歐陽秋飛，楊建波，馬 博，陸家明，駱建宇

(百色學(xué)院，廣西 百色 533000)

芒果(MangiferaindicaL.)，別名杧果、檬果、庵羅果，系漆樹科(Anacardiaceae)芒果屬(MangiferaL.)植物的成熟果實(shí)[1]。在我國，右江河谷是4大芒果優(yōu)勢(shì)主產(chǎn)區(qū)之一，更有“中國芒果之鄉(xiāng)”的稱號(hào)。芒果采收后極不耐貯藏，易受病原菌侵染而腐爛，使得貨架期短，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。芒果蒂腐病是引起芒果采后腐爛的主要原因之一，其所致病果率可達(dá)10%～40%。已有文獻(xiàn)報(bào)道，引起海南、廣東和南寧芒果蒂腐病的病原菌主要有4種，分別是可可球二孢菌(BotryodiplodiatheobromaePat.)、多米尼加小穴殼(DothiorelladomincanPet. et Cif.)、芒果擬莖點(diǎn)霉(PhomopsismangiferaeAhmad.)及芒果褐色蒂腐病菌(Phomopsismangiferae)[2-7]。針對(duì)百色右江河谷芒果蒂腐病菌的種類和中草藥抑菌篩選未見相關(guān)報(bào)道。因此，明確右江河谷芒果蒂腐病的主要致病菌，可為采后芒果蒂腐病的正確診斷、藥劑篩選、防腐保鮮等提供理論依據(jù)，也在減少儲(chǔ)運(yùn)損失、增加經(jīng)濟(jì)效益等方面具有重要意義。

就目前而言，使用化學(xué)殺菌劑還是世界各地控制芒果采后病害的主要方式，但其對(duì)環(huán)境、生態(tài)、人體健康的不利影響，使得人們致力于尋找更為安全、友好、高效的新型果蔬防腐保鮮劑。中草藥中的抑菌活性物質(zhì)能夠破壞植物病原菌的結(jié)構(gòu)[8,9]，干擾病原菌的代謝[10,11]，從而能夠減緩或解除植物病害的發(fā)生，利用中草藥提取物制備天然防腐保鮮劑，具有可觀的應(yīng)用前景。已有文獻(xiàn)報(bào)道，丁香[1]、蓽茇[12]、高良姜[13]、黃芩[14]、崗松[15]和韭菜[16]等對(duì)多種果蔬炭疽病、枯萎病和蒂腐病等病原真菌具有較好抑制作用。本文針對(duì)右江河谷芒果蒂腐病菌，選取15種中草藥水提取液和醇提取液進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，從中獲得了有效的中草藥種類和提取劑類別，不僅進(jìn)一步擴(kuò)大了抑菌活性物質(zhì)的篩選范圍，也為有效中草藥的活性成分及結(jié)構(gòu)的確定奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為右江河谷芒果蒂腐病的防控提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用菌株是從百色市水果批發(fā)市場的發(fā)病芒果上經(jīng)分離純化后獲得；致病性測(cè)定所用芒果為百色市右江區(qū)種植的臺(tái)農(nóng)1號(hào)；大蒜、薄荷、萊菔子、白菊花、半夏、益母草、忍冬藤、羅漢果、連翹、石菖蒲、梔子、金銀花、決明子、艾葉、萆薢等中草藥購自百色市生物藥品連鎖有限公司或華潤超市；試驗(yàn)所用培養(yǎng)基為PDA；所用試劑皆為分析純。

1.2 病原菌的分離、純化

將收集到的芒果病樣在室內(nèi)進(jìn)行組織分離[17]，純化培養(yǎng)3次后，保存于4 ℃冰箱備用。

1.3 病原菌的形態(tài)觀察

將純化后的分離菌轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)皿上，培養(yǎng)2 d后觀察其菌落形態(tài)；再挑取純化菌落做成臨時(shí)玻片，在顯微鏡下觀察其菌絲和孢子形態(tài)特征。參照魏景超[18]的真菌鑒定手冊(cè)進(jìn)行鑒定。

1.4 病原菌的致病性測(cè)定

根據(jù)科赫氏法則進(jìn)行致病性的測(cè)定。首先選取健康、大小、成熟度一致的芒果，用自來水沖洗干凈，在超凈工作臺(tái)中用75%酒精擦拭芒果表面進(jìn)行消毒；用口徑為1 cm的打孔器在芒果側(cè)面打2個(gè)孔，取菌絲長勢(shì)好的培養(yǎng)皿用口徑為0.9 cm的打孔器打取菌塊接種到芒果上；以接種空白無菌的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照。將以上處理果實(shí)貯藏于光照培養(yǎng)箱中(28～30 ℃，濕度80%)，每天觀察、記錄發(fā)病情況，發(fā)病后的芒果重新分離病原菌，并與接種菌進(jìn)行對(duì)比。

