李濟民，楊 芳，袁偉奇，王 昊，羅以勤

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是臨床常見的一種消化道惡性腫瘤，在全球其致死率位居惡性腫瘤第二位[1]。目前，奧沙利鉑(oxaliplatin)作為治療結(jié)直腸癌患者的一線用藥，可以明顯改善晚期或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者總生存期。然而，在治療過程中，患者對奧沙利鉑的獲得性耐藥日益嚴(yán)重成為腫瘤治療失敗的主要原因[2]。因此，研究其耐藥機制已成為治療結(jié)直腸癌耐藥的關(guān)鍵因素。該研究通過體外誘導(dǎo)建立奧沙利鉑耐藥細胞模型，并利用串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽法(tandem mass tag, TMT)分析結(jié)直腸癌細胞耐藥前后蛋白表達差異。本實驗選取出表達差異顯著的短鏈脫氫還原酶超家族2 (dehydrogenase/reductase SDR family member 2, DHRS2)蛋白作為后續(xù)研究對象，利用小干擾RNA(siRNA)技術(shù)下調(diào)DHRS2的表達，研究其對結(jié)直腸癌耐藥細胞的耐藥性的影響，以期探索克服腫瘤細胞耐藥的有效途徑。

1 材料與方法

1.1 主要材料人結(jié)腸癌細胞HCT116細胞株購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院；奧沙利鉑耐藥株HCT116/OXA(用奧沙利鉑誘導(dǎo)產(chǎn)生)由本實驗室自建；CCK-8試劑購自日本同仁公司；奧沙利鉑購自美國Sigma公司；蛋白裂解液IP、5×蛋白上樣緩沖液和BCA試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；切除修復(fù)交叉互補基因1(excision repair cross-complementation group 1,ERCC1)、DHRS2、P53和β-actin抗體均購于武漢Proteintech公司；辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的抗兔及抗鼠IgG購于美國Jackson ImmunoResearch公司；ECL化學(xué)發(fā)光底物購自美國Thermo公司；DHRS2和P53基因干擾序列均由上海吉瑪公司設(shè)計合成。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) HCT116和HCT116/OXA細胞用RPMI-1640培養(yǎng)基(含雙抗)、10%胎牛血清，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2CCK-8法檢測細胞存活率 取對數(shù)生長期的HCT116和HCT116/OXA細胞，消化后以1×104/ml密度接種于96孔培養(yǎng)板，過夜貼壁后用連續(xù)濃度奧沙利鉑處理。培養(yǎng)48 h后, 每孔加入10 μl CCK-8試劑,37 ℃，孵育1 h后，利用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度值。每組設(shè)6個復(fù)孔，陰性對照組(NC組)加入等量的培養(yǎng)基，同時設(shè)置不含細胞和培養(yǎng)基的空白孔。據(jù)此計算細胞生存率。

1.2.3細胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期細胞，消化后接種培養(yǎng)于6孔板中,待細胞匯合至60%～70%進行轉(zhuǎn)染。將siRNA溶解于Opti-MEM培養(yǎng)基中, 同時另取Lipofectamine 2000加入Opti-MEM培養(yǎng)基中, 室溫孵育5 min, 然后將兩者輕輕混合, 室溫靜置20 min。期間將6孔板細胞培養(yǎng)基更換為不含胎牛血清培養(yǎng)基，并將上述轉(zhuǎn)染混合物加入各組細胞, 置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4～6 h后，將培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，提取細胞蛋白測定轉(zhuǎn)染效率并進行后續(xù)實驗分析。

1.2.4蛋白提取和蛋白質(zhì)印跡檢測 用預(yù)冷PBS清洗細胞3遍，每孔加入80 μl左右蛋白裂解液，冰上裂解15 min后，用細胞刮將細胞從6孔板底部刮離，使細胞和裂解液充分混勻。在裂解15 min后，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，收集上清液，即為總蛋白溶液，用BCA法測定其蛋白濃度。等質(zhì)量蛋白樣品經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分離后，經(jīng)300 mA、90 min濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h， 分別加入以1 ∶1 000稀釋的DHRS2、ERCC1、P53和β-actin抗體孵育過夜。經(jīng)TBST洗滌后，加入HRP標(biāo)記的特異性的羊抗兔或羊抗鼠的二抗以1 ∶5 000室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，最后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影。

