曾 明，吳美華，謝 楓，樂美旺，付江凡

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所,江西 南昌 330200；2.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所,江西 南昌 330200)

柿屬植物(Diospyrosspp.)包含近500個(gè)種[1],我國有近70個(gè)種和變種[2]。柿(DiospyroskakiL.)作為柿屬最具代表性的栽培樹種,在我國已有2000多年的栽培歷史,各地選育出了繁多的品種。據(jù)文獻(xiàn)記載,我國經(jīng)過整理統(tǒng)計(jì)的原產(chǎn)柿品種資源有1058個(gè)[3]。在地理上,依秦嶺-淮河一線可簡(jiǎn)單劃分為北方柿和南方柿兩大地理種群,但對(duì)南北柿遺傳相關(guān)性以及在品種起源進(jìn)化中地位的研究相對(duì)較少。

分子標(biāo)記因其多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性好,成為植物種質(zhì)資源鑒定和遺傳多樣性研究最常用的方法[4-6]。目前,在柿屬植物中已報(bào)道的DNA分子標(biāo)記涉及5大類13種[7],其中基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記因靈敏度高、基因覆蓋度廣和多態(tài)性豐富等特點(diǎn),尤其適用于種質(zhì)遺傳多樣性研究和資源品種鑒定[8]。

特異序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence-specific amplification polymorphism, SSAP)標(biāo)記是一種檢測(cè)逆轉(zhuǎn)座子和與其臨近的酶切位點(diǎn)之間DNA片段擴(kuò)增多態(tài)性的逆轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記,它由AFLP改進(jìn)而來,具有更高的多態(tài)性[9-11]，它已被廣泛應(yīng)用于植物種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性評(píng)價(jià)、系統(tǒng)進(jìn)化研究、遺傳連鎖分析和遺傳圖譜構(gòu)建等許多領(lǐng)域[12-14]。杜曉云等利用開發(fā)的SSAP引物,驗(yàn)證了其在柿芽變類型鑒定上具有不錯(cuò)的分辨效果[15]。

本實(shí)驗(yàn)利用SSAP分子標(biāo)記對(duì)53份柿屬樣本進(jìn)行了遺傳分析；通過UPGMA聚類,分析了供試樣本的遺傳多樣性,并在此基礎(chǔ)上探討了南方柿和北方柿兩大地理種群的關(guān)系,以期為柿品種的起源和進(jìn)化研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試柿屬材料見表1。EcoR I和Mse I內(nèi)切酶購自上海生工,引物由invitrogen公司(上海)合成。PCR反應(yīng)中所用的其它試劑購自TRANSGEN公司。

表1 供試柿屬樣本植物

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取 基因組總DNA的提取參考Luo， et al.[16]的方法。DNA質(zhì)量及濃度檢測(cè)使用微量核酸儀,A260/A280比值在1.8左右,終濃度稀釋至50 ng/μL,于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因組DNA的酶切、引物連接和PCR擴(kuò)增 基因組DNA的酶切、引物連接和PCR預(yù)擴(kuò)增和擴(kuò)增參照Du[17]的方法,用于SSAP分析的接頭及引物序列見表2。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳 6%聚丙烯酰胺變性膠經(jīng)1600 V、80 W恒功率預(yù)電泳30 min后,點(diǎn)樣擴(kuò)增終產(chǎn)物(變性)，再進(jìn)行1600 V、65 W恒功率電泳約90 min,最后銀染顯色,用數(shù)碼相機(jī)拍照記錄電泳圖譜。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 將電泳圖譜中清晰的條帶按1(有)、0(無)進(jìn)行記錄,通過NTSYS pc v2.10e軟件[18]進(jìn)行聚類分析,得到UPGMA聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 電泳圖譜

PAGE電泳圖譜顯示擴(kuò)增產(chǎn)物在100～1500 bp都有分布,清晰易辨識(shí)的條帶大多分布在300～1000 bp；圖1所示為引物L(fēng)TR2R/EA02的擴(kuò)增圖譜。

