汪自然，常文嬌，戴媛媛，馬筱玲

金黃色葡萄球菌LukS-PV和LukF-PV共同組成殺白細(xì)胞素(Panton-Valentine leukocidin,PVL)，二者在分葉核中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear neutrophils,PMNs)上形成聚合體，通過(guò)膜穿孔機(jī)制引發(fā)細(xì)胞裂解和凋亡[1-2]。前期研究[3-6]表明，LukS-PV單組分對(duì)于白血病細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡和分化的雙重作用，因而LukS-PV有望成為一種新的白血病治療藥物，具有深入研究的價(jià)值。綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)是由Shimomura et al[7]于1962年從多管水母中純化得到的能夠自發(fā)出綠色熒光的蛋白，GFP作為一種理想的標(biāo)簽蛋白，能夠用于蛋白功能定位研究。該研究通過(guò)構(gòu)建LukS-PV基因與GFP基因融合表達(dá)載體，并進(jìn)行表達(dá)純化及鑒定，為進(jìn)一步研究LukS-PV的功能定位和相互作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1質(zhì)粒與菌株 pet28a-N6H-GFP質(zhì)粒由中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)臧建業(yè)教授惠贈(zèng)；大腸桿菌DH5α、BL21、金黃色葡萄球菌銅23均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2主要試劑 T載體pMD-18T、DNA Taq酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ，DNA Ligation Kit購(gòu)于日本takara公司；DNA膠回收試劑盒和快速質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)于北京天根公司；蛋白純化試劑盒購(gòu)于美國(guó)Novagen公司；BCA試劑盒購(gòu)于上海碧云天公司；抗His單克隆抗體和抗GFP單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)CST公司；羊抗兔IgG抗體購(gòu)于武漢abclonal公司。

1.2 方法

1.2.1LukS-PV的基因擴(kuò)增與基因克隆 煮沸法提取金黃色葡萄球菌銅23的DNA作為PCR模板，具體提取方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[8]。根據(jù)LukS-PV序列設(shè)計(jì)引物，送安徽通用生物技術(shù)公司合成。上游5′ -ACGGGATCCGAATCTAAAGCTGATAACAATATTGA G-3′,下游5′-ACCCTCGAGTCAATTATGTCCTTTCAC TTTAATTTC-3′(上下游引物分別引入限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I酶切位點(diǎn))。PCR具體的反應(yīng)條件為：預(yù)變性94 ℃、 5 min，變性94 ℃、30 s，退火51 ℃、30 s，延伸72 ℃、45 s，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸8 min。PCR回收產(chǎn)物4 μl、pMD-18T載體1 μl、solutionI 5 μl于4 ℃過(guò)夜連接。次日將連接產(chǎn)物使用熱激法(42 ℃、90 s)轉(zhuǎn)化入DH5α菌中，使用氨芐青霉素篩選單克隆，置于37 ℃溫箱培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單個(gè)菌落，搖菌提質(zhì)粒，雙酶切后送安徽通用生物技術(shù)公司測(cè)序。

1.2.2LukS-PV-GFP重組融合質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 測(cè)序鑒定正確后，使用限制性核酸內(nèi)切酶BamH I、Xho I同時(shí)對(duì)pMD-18T-LukS-PV和pet28a-N6H-GFP質(zhì)粒37 ℃、2 h進(jìn)行雙酶切。分別回收pMD-18T-LukS-PV的目的片段和表達(dá)載體pet28a-N6H-GFP的載體片段，測(cè)定DNA濃度后按目的片段和載體片段5:1于4 ℃連接過(guò)夜，次日將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)DH5α菌中，均勻涂布于卡那霉素LB 平板上，置于37 ℃溫箱過(guò)夜，挑取單個(gè)菌落，搖菌提質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定和DNA測(cè)序。最后將鑒定無(wú)誤的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3重組融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化 取保存的菌液涂布于卡那平板活化后，挑取單菌落加入LB培養(yǎng)基中，按1 ∶1 000加入卡那霉素，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后轉(zhuǎn)至100 ml的LB培養(yǎng)基至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即A600約為0.6～0.8時(shí)，留取一管菌液作誘導(dǎo)前對(duì)照，加入IPTG使終濃度達(dá)到1 mmol/L，誘導(dǎo)條件為37 ℃、200 r/min，分別在1、2、3、4、5、6 h取樣，使用10%SDS-PAGE電泳分析各時(shí)間點(diǎn)的重組融合蛋白表達(dá)量。誘導(dǎo)5 h后離心收集細(xì)菌，棄去培養(yǎng)基，20 ml PBS重懸細(xì)菌沉淀后將重懸菌液超聲破碎，離心后上清液使用His樹(shù)脂蛋白純化試劑盒，純化蛋白并測(cè)定蛋白濃度。分別取誘導(dǎo)前細(xì)菌、誘導(dǎo)5 h細(xì)菌、誘導(dǎo)6 h細(xì)菌、誘導(dǎo)5 h細(xì)菌超聲破碎離心后的上清液、誘導(dǎo)5 h細(xì)菌超聲破碎離心后的沉淀、純化后的LukS-PV-GFP蛋白加入上樣緩沖液100 ℃、10 min變性后使用12% SDS-PAGE電泳分析表達(dá)量。