1.5 病原菌分子鑒定

使用EP管液氮研磨法提取病原菌基因組DNA。采用真菌通用引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50 μL，條件為：94 ℃，3 min；94 ℃，30 s；60 ℃，20 s；72 ℃，30 s；32個(gè)循環(huán)后，72 ℃，10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將PCR產(chǎn)物送至上海生工生物股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

測(cè)序后所得序列通過Blastn進(jìn)行同源性搜索，選取與病原菌同源性高的序列，用MEGA 4.0軟件構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹，并用1000次重復(fù)的Boodstrap進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.6 中草藥提取液制備

1.6.1 水提取法 稱取20 g經(jīng)烘干、粉碎后的中草藥粉末，在200 mL蒸餾水中常溫浸泡2 h，大火煮沸，轉(zhuǎn)小火熬煮30 min，用8層紗布過濾后，轉(zhuǎn)至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上以85 ℃、65 r/min的條件旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，將提取液濃縮、定容至20 mL，最后使用滅菌的細(xì)菌過濾器進(jìn)行過濾除菌，密封后置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 醇提取法 稱取20 g經(jīng)烘干、粉碎后的中草藥粉末，加入100 mL 20%的乙醇浸泡24 h，在55 ℃的水浴鍋中用時(shí)間間隔2 s、持續(xù)1 s的超聲波信號(hào)發(fā)生器震蕩30 min；之后加入60%乙醇浸泡24 h，在55 ℃的水浴鍋中用時(shí)間間隔2 s、持續(xù)1 s的超聲波信號(hào)發(fā)生器震蕩30 min；用8層紗布過濾后，轉(zhuǎn)至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上以85 ℃、65 r/min的條件旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，將提取液濃縮、定容至20 mL；最后使用滅菌的細(xì)菌過濾器進(jìn)行過濾除菌，密封后置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 平板抑菌試驗(yàn)

采用生長速率法。用移液槍吸取3 mL的中草藥提取原液加入47 mL的PDA培養(yǎng)基中，混勻，分別倒3個(gè)平板，用口徑為5 mm的滅菌打孔器打取菌塊，再用滅菌鑷子接種到PDA平板上，每皿接一塊菌塊，每種提取物做3次重復(fù)；以加入3 mL無菌水或乙醇的培養(yǎng)基做對(duì)照。用封口膠封住皿口，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，每隔12 h觀察拍照，使用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每皿測(cè)3次，記錄數(shù)據(jù)，取平均值。抑菌率公式如下：

菌落直徑=測(cè)量菌落平均直徑-打孔器口徑

菌絲生長抑制率(%)=

1.8 最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定

按照中草藥提取物終濃度為0.01～0.12 g/mL的濃度梯度來配制PDA含藥平板，每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù)。以抑菌率100%的最低濃度為該提取物的最低抑菌濃度(MIC)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離、純化與形態(tài)觀察

通過組織分離法，從蒂部腐爛的芒果上分離得到5種不同形態(tài)的真菌菌株，根據(jù)科赫氏法則選擇菌株BSD01回接到健康芒果上，2 d后能引起芒果發(fā)病。BSD01在PDA培養(yǎng)基上菌落圓形，生長速度快，菌絲生長旺盛，絨毛狀，初為白色，后逐漸變灰直至黑色，菌落培養(yǎng)基由淡黃色轉(zhuǎn)至墨綠色，最后變?yōu)楹诤稚?。通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，BSD01分生孢子無色，單胞，卵形或橢圓形(圖1)。

根據(jù)真菌鑒定手冊(cè)及查閱芒果蒂腐菌的相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)比菌落形態(tài)、生長特點(diǎn)及孢子形態(tài)，可將BSD01初步鑒定為芒果蒂腐病菌。為了進(jìn)一步鑒定BSD01的種類，利用PCR的方法對(duì)其進(jìn)行ITS序列測(cè)定。

