李穎波，宗營杰，劉成洪，陸瑞菊，黃劍華，杜志釗，許建華，王亦菲*

（1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201106；2上海市農(nóng)業(yè)科技服務(wù)中心，上海200335；3光明種業(yè)有限公司，上海202171）

隨著氣候變遷和化肥的大量使用，我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中土壤鹽漬化問題越來越突出［1］。鹽脅迫顯著抑制作物生長速度，降低分蘗和分枝數(shù)量，甚至致死，最終影響作物產(chǎn)量［2］，已成為制約我國農(nóng)作物生長與產(chǎn)量的重要因素之一。以往研究表明，植物的耐鹽機(jī)制主要由滲透調(diào)節(jié)、離子平衡和抗氧化3種方式組成［2］。

受到高濃度鹽離子脅迫后，一方面，植物在細(xì)胞質(zhì)中積累多種次生代謝產(chǎn)物，如糖醇類、糖類、氨基酸及其衍生物、胺類和硫酸酯膽堿等，以增加細(xì)胞滲透能力，抵抗鹽脅迫造成的細(xì)胞內(nèi)滲透壓改變［3］；另一方面，植物通過細(xì)胞內(nèi)的離子通道、質(zhì)子泵和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等相關(guān)蛋白的作用將Na＋轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡內(nèi)隔離或外排，同時(shí)植物的抗氧化系統(tǒng)能清除鹽脅迫下產(chǎn)生的大量活性氧、自由基等強(qiáng)氧化性物質(zhì)［3］。目前研究發(fā)現(xiàn)，SOS基因家族、HKT基因家族和NHX基因家族在細(xì)胞Na＋平衡上起著關(guān)鍵作用［4-7］。但是，植物對鹽脅迫的抗性是一個(gè)復(fù)雜的生理過程，植物應(yīng)對鹽脅迫反應(yīng)中許多信號途徑仍有待闡明，研究鹽脅迫下植物細(xì)胞中的信號途徑和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，將有助于提高對鹽脅迫下信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的認(rèn)識(shí)。相對于其他禾本科作物，大麥對鹽的耐受性特別是組織耐受性較強(qiáng)，同時(shí)大麥也是遺傳學(xué)研究中廣泛應(yīng)用的模式作物之一，且在國民經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)發(fā)展中具有十分重要的地位。因此，研究大麥耐鹽機(jī)制，不僅對我國大麥耐逆育種的進(jìn)一步發(fā)展具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值，也對研究其他禾本科作物的耐鹽性具有重要的參考價(jià)值。

酵母雙雜交是利用酵母遺傳學(xué)分析蛋白質(zhì)之間相互作用的方法，已廣泛用于蛋白質(zhì)組學(xué)、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和功能基因組學(xué)等領(lǐng)域［8］。酵母雙雜交不但可以檢測已知蛋白之間的相互作用，而且可以發(fā)現(xiàn)已知蛋白的互作蛋白，并且可以發(fā)現(xiàn)蛋白的新功能。近年來，研究者已在小麥、水稻、大麥、玉米等許多重要農(nóng)作物中構(gòu)建了不同組織、器官的酵母雙雜交cDNA文庫［9-11］，為相關(guān)作物的蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)室前期獲得了與鹽脅迫相關(guān)的E3泛素連接酶基因，擬采用酵母雙雜交技術(shù)篩選其互作靶蛋白，研究其在大麥耐鹽反應(yīng)中的作用通路。

本研究以鹽脅迫下的不同大麥組織為材料，利用Gateway技術(shù)構(gòu)建鹽脅迫下的大麥酵母雙雜交cDNA文庫，以期為深入研究植物應(yīng)對鹽脅迫信號網(wǎng)絡(luò)提供更多理論支持。

1 材料與方法

1.1 植物材料和鹽脅迫處理

供試材料為‘花30’，是上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所細(xì)胞工程研究室育成的大麥品種?！?0’種子浸泡12 h露白后，挑取發(fā)芽一致的種子播于盆缽中培養(yǎng)（晝/夜溫度為22℃/20℃，相對濕度70%，晝/夜光周期為14 h/10 h）。當(dāng)幼苗處于2葉1心期時(shí)，盆缽中加入400 mg/L的NaCl溶液進(jìn)行處理。在不同的處理時(shí)間（0 h、24 h、48 h），分別剪取根、莖、葉，迅速置于液氮中冷凍，-80℃冰箱保存。

