陳艷梅，洪汝濤，岳彩飛

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF) 是多種致病因素長期刺激肝臟引起的代償反應(yīng)，其病理特征是肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)過度沉積，最終進(jìn)展為肝硬化、肝癌[1]。目前尚無有效治療肝纖維化的藥物。研究[2]證實(shí)，肝纖維化可以逆轉(zhuǎn)。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs) 的活化是引起肝纖維化的關(guān)鍵過程[3]。TGF-β1是最強(qiáng)的促纖維細(xì)胞因子[4]。研究[5-6]證實(shí)，阻斷PI3K/AKT信號通路，能抑制肝纖維化。褪黑素(melatonin, Mel)是胺類激素，具有抗氧化、抗炎、抗纖維化等作用[7]。課題組前期研究[8]證明褪黑素對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠具有保護(hù)作用，但具體機(jī)制尚不清楚。該研究選用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測褪黑素對TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞增殖和PI3K/AKT信號通路的影響，探究褪黑素抗肝纖維化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑和細(xì)胞TGF-β1(美國PeproTech公司)；MTT、DMSO、褪黑素(美國Sigma公司)；胎牛血清(杭州四季青生物有限公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(南京Wisent生物技術(shù)有限公司)；β-actin小鼠單克隆抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；抗PI3K兔單克隆抗體、抗P-AKT兔單克隆抗體、抗AKT兔單克隆抗體(美國CST公司)；DBA染色液、免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；青霉素/鏈霉素、胰酶消化酶、BCA試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；HSC-T6細(xì)胞(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)HSC-T6細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的高糖DMEM完全培養(yǎng)基中，細(xì)胞置于37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h換1次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)70%～80%時(shí)傳代培養(yǎng)，選用對數(shù)生長期階段的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT實(shí)驗(yàn)選用對數(shù)生長期的HSC-T6 細(xì)胞，用胰酶消化，使細(xì)胞脫落，先計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)，測出濃度，再將其稀釋成3×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，以每孔200 μl鋪板于96孔板中。為了防止干燥，邊緣各孔均加入200 μl PBS。將細(xì)胞分成5組：對照組、模型組、褪黑素低濃度組(1 nmol/L)、褪黑素中濃度組(1 μmol/L)、褪黑素高濃度組(0.1 mmol/L)，靜置5 min后把板置于培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)24 h后，吸凈培養(yǎng)基，先用PBS清洗，再換用無血清的培養(yǎng)基，除對照組外，其余各組均加入TGF-β1(10 ng/ml)，在三組不同濃度的褪黑素組加入對應(yīng)濃度的褪黑素，將板置于37 ℃培養(yǎng)箱中。藥物作用48 h后，吸凈上清液，用PBS清洗后，每孔先加入180 μl無血清的培養(yǎng)基，再加入20 μl濃度為5 mg/ml 的MTT，反應(yīng)4 h后，吸凈上清液，每孔加入150 μl DMSO，把板置于震蕩器中震蕩10 min，充分溶解孔內(nèi)的結(jié)晶，用酶標(biāo)儀測定波長490 nm處各孔的光密度(optical density，OD)。