A. 菌落形態(tài)；B.分生孢子；C.對(duì)照接種癥狀；D.病原菌接種癥狀

2.2 病原菌ITS序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

BSD01的ITS基因經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，得到一條500 bp左右的特異性條帶(圖2)；測(cè)序后，得到一條520 bp的有效序列；將獲得的序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)菌株BSD01與可可球二孢菌(BotryodiplodiatheobromaePat.，異名Lasiodiplodiatheobromae)的序列相似性高達(dá)100%。基于ITS 序列分析結(jié)果，選取同源性高低不同的球二孢屬菌株序列，使用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(NJ)，發(fā)育樹(圖3)表明，菌株 BSD01與Lasiodiplodiatheobromae(KR260801.1)聚為一簇，具有很近的遺傳關(guān)系。因此，結(jié)合病原菌BSD01的形態(tài)特征，可將BSD01鑒定為可可球二孢菌(BotryodiplodiatheobromaePat.)。

2.3 中草藥提取液對(duì)病原菌的抑制作用

2.3.1 抑菌率的測(cè)定 采用SPSS 17.0的Duncan多重比較對(duì)各中草藥提取液的抑菌效果進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果見表1，部分提取液的抑菌效果見圖4。

圖2 BSD01 ITS基因的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果

從表1可以知道，在0.06 g/mL 的濃度下，15種中草藥除了大蒜、萆薢水提取液對(duì)芒果蒂腐可可球二孢菌沒有抑制作用外，其他提取液對(duì)其均表現(xiàn)出一定的抑菌效果；同時(shí)還能看出，中草藥醇提取液的抑菌活性總體高于水提取液。在水提取液中，萊菔子的抑菌效果最好，抑菌率可達(dá)100%，其次為連翹和艾葉，抑菌率分別為46.7%和46.6%，其余中草藥水提取液的抑菌效果則不明顯。在醇提取液中，益母草也能達(dá)到100%的抑菌效果，而石菖蒲、萊菔子、大蒜、艾葉和決明子對(duì)芒果蒂腐可可球二孢菌也有較好的抑菌活性，抑菌率分別為94.6%、73.2%、58.9%、54.5%和52.3%。

圖3 BSD01 ITS序列基因系統(tǒng)發(fā)育樹

中草藥名稱抑菌率水提取液醇提取液中草藥名稱抑菌率水提取液醇提取液半夏6.8 OP5.4 P連翹46. 7 F46.0 F薄荷18.6 KL26.8 H石菖蒲17.3 L94.6 B大蒜0 Q58.9 D梔子10.9 V14.2 M菊花17.0 L21.4 J金銀花13.6 M8.8 NO萊菔子100 A73.2 C萆薢0.0 Q21.0 JK益母草34.7 G100 A艾葉46.6 F54.5 E忍冬藤18.7 KL28.4 H決明子24.1 I52.3 E羅漢果22.7 IL27.0 H

注：以上數(shù)據(jù)在28 ℃培養(yǎng)36 h后測(cè)得；同列數(shù)字后不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

a～d分別為CK、萊菔子、連翹、艾葉水提取物；A～D分別為CK、益母草、石菖蒲、萊菔子醇提取物。

2.3.2 最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定 根據(jù)抑菌率測(cè)定的結(jié)果，篩選出對(duì)芒果蒂腐可可球二孢菌有較好抑制效果的中草藥提取液，對(duì)其進(jìn)行最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定，結(jié)果見表2。

由表2可知，芒果蒂腐可可球二孢菌對(duì)萊菔子水提取液最為敏感，在濃度為0.01 g/mL時(shí)，就已經(jīng)無菌絲生長，其最低抑菌濃度<0.01 g/mL；其次為益母草醇提取液，MIC為0.02 g/mL；連翹、艾葉水提取液及石菖蒲、決明子醇提取液的MIC相同，為0.11 g/mL；萊菔子、艾葉醇提取液的MIC同為0.09 g/mL；大蒜醇提取液的MIC為0.10 g/mL。最低抑菌濃度測(cè)定的結(jié)果與表1抑菌率測(cè)定的結(jié)果基本一致，萊菔子水提取液與益母草醇提取液對(duì)芒果蒂腐可可球二孢菌有顯著的抑制活性，有進(jìn)一步研究的潛力。

表2 有效中草藥提取液對(duì)芒果蒂腐可可球二孢菌的最低抑菌濃度(MIC)

注：“+”表示菌絲生長，“-”表示無菌絲生長。

3 討論與結(jié)論

通過致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定，將引起百色右江河谷芒果蒂腐病的BSD01確定為可可球二孢菌(BotryodiplodiatheobromaePat.)，這是針對(duì)右江河谷芒果蒂腐病菌的首次報(bào)道，其它能引起芒果蒂腐病的病原菌種類仍待后續(xù)進(jìn)一步鑒定。