2.2 條帶的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

12對(duì)引物一共統(tǒng)計(jì)有441條清晰條帶,其中多態(tài)性條帶440條,總體多態(tài)性百分率為99.77%,見表3。

表2 用于SSAP分析的接頭及引物序列

圖1 引物L(fēng)TR2R/EA02擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜

2.3 遺傳多樣性聚類結(jié)果

全部53份柿屬樣本基于441條譜帶的UPGMA聚類圖見圖2。所有供試樣本的遺傳相似系數(shù)在0.54～0.96,在0.70處可將所有樣本劃分為兩大類群:柿種和柿屬近緣種(君遷子、美洲柿、老鴉柿、金棗柿、野生甜柿2號(hào)、油柿、浙江柿及野柿)。該聚類結(jié)果與韓振誠等[19]的研究結(jié)果相似。野柿作為柿的變種與柿種的親緣關(guān)系最近,這與張青林等[20]和鄧立寶等[21]的研究結(jié)果一致。

柿種類群在聚類圖上又可劃分出4個(gè)亞組:第①亞組主要包含羅田甜柿、四方甜柿、小果甜柿和與之親緣關(guān)系相近的湖北柿品種資源;第②亞組除去少數(shù)幾個(gè)品種外,多以北方柿(河北和陜西)為主;第③亞組則是南北柿品種混雜;第④亞組以北方柿(陜西)為主。

‘90-1-10’產(chǎn)自湖北羅田,它與柿種第①亞組的聚類關(guān)系相隔較遠(yuǎn),這與其屬于不完全甜柿類型相吻合。在完全甜柿的起源和進(jìn)化歷程(澀柿→甜柿)中,‘90-1-10’作為中間過渡類型,對(duì)中國原產(chǎn)完全甜柿的起源和進(jìn)化研究具有重要意義。

圖2 53份柿屬品種的UPGMA聚類圖

表3 條帶統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

3 討論

3.1 品種遺傳差異與地理位置的相關(guān)性

有研究表明,通過遺傳聚類顯示出的品種遺傳差異性與地理起源有一定的關(guān)系,特別是不同國家原產(chǎn)柿品種的差異性[22-24]。在本實(shí)驗(yàn)研究中,品種和地域間的相關(guān)性集中反映在柿種第①亞組,與羅田甜柿、四方甜柿、小果甜柿親緣關(guān)系相近的湖北柿品種資源相聚緊密,這也表明我國湖北大別山區(qū)域是完全甜柿的原產(chǎn)地,蘊(yùn)藏豐富的變異資源。但其他亞組都存在不同程度的地理交錯(cuò)。因此不能從該聚類圖上劃分出我國南方柿與北方柿的分界線。

3.2 親緣關(guān)系與柿砧木的親和性

君遷子是目前北方普遍采用的柿砧木(南方主要采用野柿及油柿),但在聚類圖上,君遷子與柿種的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。當(dāng)前全世界興起甜柿種植,君遷子與許多甜柿品種(尤其是富有系列)嫁接存在不親和性,嚴(yán)重影響甜柿的推廣。相關(guān)研究表明脫澀性狀或親緣關(guān)系對(duì)嫁接親和性有較大的影響[25]。小果甜柿作為完全甜柿類型,與甜柿品種的親緣關(guān)系非常近,在用作甜柿砧木的可靠性方面已有實(shí)踐和理論上的佐證[26]。

3.3 柿品種起源及進(jìn)化與人工選擇的關(guān)系

柿品種的起源和進(jìn)化與人工選擇密切相關(guān)[19],尤其是主要栽培品種明顯受到了人工選擇和商品化交流的影響。本實(shí)驗(yàn)中栽培柿品種的遺傳多樣性趨于狹窄(總體相似系數(shù)在0.75以上,多數(shù)類群內(nèi)的相似系數(shù)在0.80以上)。探討柿的起源和進(jìn)化,除栽培品種外,還應(yīng)從收集寶貴的野生資源和古樹資源方面開展研究。另外,開展胞質(zhì)遺傳因子(葉綠體、線粒體DNA)方面的研究也對(duì)柿品種起源和進(jìn)化研究具有重要意義。

3.4 柿品種資源多樣性的保護(hù)

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展已使農(nóng)作物品種資源保護(hù)上升到戰(zhàn)略高度,深入發(fā)掘和利用好品種資源是做強(qiáng)農(nóng)業(yè)的基礎(chǔ)。我國作為柿的主要原產(chǎn)地,具有豐富的原產(chǎn)柿品種,將在柿的新品種發(fā)掘和新品種改造中起到?jīng)Q定性作用。