1.2.4重組融合蛋白表達(dá)宿主的熒光檢測(cè) 含有LukS-PV-GFP重組質(zhì)粒的BL21菌活化后，分別取誘導(dǎo)前和IPTG誘導(dǎo)5 h菌液，取樣涂片，將玻片置于熒光顯微鏡下觀察是否能夠自發(fā)熒光。

1.2.5重組融合蛋白的Western blot檢測(cè) 分別取誘導(dǎo)前、純化后蛋白樣品，加入上樣緩沖液后100 ℃、10 min變性，使用10%的SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)至NC膜，轉(zhuǎn)膜條件為200 mA、90 min。NC膜經(jīng)5%脫脂牛奶封閉2 h后，分別與His單克隆抗體(一抗，1 ∶1 000)、GFP單克隆抗體(一抗，1 ∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜。次日洗去一抗，加入羊抗兔IgG抗體(二抗)孵育2 h，洗去二抗，加入顯色劑后顯色。

2 結(jié)果

2.1 LukS-PV的基因擴(kuò)增與鑒定分析PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，大約在867 bp處有一條較為明亮的條帶，與預(yù)計(jì)相符(圖1A)。重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)BamHⅠ與XhoⅠ雙酶切后顯示出目的基因片段約867 bp(圖1B)。酶切產(chǎn)物經(jīng)正反向DNA測(cè)序分析，所得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中序列完全一致。見(jiàn)圖2、3。

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)分別取誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)1、2、3、4、5、6 h 的蛋白做SDS-PAGE電泳(圖4A)，結(jié)果顯示誘導(dǎo)前無(wú)重組融合蛋白表達(dá)，經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)后在63 ku左右出現(xiàn)明顯的蛋白條帶，大小與預(yù)測(cè)相符，且5 h時(shí)重組融合蛋白表達(dá)量最高，可以用于后續(xù)蛋白純化。誘導(dǎo)前細(xì)菌、誘導(dǎo)5 h細(xì)菌、誘導(dǎo)6 h細(xì)胞、誘導(dǎo)5 h細(xì)菌超聲破碎離心后的上清液、誘導(dǎo)5 h細(xì)菌超聲破碎離心后的沉淀、純化后的LukS-PV-GFP蛋白經(jīng)12%的SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)顯示(圖4B)，超聲破碎后，上清中可見(jiàn)明顯表達(dá)條帶，表明其為可溶性表達(dá)。純化后蛋白條帶濃厚，雜帶較少，BCA法測(cè)定純化后蛋白產(chǎn)物濃度為1.2 mg/ml。

圖1 LukS-PV的PCR擴(kuò)增與重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定電泳

A： LukS-PV的PCR擴(kuò)增圖；B: 重組質(zhì)粒BamH Ⅰ、Xho Ⅰ雙酶切電泳圖；M: DNA Marker；1、2: PCR產(chǎn)物；3: 雙酶切產(chǎn)物

2.3 重組質(zhì)粒LukS-PV-GFP在大腸桿菌BL21中的表達(dá)與檢測(cè)含有LukS-PV-GFP質(zhì)粒的BL21菌，IPTG誘導(dǎo)前無(wú)綠色熒光。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)5 h后，取菌液涂片，可以在熒光顯微鏡下觀察到明顯散發(fā)綠光的單個(gè)細(xì)菌(圖5)。取1.5 ml菌液離心，可見(jiàn)綠色菌體沉淀，且純化后的蛋白溶液也為綠色。

圖2 雙酶切產(chǎn)物部分測(cè)序圖

圖3 測(cè)序結(jié)果與Gene Bank中LukS-PV基因序列比對(duì)

