酶活性。

注：**** 代表P<0.0001,兩組數(shù)據(jù)的平均值分別為0.347和0.744。

圖1PDGF刺激誘導(dǎo)ASM細(xì)胞中Fyn FRET反應(yīng)

(a).ASM細(xì)胞轉(zhuǎn)染后表達(dá)Fyn FRET探針;(b).PDGF刺激誘導(dǎo)ASM細(xì)胞中Fyn FRET反應(yīng)。細(xì)胞圖片的顏色代表ECFP/FRET比值分布圖，從藍(lán)到紅代表FRET比值從低到高，也意味著Fyn的相對(duì)活性從低到高的變化;(c).PDGF誘導(dǎo)一組ASM細(xì)胞(N=12)中Fyn FRET反應(yīng)，圖中顯示每個(gè)單細(xì)胞的ECFP/FRET比值在沿時(shí)間軸方向上的定量變化曲線(xiàn);(d).在(c)中的ASM細(xì)胞在PDGF刺激前后的ECFP/FRET比值變化統(tǒng)計(jì)(平均值+方差，mean+SEM，N=12)

Fig.1PDGF-induced Fyn FRET responses in ASM cells

3.2 細(xì)胞-基質(zhì)黏附強(qiáng)度可調(diào)節(jié)Fyn的激活

下一步觀察細(xì)胞-基質(zhì)黏附強(qiáng)度的力學(xué)微環(huán)境是否會(huì)影響ASM 細(xì)胞中的化學(xué)信號(hào)。轉(zhuǎn)染Fyn FRET 探針的ASM 細(xì)胞傳到鋪設(shè)有不同F(xiàn)ibronectin濃度的共聚焦皿上，6～8 h后開(kāi)始FRET成像。顯微鏡下可清晰地觀察到，在Fibronectin低濃度的小皿上(1.25 和2.5 μg/mL)，多數(shù)細(xì)胞的貼壁形態(tài)還未完全鋪展開(kāi),見(jiàn)圖2(a)，表明其黏附強(qiáng)度相對(duì)較弱(比較1.25和2.5 μg/mL)。FRET成像結(jié)果顯示，在不同濃度的Fibronectin條件下，PDGF刺激都能有效地激活A(yù)SM 細(xì)胞中的Fyn激酶活性，見(jiàn)圖2(a)。從定量的角度分析，F(xiàn)yn的激活程度和Fibronectin濃度存在明顯的相關(guān)性，見(jiàn)圖2(b)，隨著Fibronectin濃度遞增，F(xiàn)RET反應(yīng)曲線(xiàn)(平均值±方差)也上移；從統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異分析，當(dāng)Fibronectin濃度達(dá)到5 μg/mL或以上，與低濃度的1.25 μg/mL條件下相比，F(xiàn)yn的激活存在顯著性增加,見(jiàn)圖2(c)。這些結(jié)果初步顯示，細(xì)胞-基質(zhì)黏附強(qiáng)度的力學(xué)微環(huán)境會(huì)一定程度上調(diào)控PDGF誘導(dǎo)的ASM 細(xì)胞中Fyn的活性。

注：*代表P<0.05,**代表P<0.01,***代表P<0.001。

圖2細(xì)胞-Fibronectin黏附強(qiáng)度對(duì)PDGF誘導(dǎo)ASM細(xì)胞中Fyn活性的影響

(a).ASM細(xì)胞黏附在包被有不同濃度Fibronectin的共聚焦皿上，PDGF刺激誘導(dǎo)細(xì)胞中Fyn FRET反應(yīng)前后的ECFP/FRET比值分布圖。實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞貼壁6～8h后，開(kāi)始FRET顯微鏡成像實(shí)驗(yàn);(b).在(a)中的每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下，各組ASM細(xì)胞(N>10)中的Fyn FRET反應(yīng)統(tǒng)計(jì)，圖中顯示ECFP/FRET比值在沿時(shí)間軸方向上的定量變化統(tǒng)計(jì)曲線(xiàn)(平均值方差)。各曲線(xiàn)的起始點(diǎn)數(shù)值均歸1;(c).實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(b)中不同濃度Fibronectin的細(xì)胞組在PDGF刺激前(0min)、后(5min)的ECFP/FRET比值變化統(tǒng)計(jì)(平均值+方差)，各組平均值依次為1.803,1.870,2.091,1.989,2.110,2.305

Fig.2Cell-Fibrinectin adhesion strength regulates PDGF-induced Fyn activity in ASM cells

