周文忠，張峻松，鄒 悅，劉 靜，高占勇，楊盼盼*

(1.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.云南同創(chuàng)檢測技術(shù)股份有限公司，云南 昆明 650106；3.紅云紅河煙草(集團(tuán))有限責(zé)任公司，云南 昆明 650231)

煙草中多酚類物質(zhì)主要包含：綠原酸、蕓香苷和莨菪亭，其中綠原酸占總多酚含量的75%～90%[1]。多酚在煙草的生長發(fā)育、調(diào)制特性、煙葉色澤、煙氣香吃味和煙氣生理強(qiáng)度等方面起著重要作用，是衡量煙草品質(zhì)的一個(gè)重要因素[2]。因此，煙草中多酚類物質(zhì)含量的檢測顯得尤為重要。目前，有文獻(xiàn)[3]報(bào)道的煙草中綠原酸、蕓香苷和莨菪亭含量的測定方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、紫外可見分光光度法等，這些方法存在檢測成本高、前處理復(fù)雜、難以實(shí)現(xiàn)快速檢測等問題。

近紅外光譜法[4-5]作為一種快速、綠色、環(huán)保的光譜分析方法，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、煙草、食品、制藥和石化等各個(gè)行業(yè)。近紅外分析技術(shù)也被應(yīng)用于煙草中的多酚含量的快速測定，吳玉萍等[5]挑選244個(gè)樣品建立了煙草中總多酚含量的近紅外校正模型，外部驗(yàn)證集20個(gè)樣品的預(yù)測值與實(shí)測值之間的平均標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.10，且近紅外預(yù)測值與化學(xué)法測定值之間不存在顯著性差異。章平泉等[6]基于36份煙葉樣品的近紅外光譜，對比評(píng)價(jià)了不同光譜預(yù)處理方式和不同建模波段的建模效果。結(jié)果表明，綠原酸、新綠原酸和蕓香苷近紅外數(shù)學(xué)模型外部驗(yàn)證的平均相對誤差和變異系數(shù)(RSD)均在5%以內(nèi)。冷紅瓊等[7]采集200個(gè)樣品的近紅外光譜，使用偏最小二乘法(PLS)，選擇7500～4000 cm-1譜段，采用二階導(dǎo)數(shù)和Norris濾波法(段長5，段間距3)進(jìn)行光譜預(yù)處理，建立了煙草中綠原酸、蕓香苷、莨菪亭及總多酚的近紅外預(yù)測模型。結(jié)果表明：近紅外光譜技術(shù)與常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)檢測方法測定值在顯著水平0.05時(shí)，不存在顯著性差異。侯英等[8]采用隨機(jī)蛙跳算法對建模波長進(jìn)行了篩選。因此，近紅外光譜技術(shù)用于定量分析煙草中綠原酸、蕓香苷、莨菪亭及總多酚具有較強(qiáng)的可行性。

進(jìn)行近紅外定量分析時(shí)，波長選擇是十分必要的[9]。在增加建模樣本量的基礎(chǔ)上，本研究擬采用不同波長篩選算法：7500～4000 cm-1波長范圍[7]、隨機(jī)蛙跳算法[8](Random Frog)和間隔隨機(jī)蛙跳算法[10](Interval Random Frog)，基于模型內(nèi)部評(píng)價(jià)參數(shù)和外部驗(yàn)證結(jié)果，優(yōu)選出最佳的波長篩選算法，并用于建立煙草中綠原酸、蕓香苷、莨菪亭近紅外校正模型，以期進(jìn)一步提高近紅外校正模型的穩(wěn)定性和預(yù)測的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 儀器及材料

近紅外光譜儀：Nicolet Antaris Ⅱ型(美國Thermo Fisher 公司)；光譜采集及數(shù)據(jù)分析軟件：RSULTTM集成軟件和TQ Analyst 8.6(美國Thermo Fisher 公司)；光譜數(shù)據(jù)處理及建模軟件；MATLAB R2010a軟件；樣品旋風(fēng)磨(美國FOSS公司)。600個(gè)陳化煙樣品由云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心提供，隨機(jī)挑選500個(gè)作為校正集樣品，余下100個(gè)作為外部驗(yàn)證集樣。

1.2 方法

1.2.1 多酚含量的測定 參照標(biāo)準(zhǔn)方法[11]測定600個(gè)樣品中綠原酸、莨菪亭和蕓香苷含量，作為建立近紅外校正模型的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1.2.2 樣品前處理及近紅外光譜的采集 參照標(biāo)準(zhǔn)方法[12]對樣品進(jìn)行預(yù)處理。設(shè)置儀器參數(shù)，采集樣品近紅外光譜。

1.2.3 異常樣品的挑選及光譜數(shù)據(jù)預(yù)處理 采用TQ Analyst 8.6軟件對樣品近紅外光譜進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理方法：多元散射校正(MSC)+二階求導(dǎo)+Norris(5,3)平滑[13]；基于蒙特卡羅采樣的奇異樣本回歸診斷[14]，采用MATLAB R2010a軟件對校正集樣本中奇異樣本進(jìn)行挑選。