王萌等[19]檢測(cè)了30個(gè)海南芒果蒂腐可可球二孢菌對(duì)10種殺菌劑的抗藥性，發(fā)現(xiàn)海南芒果蒂腐可可球二孢菌已對(duì)多菌靈、甲基硫菌靈、醚菌酯、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、苯醚甲環(huán)唑和咪鮮胺錳鹽等7種殺菌劑產(chǎn)生了抗藥性，還發(fā)現(xiàn)可可球二孢菌具有豐富的遺傳多樣性，該特性與病原菌抗藥性之間存在明顯的相關(guān)性。因此，基于中草藥天然防腐保鮮劑具有廣譜、高效、不產(chǎn)生抗性、不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，本研究利用15種中草藥提取液對(duì)芒果蒂腐可可球二孢菌進(jìn)行抑菌活性篩選，確定了9種中草藥提取液對(duì)芒果蒂腐可可球二孢菌具有較好的抑菌效果，其中萊菔子水提取液和益母草醇提取液的抑菌效果最為顯著，在濃度為0.06 g/mL的條件下，抑菌率皆為100%，萊菔子水提取液的MIC值<0.01 g/mL，益母草醇提取液的MIC值為0.02 g/mL；石菖蒲、萊菔子醇提取液對(duì)芒果蒂腐可可球二孢菌也有較好的抑菌活性，抑菌率分別為94.6%和73.2%，MIC值分別為0.11 g/mL和0.09 g/mL。

運(yùn)用不同提取方法，同種中草藥對(duì)芒果蒂腐可可球二孢菌的抑制作用有較大差異。如益母草、石菖蒲的醇提取液的抑菌效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于水提取液；大蒜、萆薢的水提取液沒有抑菌作用，而醇提取液卻有不同程度的抑菌效果；萊菔子水提取液和醇提取液皆具有較好的抑菌作用，原因可能是每種中草藥的有效抑菌活性成分不同，它們?cè)诓煌軇┲杏行龀龅牧恳膊煌?；中草藥的成分?fù)雜，不同組分的提取液，抑菌作用與機(jī)理也不盡相同[20-21]。有研究表明，從益母草種子中分離純化的抗菌小蛋白LJAMP1和LJAMP2對(duì)多種植物病原真菌具有很強(qiáng)的抑菌活性。李先碧等[22]利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將這兩種抗菌蛋白基因轉(zhuǎn)入番茄并超量表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因番茄對(duì)黃萎病、早疫病和青枯病均有顯著抗性。郭紹輝等[23]將LJAMP2蛋白基因?qū)氘叧嘟湍妇?jīng)表達(dá)、發(fā)酵、純化后，發(fā)現(xiàn)該蛋白對(duì)黑曲霉(Aspergillusniger)、玉米小斑病菌(Bipolarismaydis)、鐮刀菌(Fusariumgraminearum)等真菌表現(xiàn)出抑制活性。萊菔子的有效抗菌成分為萊菔子素，在體外有強(qiáng)烈的抗菌活性，易溶于水、甲醇、乙醇、氯仿和乙醚，在250 mg/mL濃度時(shí)，就能抑制某些病原細(xì)菌和真菌的生長。胡新文等[24]從蘿卜中提取的抗真菌蛋白(Rs-AFP 1, Rs-AFP 2)，對(duì)鐮刀菌、疫霉菌(Phytophthora)、芭蕉炭疽菌(Colletotrichummusae)和稻瘟菌(Pyriculariaoryzae)等多種真菌都有抑制作用。楊萌[25]報(bào)道了萊菔子多糖SRP對(duì)大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草桿菌(Bacillussubtilis)、青霉(Penicillium)和黑曲霉都有一定的抑制效果，且利用萊菔子多糖SRP涂膜處理蘋果和櫻桃，能起到較好的防腐保鮮效果。由此可見，益母草和萊菔子提取液具有廣譜的抗真菌活性，在抗菌藥物的開發(fā)和果蔬防腐保鮮方面值得進(jìn)一步深入研究。本研究所得提取液僅為中草藥粗提物，且只進(jìn)行了離體抑菌實(shí)驗(yàn)，因此有效提取液對(duì)芒果的活體試驗(yàn)、抑菌活性成分、抑菌作用機(jī)理、化學(xué)仿生合成等方面均有待進(jìn)一步研究和探討。