1.4 細(xì)胞免疫組化實(shí)驗(yàn)選用對數(shù)生長期的HSC-T6細(xì)胞，用胰酶消化，使細(xì)胞脫落，先計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)，測出濃度，再將其稀釋成0.4×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，把無菌的直徑為15 mm的細(xì)胞爬片置于24孔板中，將已稀釋的細(xì)胞懸液以每孔500 μl鋪板于24孔板內(nèi)的細(xì)胞爬片上。將細(xì)胞分成5組(同前)，靜置5 min后把板置于培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)24 h后，吸凈培養(yǎng)基，先用PBS清洗，再換用無血清的培養(yǎng)基，除對照組外，其余各組均加入TGF-β1(10 ng/ml)，在三組不同濃度的褪黑素組加入對應(yīng)濃度的褪黑素，將板置于37 ℃培養(yǎng)箱中。藥物作用48 h后，吸凈上清液，用PBS洗3次，每次3 min，為了固定細(xì)胞爬片上的細(xì)胞，滴加95%乙醇反應(yīng)20 min，用PBS洗3次，每次3 min，將細(xì)胞爬片置于載玻片上，滴加0.3% Triton X-100孵育15 min，用PBS洗3次，每次3 min，滴加3%H2O2孵育10 min，用PBS洗3次，每次3 min，滴加血清孵育15 min，滴加一抗(P-AKT 1 ∶100)，置于4 ℃冰箱中過夜，次日置于37 ℃恒溫箱中復(fù)溫30 min后，用PBS洗3次，每次3 min，滴加二抗，置于37 ℃恒溫箱中孵育15 min，用PBS洗3次，每次3 min，滴加辣根酶，置于37 ℃恒溫箱中孵育15 min，用PBS洗3次，每次3 min，滴加DAB顯色液，蘇木精復(fù)染10 s后，用自來水沖洗，晾干后用中性樹膠封片。HSC-T6細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色或黃褐色為陽性顯色，將顯微鏡調(diào)至200倍，鏡下觀察細(xì)胞的染色情況，隨機(jī)拍攝6個(gè)不連續(xù)的視野，并將其保存。用Image-ProPlus 6.0軟件測定每張圖片中陽性區(qū)域的OD值，并得出每張爬片的平均OD值，最后用這個(gè)值來分析蛋白陽性表達(dá)的情況。

1.5 Western blot實(shí)驗(yàn)選用對數(shù)生長期的HSC-T6細(xì)胞，用胰酶消化后，加入培養(yǎng)基使細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，將其接種于培養(yǎng)皿內(nèi)。將細(xì)胞分成5組(同前)，把皿置于培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)24 h后，吸凈培養(yǎng)基，先用PBS清洗，再換用無血清的培養(yǎng)基，除對照組外，其余各組均加入TGF-β1(10 ng/ml)，在三組不同濃度的褪黑素組加入對應(yīng)濃度的褪黑素，將皿置于37 ℃培養(yǎng)箱中。藥物作用48 h后，提取細(xì)胞的總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，加熱使蛋白變性，配制分離膠、濃縮膠，加樣，電泳分離目的蛋白后，將目的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，麗春紅染色PVDF膜上的目的蛋白，用雙蒸水洗3次，每次5 min，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，用雙蒸水洗3次，每次5 min，滴加一抗(PI3K 1 ∶1 000，AKT 1 ∶1 000，P-AKT 1 ∶2 000，β-actin 1 ∶1 000)，置于4 ℃冰箱中的慢搖床上孵育過夜，次日置于室溫復(fù)溫30 min后，先用PBST洗3次，每次7 min，再用PBS洗1次，每次7 min，滴加二抗(1 ∶60 000)，置于搖床上室溫孵育2 h后，先用PBST洗3次，每次7 min，再用PBS洗1次，每次7 min，將顯影儀內(nèi)的溫度降至-40 ℃，滴加顯影液顯影，拍攝并保存顯影的結(jié)果。用Image-ProPlus 6.0圖像分析軟件來分析結(jié)果，以β-actin為內(nèi)參，以PI3K/β-actin的灰度比作為PI3K的相對表達(dá)量，以P-AKT/AKT的灰度比作為P-AKT的相對表達(dá)量。