1.2 菌株和載體

大腸桿菌 DH10B、酵母菌株 Y187、文庫載體 pDONR222、pGADT7-DEST均購自 Invitrogen公司（美國）。

1.3 主要試劑

Trizol Reagent、CloneMiner cDNA Library Construction Kit、FastTrack MAG mRNA Isolation Kit、UltraPureTMPhenol∶Chloroform∶Isoamyl alcohol（體積比25∶24∶1）購自 Thermo公司（美國）；氨芐青霉素、卡那霉素購自Sigma公司（美國）；DL2000 DNA Marker、Taq DNA Polymerase購自Takara公司（日本）；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.4 大麥總RNA的提取和mRNA的分離

參照李穎波等［12］方法提取鹽脅迫后的大麥根、莖和葉的總RNA。將根、莖和葉的總RNA按照濃度1∶1∶2混合后分離mRNA。mRNA分離參照FastTrack MAGmRNA Isolation Kit說明書進(jìn)行。分離的mRNA經(jīng)質(zhì)量及純度檢測后，用于后續(xù)的文庫構(gòu)建。

1.5 酵母雙雜交初級cDNA文庫的構(gòu)建

初級cDNA文庫構(gòu)建參照 CloneMiner cDNA Library Construction Kit說明書進(jìn)行。將純化得到的mRNA進(jìn)行cDNA第1鏈、第2鏈的合成及純化，加重組接頭attB1 Adapter。將cDNA利用Gateway技術(shù)與文庫載體質(zhì)粒pDONR222混合進(jìn)行BP重組反應(yīng)；重組反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)Proteinase K處理、純化，利用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH10B；加入1 mL SOC培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)1 h，即為cDNA初級文庫菌液；加甘油至終濃度為20%（V/V），-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 酵母雙雜交次級cDNA文庫的構(gòu)建

次級cDNA文庫構(gòu)建參照CloneMiner cDNA Library Construction Kit說明書進(jìn)行。將得到的cDNA初級文庫菌液接種于含有相應(yīng)抗性的LB液體培養(yǎng)基中，30℃過夜培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，稀釋質(zhì)粒終質(zhì)量濃度至300 ng/μL。取出1μL質(zhì)粒，與文庫載體質(zhì)粒pGADT7-DEST混合進(jìn)行LR重組反應(yīng)；反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)Proteinase K處理、純化，利用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH10B。收集單克隆，加入3 mL SOC培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)1 h，即為酵母雙雜交次級cDNA文庫菌液；加甘油至終濃度為20%（V/V），-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 酵母文庫構(gòu)建

將次級cDNA文庫菌液接種于含有相應(yīng)抗性的LB液體培養(yǎng)基中，30℃過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。將5μg文庫質(zhì)粒用PEG/LiAc法轉(zhuǎn)入酵母菌株Y187中，涂布于SD/-Leu平板上。于28℃培養(yǎng)3—6 d后收集單克隆，加甘油至終濃度為50%（V/V），-80℃保存。

1.8 文庫庫容量鑒定

分別從1.5、1.6和1.7轉(zhuǎn)化后的文庫原液中取10μL（酵母文庫取100μL），稀釋1 000倍（酵母文庫菌液稀釋10 000倍），吸出50μL（酵母文庫涂100μL）涂布于含有相應(yīng)抗性的LB平板上（初級文庫使用卡那霉素抗性、次級文庫使用氨芐青霉素抗性、酵母文庫使用SD/-Leu平板），37℃培養(yǎng)12—16 h（酵母文庫28℃培養(yǎng)2—3 d）后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。文庫滴度（CFU/mL）＝克隆數(shù)×稀釋倍數(shù)/涂板體積；文庫總?cè)萘浚–FU）＝文庫滴度×文庫總體積。

1.9 文庫插入片段長度和重組率鑒定

從各級文庫LB抗性平板上隨機(jī)挑取24個(gè)單克隆進(jìn)行菌落PCR，初級文庫菌落PCR使用的引物分別是 M13Forward（5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’）和 M13Reverse（5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’），次級文庫和酵母文庫菌落PCR使用的引物分別是pDEST22Forward（5’-TCGATGATGAAGATACCCCACC-3’）和pDEST22Reverse（5’-TCGATGATGAAGATACCCCACC-3’）。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃ 30 s，56℃30 s，72℃3 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用0.8%（W/V）的瓊脂糖凝膠電泳檢測，統(tǒng)計(jì)陽性克隆重組率，并鑒定插入片段長度。

2 結(jié)果與分析

2.1 大麥總RNA提取、m RNA純化和dscDNA合成

提取NaCl溶液脅迫后的大麥品種‘花30’根、莖、葉的總RNA，用1.2%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見28S和18S條帶明亮清晰，表明該總RNA完整性好，未發(fā)生降解（圖1A）。分離純化混合后的總RNA樣品得到mRNA，電泳檢測mRNA質(zhì)量，結(jié)果顯示分離純化的mRNA在較大范圍內(nèi)呈彌散狀分布（圖1B），表明mRNA質(zhì)量良好。將mRNA反轉(zhuǎn)錄合成dscDNA，電泳顯示dscDNA呈彌散狀（圖1C），片段分布較廣。