圖4 LukS-PV-GFP表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析

A：LukS-PV-GFP-BL21誘導(dǎo)不同時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)物SDS-PAGE分析圖；B： LukS-PV-GFP-BL21純化產(chǎn)物SDS-PAGE分析圖；M：蛋白Marker；1：誘導(dǎo)前；2：誘導(dǎo)1 h；3：誘導(dǎo)2 h；4：誘導(dǎo)3 h；5：誘導(dǎo)4 h；6：誘導(dǎo)5 h；7：誘導(dǎo)6 h；8：超聲破碎后上清液；9：超聲破碎后沉淀；10：純化后的LukS-PV-GFP蛋白

圖5 重組質(zhì)粒在BL21大腸桿菌熒光顯微鏡下圖像 ×100A：誘導(dǎo)前；B：誘導(dǎo)5 h后

2.4 重組融合蛋白的Western blot鑒定Western blot檢測(cè)顯示，未加入IPTG誘導(dǎo)時(shí)無(wú)相應(yīng)的條帶，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后純化的重組融合蛋白分別使用抗His單克隆抗體(圖6A)和抗GFP單克隆抗體(圖6B)鑒定，在約63 ku左右位置均出現(xiàn)明顯條帶，與預(yù)期相符，表明重組融合蛋白表達(dá)成功。

3 討論

LukS-PV是金黃色葡萄球菌分泌的PVL中的一個(gè)亞單位,課題組前期實(shí)驗(yàn)表明，LukS-PV可誘導(dǎo)人髓系白血病細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞凋亡，具有抗腫瘤作用，具有深入研究的價(jià)值。GFP無(wú)需底物、輔助因子的參與即可自發(fā)出綠色熒光，易于觀察，且表達(dá)的熒光蛋白不會(huì)對(duì)宿主本身產(chǎn)生毒性[9]。因此，GFP已成為生物化學(xué)分子生物學(xué)領(lǐng)域的重要標(biāo)記分子。

圖6 純化重組融合蛋白的Western blot鑒定

A：使用抗His單克隆抗體鑒定；B：使用抗GFP單克隆抗體鑒定；M：蛋白Marker；1：誘導(dǎo)前；2：純化后重組融合蛋白

大腸桿菌系統(tǒng)對(duì)許多蛋白耐受能力較強(qiáng)，能高效穩(wěn)定表達(dá)出目的蛋白，已廣泛應(yīng)用于外源蛋白的表達(dá)及純化[10]。外源蛋白在大腸桿菌中表達(dá)分為主要存在于上清液中的可溶性表達(dá)和主要存在于沉淀中的包涵體表達(dá)。高玉錄 等[11]將LukS-PV基因克隆到Rosetta(DE3) plys宿主菌中，SDS-PAGE電泳顯示重組蛋白主要存在于包涵體內(nèi)，上清液表達(dá)較少。常文嬌 等[12]通過(guò)去除LukS-PV基因的引導(dǎo)肽，降低了引導(dǎo)肽對(duì)蛋白表達(dá)的影響，促進(jìn)了LukS-PV的可溶性表達(dá)。本研究以此為基礎(chǔ)，構(gòu)建了LukS-PV與GFP的重組融合蛋白，電泳顯示重組融合蛋白主要存在于上清液中，無(wú)需進(jìn)行變復(fù)性處理，對(duì)蛋白的生物學(xué)活性影響較小。含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21誘導(dǎo)前無(wú)熒光，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后可以在熒光顯微鏡下自發(fā)出綠色熒光，純化后蛋白濃度和純度均較高，表明了融合蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)中得到了高效穩(wěn)定的表達(dá)。

使用GFP作為分子標(biāo)簽是目前研究蛋白質(zhì)亞定位、動(dòng)態(tài)變化和表達(dá)量改變的有效方法[13]。GFP與目的蛋白融合形成熒光標(biāo)記分子，可以研究目標(biāo)蛋白的動(dòng)態(tài)變化和與其他蛋白相互作用。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建LukS-PV基因與GFP基因融合表達(dá)載體后導(dǎo)入大腸桿菌中表達(dá)并進(jìn)行純化，實(shí)現(xiàn)了對(duì)LukS-PV精確定位和動(dòng)態(tài)觀察，為進(jìn)一步研究LukS-PV的功能定位和相互作用奠定了基礎(chǔ)。