1.6 定量PCR(qPCR)實(shí)驗(yàn)選用對數(shù)生長期的HSC-T6細(xì)胞，用胰酶消化后接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)。將細(xì)胞分成5組(同前)，把瓶置于培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)24 h后，吸凈培養(yǎng)基，先用PBS清洗，再換用無血清的培養(yǎng)基，除對照組外，其余各組均加入TGF-β1(10 ng/ml)，在三組不同濃度的褪黑素組加入對應(yīng)濃度的褪黑素，將瓶置于37 ℃培養(yǎng)箱中。藥物作用48 h后，提取細(xì)胞的總RNA，用紫外分光光度計(jì)測定RNA的濃度。消化殘留的DNA：加入無酶水3 μl，RQ/Rnase 10×Recation Buffer 1 μl，RQ/Rnase-Free Dnase 2 μl，RNA 4 μl，離心混勻，置于37 ℃ PCR儀上，反應(yīng)30 min，加入1 μl 終止液RQ/Dnase Stop Solution，置于70 ℃ PCR儀上，反應(yīng)10 min；逆轉(zhuǎn)錄：加入10×buffer 和10 mmol/L dNTP 各2 μl，RNase 0.5 μl，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶0.75 μl，隨機(jī)引物1 μl、無酶水2.75 μl，離心混勻，置于42 ℃PCR儀上，反應(yīng)60 min，置于95 ℃ PCR儀上，繼續(xù)反應(yīng)5 min；PCR擴(kuò)增：加入無酶水7 μl，PCR反應(yīng)Mix 10 μl，正向引物、反向引物、cDNA各1 μl，震蕩混勻，加入96孔板中擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)擴(kuò)增共40次，末次循環(huán)結(jié)束后，分析電腦上的溶解曲線(檢測引物的質(zhì)量)，并記錄CT值，選取β-actin作為內(nèi)參，選用2-ΔΔCt法來分析目的基因的表達(dá)。α-SMA引物序列如下：F:5′-GGAGATGGCGTGACTCACAA-3′，R: 5′-CGCTCAGCAGTAGTCACGAA-3′；β-actin: F: 5′-CACCCGCGATACAACCTTC-3′，R:5′-C CCATACCCACCATCACACC-3′。

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測褪黑素對TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞增殖的影響結(jié)果顯示，與對照組相比，TGF-β1能顯著誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞增殖(F=11.886，P<0.01)；與模型組相比，各濃度褪黑素組均能抑制HSC-T6細(xì)胞增殖，且褪黑素的濃度越高，抑制作用越明顯(F=11.886，P<0.01)。見表1。

表1 褪黑素對TGF-β1誘導(dǎo)的 HSC-T6細(xì)胞增殖的影響

與對照組比較：**P<0.01；與模型組比較：##P<0.01

2.2 細(xì)胞免疫組化檢測褪黑素對HSC-T6細(xì)胞中P-AKT蛋白表達(dá)的影響P-AKT蛋白主要表達(dá)于HSC-T6細(xì)胞胞質(zhì)。與對照組相比，模型組中P-AKT蛋白的表達(dá)明顯增多(F=42.019，P<0.01)；與模型組相比，各濃度褪黑素組中P-AKT蛋白的表達(dá)明顯減少(F=42.019，P<0.01)，且褪黑素的濃度越高，P-AKT蛋白表達(dá)減少越明顯。見圖1。

2.3 Western blot檢測褪黑素對HSC-T6細(xì)胞中PI3K和P-AKT蛋白表達(dá)的影響與對照組相比，模型組中PI3K和P-AKT蛋白的表達(dá)明顯增多(F=9.466、F=63.672，P<0.01)；與模型組相比，各濃度褪黑素組中PI3K和P-AKT蛋白的表達(dá)均明顯減少(F=9.466、F=63.672，P<0.01或P<0.05)，且褪黑素的濃度越高，PI3K和P-AKT蛋白表達(dá)減少越明顯。見圖2、3。

2.4 qPCR檢測褪黑素對HSC-T6細(xì)胞中α-SMA mRNA表達(dá)的影響與對照組相比，模型組中α-SMA mRNA的表達(dá)明顯增多(F=70.672，P<0.01)；與模型組相比，各濃度褪黑素組中α-SMA mRNA的表達(dá)均明顯減少(F=70.672，P<0.01)，且褪黑素的濃度越高，α-SMA mRNA表達(dá)減少越明顯。見圖4。

圖1 褪黑素對HSC-T6細(xì)胞中P-AKT蛋白表達(dá)的影響 ICC×200

A：對照組；B：模型組；C：褪黑素低濃度組；D：褪黑素中濃度組；E：褪黑素高濃度組；與對照組比較：**P<0.01；與模型組比較：##P<0.01

圖2 褪黑素對HSC-T6細(xì)胞中PI3K蛋白表達(dá)的影響

A：對照組；B：模型組；C：褪黑素低濃度組；D：褪黑素中濃度組；E：褪黑素高濃度組；與對照組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

3 討論

肝纖維化是一種復(fù)雜的肝細(xì)胞修復(fù)反應(yīng)，各種致病因素(如病毒、藥物和酒精等)長期持續(xù)損害肝臟，引起HSCs活化，分泌大量ECM并過度沉積，破壞肝臟結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致肝纖維化[3]。若不有效治療，肝纖維化最終將進(jìn)展為肝硬化、肝癌。有研究[2]表明，肝纖維化是可以逆轉(zhuǎn)的。因此，研發(fā)安全有效的抗肝纖維化藥物有重要的臨床意義。