1.2.4 特征波長變量的篩選及變量數(shù)的確定 采用間隔隨機(jī)蛙跳算法、隨機(jī)蛙跳算法篩選建立煙草中多酚成分(綠原酸、莨菪亭和蕓香苷)近紅外校正模型的特征波長。間隔隨機(jī)蛙跳算法和隨機(jī)蛙跳(Random Frog)算法[15]參數(shù)為迭代次數(shù)N=10000；開始運(yùn)算的變量數(shù)Q=40。利用最小的交叉驗(yàn)證均方差(RMSECV)確定較優(yōu)的波長變量數(shù)[16]。

1.2.5 校正模型的建立及評(píng)價(jià) 基于間隔隨機(jī)蛙跳算法、隨機(jī)蛙跳算法篩選的特征波長和7500～4000 cm-1范圍波長，分別采用偏最小二乘法(Partial Least Squares， PLS)建立煙草中綠原酸、莨菪亭和蕓香苷的近紅外校正模型。由交互驗(yàn)證的均方差(Root Mean Square Error of Cross Validation， RMSECV)最小值決定偏最小二乘法(PLS)適宜主因子數(shù)。

校正模型的評(píng)價(jià)參數(shù)[17]：模型的決定系數(shù)(R2)；校正均方根誤差(Root Mean Square Error of Calibration， RMSEC)；交叉驗(yàn)證均方差(Root Mean Square Error of Cross Validation， RMSECV)；外部驗(yàn)證采用預(yù)測平均相對誤差參數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)，以上過程均采用MATLAB R2010a軟件完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 光譜預(yù)處理及異常樣品的挑選

在建立校正模型之前對數(shù)據(jù)進(jìn)行奇異值檢測，剔除異常樣品可以提高模型的穩(wěn)健性[18]。模群迭代奇異樣本診斷[14]是一種基于奇異樣本點(diǎn)對預(yù)測殘差和預(yù)測誤差很敏感的原理，采用預(yù)測誤差的分布為依據(jù)的診斷方法。光譜預(yù)測誤差的均值-方差分布如圖1所示(以綠原酸為例)。由圖1可知，異常樣本(outlier)個(gè)數(shù)為5個(gè)(樣品編號(hào)：9、123、124、215和270)，剔除異常樣品后剩下的樣本集樣品595個(gè)(校正集樣品：495個(gè)，驗(yàn)證集樣品：100個(gè))。采用上述方法對莨菪亭和蕓香苷的異常樣品進(jìn)行剔除，莨菪亭和蕓香苷樣品均剔除異常樣品4個(gè)，剔除異常樣品后剩下的樣本集樣品596個(gè)(校正集樣品：496個(gè)，驗(yàn)證集樣品：100個(gè))。建模集樣品中綠原酸、莨菪亭和蕓香苷含量范圍分別為6.70%～28.71%、0.08%～0.71%和4.42%～17.07%。

剔除異常樣品后，樣品原始近紅外漫反射光譜經(jīng)多元散射校正(MSC)+二階求導(dǎo)+Norris(5,3)平滑預(yù)處理后的光譜如圖2所示。由圖2b可知，經(jīng)預(yù)處理后的近紅外光譜在10000～9000 cm-1存在高頻噪聲，在進(jìn)行近紅外校正模型建立時(shí)應(yīng)將此波段排除在外，因此選擇9000～4000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行特征波長或波段的篩選。

圖1 綠原酸近紅外校正模型模群迭代奇異樣本診斷圖

圖2 代表性樣品近紅外漫反射光譜(a)和經(jīng)預(yù)處理后(b)的光譜圖

2.2 特征波長變量的篩選

隨機(jī)蛙跳算法能夠利用少量的變量迭代進(jìn)行建模，是一種非常有效的高維數(shù)據(jù)變量選擇方法。間隔隨機(jī)蛙跳算法是一種基于隨機(jī)蛙跳算法，性能更加優(yōu)越的波長變量篩選算法。兩種方法通過輸出每個(gè)變量選擇可能性，根據(jù)變量重要性進(jìn)行波長選擇。采用隨機(jī)蛙跳和間隔隨機(jī)蛙跳算法分別對煙草中綠原酸、莨菪亭和蕓香苷近紅外校正模型的特征波長點(diǎn)進(jìn)行提取，不同的波長點(diǎn)有不同的選擇概率。以莨菪亭為例，不同波長點(diǎn)被選取的概率如圖3所示。

由圖3可知，間隔隨機(jī)蛙跳波長篩選算法較隨機(jī)蛙跳算法篩選出被選擇概率大的波長點(diǎn)分布更為集中。通過模型交叉驗(yàn)證均方差(RMSECV)隨變量數(shù)增加的變化情況，在RMSECV取得最小值時(shí)確定為較優(yōu)的變量數(shù)。以綠原酸為例，RMSECV隨波長變量數(shù)增加變化的趨勢如圖4所示。隨機(jī)蛙跳算法和間隔隨機(jī)蛙跳算法選出的莨菪亭近紅外校正模型最優(yōu)變量數(shù)分別為273和147。隨機(jī)蛙跳算法和間隔隨機(jī)蛙跳算法選出的綠原酸和蕓香苷近紅外校正模型較優(yōu)的變量個(gè)數(shù)依次為：262、198和283、175。依據(jù)變量重要性分別選擇最優(yōu)建模波長數(shù)作為校正模型輸入變量。