3.3 抑制細(xì)胞內(nèi)部的收縮力不影響Fyn的激活

細(xì)胞外部基質(zhì)黏附強(qiáng)度的力學(xué)微環(huán)境能影響ASM 細(xì)胞中Fyn的激活，我們也初步觀察了細(xì)胞內(nèi)部的收縮力對(duì)Fyn活性的影響。ML-7是肌球蛋白輕鏈磷酸化的抑制劑，能抑制細(xì)胞內(nèi)的收縮力[11]。異丙腺素(ISO)是一種β-受體激動(dòng)劑，已證明ISO能舒張ASM 細(xì)胞，降低細(xì)胞自身的剛度和收縮力[12]。在FRET實(shí)驗(yàn)中，ASM 細(xì)胞分別經(jīng)ML-7或ISO處理以減弱細(xì)胞內(nèi)收縮力后，PDGF均能有效激活細(xì)胞中Fyn的活性，見(jiàn)圖3(a)。多細(xì)胞水平上的進(jìn)一步定量分析顯示，和對(duì)照組比較，這些減弱細(xì)胞收縮力的藥物處理對(duì)PDGF誘導(dǎo)的ASM 細(xì)胞中Fyn的活性，無(wú)明顯影響，見(jiàn)圖3(b)、圖3(c)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步顯示減弱ASM 細(xì)胞內(nèi)收縮力，不影響PDGF誘導(dǎo)的Fyn活性，提示前面降低細(xì)胞-基質(zhì)黏附強(qiáng)度造成的Fyn活性下調(diào)，可能不是經(jīng)由減弱細(xì)胞內(nèi)收縮力的途徑而引起的。

注：N.S.代表P≥0.05，無(wú)顯著性差異。

圖3抑制細(xì)胞內(nèi)收縮力對(duì)PDGF誘導(dǎo)的ASM細(xì)胞中Fyn活性的影響

(a).ASM細(xì)胞在藥物處理4h后(藥物工作濃度ML-7:10μM；ISO:10μM)，PDGF刺激誘導(dǎo)Fyn FRET反應(yīng)，圖中顯示各條件下代表性細(xì)胞的ECFP/FRET比值分布圖;(b).在實(shí)驗(yàn)條件(a)中，藥物處理后各組ASM細(xì)胞(N>10)中的Fyn FRET反應(yīng)統(tǒng)計(jì)，圖中顯示ECFP/FRET比值在沿時(shí)間軸方向上的定量變化統(tǒng)計(jì)曲線(xiàn)(平均值方差);(c).實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(b)中不同藥物處理的細(xì)胞組在PDGF刺激前后的ECFP/FRET比值變化統(tǒng)計(jì)(平均值+方差)

Fig.3The effect of inhibiting intracellular contraction force on PDGF-induced Fyn activity in ASM cells

4 討論

哮喘是一種由多種細(xì)胞及細(xì)胞因子共同參與的慢性氣道炎癥反應(yīng)及氣道高反應(yīng)性(AHR)疾病。雖然氣道平滑肌在哮喘中的重要作用早已被認(rèn)識(shí)，但其參與AHR發(fā)病機(jī)制的確切性質(zhì)尚不清楚，并且單純的抗炎治療并不能“治愈”哮喘。即使沒(méi)有氣道炎癥，氣道高反應(yīng)性也會(huì)在哮喘患者中持續(xù)存在，這可能是因?yàn)樵摨煼](méi)有直接治療哮喘患者氣道平滑肌過(guò)度收縮而導(dǎo)致的氣道狹窄。有研究表明哮喘患者的氣道平滑肌總量是增加的，即使沒(méi)有收縮表型的改變，也有可能增強(qiáng)氣道反應(yīng)性，從而導(dǎo)致哮喘癥狀[13]。

本研究考慮生理?xiàng)l件下氣道平滑肌力學(xué)性能的重要性，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞層面的力學(xué)微環(huán)境，初步觀察了ASM 細(xì)胞中力學(xué)-生化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。研究中通過(guò)改變細(xì)胞-基底黏附強(qiáng)度，利用靈敏的FRET分子探針實(shí)時(shí)測(cè)量活細(xì)胞中Fyn激酶的活性，初步發(fā)現(xiàn)物理的黏附強(qiáng)度與PDGF誘導(dǎo)的Fyn激活這個(gè)化學(xué)信號(hào)現(xiàn)象間有正相關(guān)性。該結(jié)果具有一定的基礎(chǔ)理論研究意義，也提示慢性的哮喘病理?xiàng)l件下，持續(xù)性收縮引起的氣道平滑肌層的力學(xué)環(huán)境改變可能也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部生化信號(hào)的變化。雖然該研究結(jié)果的細(xì)胞分子機(jī)制有待進(jìn)一步闡明，這個(gè)初步性的工作對(duì)全面理解氣道平滑肌的力學(xué)生物學(xué)特點(diǎn)有一定幫助，對(duì)了解哮喘病理?xiàng)l件下氣道平滑肌細(xì)胞內(nèi)的生化信號(hào)變化提供了一些思路。