圖3 褪黑素對HSC-T6細(xì)胞中P-AKT蛋白表達(dá)的影響

A：對照組；B：模型組；C：褪黑素低濃度組；D：褪黑素中濃度組；E：褪黑素高濃度組；與對照組比較：**P<0.01；與模型組比較：##P<0.01

圖4 褪黑素對HSC-T6細(xì)胞中α-SMA mRNA表達(dá)的影響

A：對照組；B：模型組；C：褪黑素低濃度組；D：褪黑素中濃度組；E：褪黑素高濃度組；與對照組比較：**P<0.01；與模型組比較：##P<0.01

褪黑素是松果體分泌的胺類激素，具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗炎、抗纖維化等功能。Lebda et al[9]研究表明，褪黑素能增強(qiáng)抗氧化活性，減少促炎細(xì)胞因子和纖維化基因表達(dá)，減少HSCs增殖，從而抗肝纖維化。Kang et al[10]研究表明，褪黑素能增強(qiáng)線粒體自噬和線粒體生物合成，從而抗肝纖維化。本課題組前期研究[8]表明，褪黑素具有抗肝纖維化作用，但具體機(jī)制尚不明確。

HSCs是一種間質(zhì)細(xì)胞，位于肝臟Disse間隙。在正常情況下，HSCs處于靜止?fàn)顟B(tài)，其主要功能是儲存和代謝VitA，合成和分泌少量的ECM。當(dāng)各種致病因素引起肝臟損傷時(shí)，在TGF-β和血小板衍生生長因子(PDGF)等多種細(xì)胞因子作用下，HSCs 活化，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，表達(dá)大量的α-SMA，合成過多的膠原蛋白，使ECM在肝臟過度沉積，從而導(dǎo)致肝纖維化[11]。α-SMA是 HSCs活化的標(biāo)志。因此，抑制HSCs活化與增殖成為抗肝纖維化的重要靶點(diǎn)。MTT結(jié)果顯示，TGF-β1能顯著誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞增殖，而高濃度褪黑素能顯著抑制HSC-T6細(xì)胞增殖；qPCR結(jié)果顯示，TGF-β1能增強(qiáng)HSC-T6細(xì)胞中α-SMA mRNA的表達(dá)，而褪黑素能明顯抑制α-SMA mRNA的表達(dá)。推測褪黑素可能通過抑制HSC-T6細(xì)胞增殖，抑制ECM合成，從而抗肝纖維化。

PI3K/AKT信號通路在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中起重要的作用[12]。PI3K是磷脂酰肌醇-3-激酶，由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110組成，具有絲氨酸 /蘇氨酸蛋白激酶和磷脂酰肌醇激酶的雙重活性。AKT是一種絲氨酸 /蘇氨酸蛋白激酶。當(dāng)細(xì)胞外的配體與相應(yīng)的受體結(jié)合后，激活PI3K，改變p85和p110復(fù)合體的構(gòu)象，使磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(簡稱PIP2)生成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(簡稱PIP3)。PIP3與AKT結(jié)合后，使AKT從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到胞膜。PDK1磷酸化AKT的Thr308位點(diǎn)，PDK2磷酸化AKT的Ser473位點(diǎn)，從而活化AKT[13]。有研究[12]證實(shí)，積雪草酸通過抑制PI3K/AKT信號通路，抑制HSCs活化和ECM合成，從而抗肝纖維化。細(xì)胞免疫組化和Western blot結(jié)果顯示，TGF-β1能明顯增強(qiáng)HSC-T6細(xì)胞中PI3K和P-AKT蛋白的表達(dá)，而褪黑素能明顯抑制PI3K和P-AKT蛋白的表達(dá)。推測褪黑素可能通過抑制PI3K/AKT信號通路，從而抑制HSC-T6細(xì)胞增殖。

綜上，褪黑素能抑制HSC-T6細(xì)胞活化與增殖，抑制ECM合成，可能與抑制PI3K/AKT信號通路有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)僅為初步研究，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。