圖3 采用蛙跳算法和間隔蛙跳算法計(jì)算出的不同波長點(diǎn)變量的選擇概率

圖4 交叉驗(yàn)證均方差(RMSECV)隨變量數(shù)的變化

2.3 校正模型的建立及評(píng)價(jià)

為評(píng)價(jià)不同波長(波長點(diǎn))變量條件下建立的煙草多酚校正模型的精度。本研究選擇7500～4000 cm-1波長變量及通過隨機(jī)蛙跳算法和間隔隨機(jī)蛙跳算法篩選出波長點(diǎn)變量，分別采用偏最小二乘法(PLS)建立煙草中多酚類化合物綠原酸、莨菪亭和蕓香苷的近紅外校正模型。

以綠原酸校正模型為示例，隨機(jī)蛙跳和間隔隨機(jī)蛙跳算法篩選波長變量建立校正模型中交互驗(yàn)證均方差(RMSECV)隨主成分?jǐn)?shù)的變化見圖5。由圖5可知，隨著主成分?jǐn)?shù)的增加，兩種算法篩選波長變量建立近紅外校正模型的RMSECV逐漸降低，取得RMSECV最小值時(shí)對應(yīng)的主成分?jǐn)?shù)為最優(yōu)的建模主成分?jǐn)?shù)。隨機(jī)蛙跳算法和間隔隨機(jī)蛙跳算法最優(yōu)的主成分?jǐn)?shù)分別為11和12。

圖5 煙草中綠原酸的近紅外校正模型交互驗(yàn)證均方差(RMSECV)隨主因子的變化

以綠原酸校正模型為例，分別采用7500～4000 cm-1光譜波長變量+PLS、Random Frog+ PLS和Interval Random Frog+PLS所建立校正模型的效果如圖6～圖8所示。莨菪亭、綠原酸和蕓香苷依照上述步驟方法建立近紅外校正模型的內(nèi)部評(píng)價(jià)參數(shù)(表1)和用100個(gè)外部驗(yàn)證集預(yù)測的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(表2)。

由圖6～圖8和表1～表2可知，在光譜預(yù)處理方式、校正集樣本、驗(yàn)證集樣本和建模參數(shù)一致的條件下，以綠原酸為例，對比3種不同波長或波長篩選算法：7500～4000 cm-1、Random Frog和Interval Random Frog，決定系數(shù)由0.9462增加至0.9721；校正集的均方估計(jì)殘差由1.1458降低到0.7741；交互驗(yàn)證均方差由1.1254降低到0.8210。100個(gè)外部驗(yàn)證集預(yù)測平均相對誤差由8.337%降低到7.025%。3種波長或波長篩選算法建立的煙草莨菪亭和蕓香苷近紅外校正模型建模效果對比與綠原酸相似。以上結(jié)果表明，采用Interval Random Frog+PLS建立的近紅外校正模型的內(nèi)部評(píng)價(jià)參數(shù)(決定系數(shù)、均方估計(jì)殘差RMSEC和交互驗(yàn)證均方差RMSECV)優(yōu)于Random Frog+ PLS方法，后者又優(yōu)于7500～4000 cm-1光譜波長變量+PLS。100個(gè)外部驗(yàn)證集樣品驗(yàn)證結(jié)果表明Interval Random Frog+PLS優(yōu)于Random Frog+ PLS方法，后者又優(yōu)于7500～4000 cm-1光譜波長變量+PLS。

圖6 煙草中綠原酸近紅外校正模型效果圖(7500～4000 cm-1+PLS)

3 結(jié)論

基于相同光譜預(yù)處理和建模方法，相同的校正集和驗(yàn)證集樣品光譜分別通過7500～4000 cm-1、隨機(jī)蛙跳算法篩選和間隔隨機(jī)蛙跳算法篩選波長點(diǎn)變量建立煙草中綠原酸、莨菪亭和蕓香苷的近紅外校正模型，并對建模效果進(jìn)行內(nèi)外部評(píng)價(jià)。結(jié)果表明采用間隔蛙跳篩選輸入變量時(shí)，模型的穩(wěn)定性和預(yù)測準(zhǔn)確性最優(yōu)。通過波長優(yōu)選進(jìn)一步提升了煙草綠原酸、莨菪亭和蕓香苷近紅外校正模型的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，為該方法的推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

圖7 煙草中綠原酸近紅外校正模型效果圖(Random Frog+PLS)

圖8 煙草中綠原酸的近紅外校正模型效果圖(Interval Random Frog+ PLS)

表1 不同建模輸入變量條件下建立的煙草中綠原酸、莨菪亭和蕓香苷近紅外預(yù)測模型評(píng)價(jià)指標(biāo)的比較

表2 不同建模輸入變量條件下建立的煙草中綠原酸、莨菪亭和蕓香苷近紅外預(yù)測模型外部驗(yàn)證評(píng)價(jià)指標(biāo)的比較