圖1 大麥總RNA、m RNA和dscDNA電泳鑒定Fig.1 Electrophoresis of total RNA，mRNA and dscDNA of barley

2.2 初級cDNA文庫構(gòu)建和質(zhì)量鑒定

將dscDNA和pDONR222載體重組，重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，獲得初級cDNA文庫。從初級cDNA文庫中取10μL原始菌液稀釋1 000倍，取50μL涂布于LB抗性平板上，37℃培養(yǎng)12—16 h后單克隆數(shù)為1 500個(gè)。經(jīng)計(jì)算，文庫滴度為3.0×106CFU/mL，初級cDNA文庫總克隆數(shù)為1.2×107個(gè)。隨機(jī)挑取24個(gè)單克隆進(jìn)行菌落PCR，電泳結(jié)果顯示，僅1個(gè)克隆呈陰性，其余為陽性克隆，重組率為95.8%，插入片段長度多為500—2 000 bp，插入片段平均長度大于1 000 bp（圖2）。

圖2 初級文庫cDNA插入片段的PCR檢測Fig.2 PCR detection of inserted cDNA fragments in primary library

2.3 次級cDNA文庫構(gòu)建和質(zhì)量鑒定

將初級cDNA文庫搖菌提取質(zhì)粒，并稀釋至300 ng/μL。以pGADT7-DEST為目的載體，LR重組反應(yīng)后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH10B中，獲得次級cDNA文庫。從次級cDNA文庫中取10μL原始菌液稀釋1 000倍，取50μL涂布于LB抗性平板上，37℃培養(yǎng)過夜后的單克隆數(shù)為1 300個(gè)。經(jīng)計(jì)算，文庫滴度為2.6×106CFU/mL，次級cDNA文庫總克隆數(shù)為1.04×107個(gè)。隨機(jī)挑取24個(gè)單克隆進(jìn)行菌落PCR，電泳結(jié)果顯示，除1個(gè)克隆呈陰性外，其余均為陽性克隆，重組率為95.8%，插入片段多為500—2 000 bp，插入片段平均長度大于1 000 bp（圖3），具有較好的多態(tài)性。

圖3 次級文庫cDNA插入片段的PCR檢測Fig.3 PCR detection of inserted cDNA fragments in secondary library

2.4 出芽酵母雙雜交文庫的構(gòu)建和質(zhì)量鑒定

將次級cDNA文庫搖菌提取質(zhì)粒，取5μg轉(zhuǎn)入酵母菌株Y187中，涂布于SD/-Leu平板上，收集單克隆獲得酵母雙雜交文庫。從酵母文庫原始菌液中取100μL，稀釋10 000倍后涂布于SD/-Leu平板上，28℃培養(yǎng)2—3 d后單克隆數(shù)為700個(gè)。經(jīng)計(jì)算，文庫滴度為7.0×107CFU/mL。隨機(jī)挑取24個(gè)單克隆進(jìn)行菌落PCR，電泳結(jié)果顯示全部為陽性（圖4）。

圖4 酵母雙雜交文庫cDNA插入片段的PCR檢測Fig.4 PCR detection of inserted cDNA fragments in yeast two hybrid library

3 討論

高質(zhì)量酵母雙雜交文庫是進(jìn)行大規(guī)?；プ鞯鞍缀Y選，獲得陽性互作蛋白的前提［13］。本研究提取了鹽脅迫后的大麥根、莖、葉的總RNA，并將其混合后用于構(gòu)建酵母雙雜交cDNA文庫，防止了文庫中組織特異性表達(dá)基因的丟失。

評價(jià)文庫質(zhì)量有兩個(gè)重要指標(biāo)，即cDNA文庫的庫容量和重組序列的完整性［14］。本研究分離純化后得到的mRNA呈彌散狀，具有較高的純度和完整性，保證了后續(xù)文庫構(gòu)建質(zhì)量。Clarke等［15］研究表明，滿足低豐度mRNA篩選要求的最低文庫滴定濃度為1.0×106CFU/mL。本研究中初級cDNA文庫滴度為3.0×106CFU/mL，次級cDNA文庫滴度為2.6×106CFU/mL，插入片段平均長度大于1 000 bp，表明所構(gòu)建的cDNA文庫覆蓋度和和完整性良好，可滿足常規(guī)文庫篩選要求。酵母雙雜交篩選主要有共轉(zhuǎn)化和交配兩種方法，其中交配法的效率相對較高［16］。本研究在次級cDNA文庫的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了大麥酵母雙雜交文庫，可以最大程度地保證篩選到所有的與靶蛋白具有相互作用的蛋白質(zhì)分子。