1.2.5TMT定量蛋白組學(xué) 由杭州景杰生物科技有限公司完成。

1.2.5.1 TMT標(biāo)記及HPLC分級 將培養(yǎng)的HCT116和HCT116/OXA細胞進行收集，后加入蛋白裂解液后進行超聲裂解。4 ℃、12 000 r/min離心20 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管。利用BCA法進行蛋白濃度測定。胰酶酶解的肽段用Strata X C18(Phenomenex)除鹽后真空冷凍干燥。用0.5 mol/L TEAB溶解肽段，然后根據(jù)TMT試劑盒說明標(biāo)記肽段。肽段用高pH反向HPLC分級，色譜柱為Agilent 300Extend C18。

1.2.5.2 質(zhì)譜分析 肽段經(jīng)由超高效液相系統(tǒng)分離后被注入NSI離子源中進行電離然后進Q ExactiveTM質(zhì)譜進行分析。離子源電壓設(shè)置為2.1 kV，肽段母離子及其二級碎片都使用高分辨的Orbitrap進行檢測和分析。二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用Maxquant (v1.5.2.8)進行檢索。

1.2.5.3 生物信息學(xué)分析 將蛋白質(zhì)組學(xué)的數(shù)據(jù)進行分析處理后，以1.5倍為變化閾值 (Fold change≥1.5或≤0.67) ，P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 HCT116/OXA耐藥細胞模型驗證CCK-8檢測結(jié)果顯示，HCT116和HCT116/OXA細胞在不同濃度奧沙利鉑處理48 h后，根據(jù)公式計算得出HCT116和HCT116/OXA細胞的IC50分別為(21±1.1)μg/ml和(59±0.98)μg/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=44.68，P<0.01),見圖1A。Western blot結(jié)果表明，鉑類耐藥相關(guān)蛋白ERCC1在HCT116/OXA細胞中顯著升高(圖1B)。

圖1 HCT116/OXA耐藥細胞模型驗證

A：HCT116和HCT116/OXA對奧沙利鉑敏感性；與HCT116比較：*P<0.05,**P<0.01；B：Western blot檢測ERCC1在HCT116和HCT116/OXA中表達

2.2 蛋白質(zhì)譜結(jié)果表明DHRS2在HCT116/OXA顯著升高本實驗共鑒定了5 345個蛋白質(zhì)，其中4 599個蛋白質(zhì)包含定量信息。本實驗以變化閾值為1.5，P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)對鑒定出的蛋白進行了篩選，其中有64種蛋白在HCT116/OXA細胞中上調(diào)，其中紅色代表高表達，綠色代表低表達(圖2)。實驗結(jié)果表明DHRS2蛋白在耐藥細胞株HCT116/OXA顯著上升，提示其可能參與調(diào)節(jié)耐藥細胞株HCT116/OXA對奧沙利鉑的敏感性。

2.3 Western blot 驗證DHRS2蛋白上調(diào)為進一步驗證DHRS2蛋白在HCT116與HCT116/OXA細胞表達情況，實驗采用Western blot方法，結(jié)果表明DHRS2蛋白在HCT116/OXA細胞較HCT116細胞顯著升高(t=30.48，P<0.001)，見圖3。

2.4 干擾DHRS2表達后HCT116/OXA細胞對奧沙利鉑耐藥性下降為了進一步證明DHRS2的表達與結(jié)直腸癌奧沙利鉑耐藥之間的相互關(guān)系，本實驗在耐藥細胞HCT116/OXA轉(zhuǎn)染特異性siRNA，并檢測其對奧沙利鉑耐藥性變化。2條siRNA轉(zhuǎn)染HCT116/OXA后，使DHRS2表達水平分別下調(diào)至NC組(0.35±0.05)和(0.32±0.08)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=149.3,P<0.05)，見圖4A。同時，CCK-8結(jié)果表明,HCT116/OXA在干擾DHRS2表達后可顯著提高細胞對奧沙利鉑的敏感性，差異有統(tǒng)計學(xué)意見(P<0.01)，見圖4B。

圖2 HCT116/OXA細胞上調(diào)差異表達蛋白的熱圖

圖3 Western blot 驗證DHRS2在HCT116/OXA細胞表達上調(diào)A:HCT116;B:HCT116/OXA；與HCT116比較：***P<0.001

2.5 沉默DHRS2增加HCT116/OXA奧沙利鉑治療敏感性的機制Western blot結(jié)果表明，在HCT116/OXA細胞中干擾DHRS2后，P53和ERCC1表達下調(diào)(圖5A)。進一步研究顯示,在HCT116/OXA細胞中干擾P53后，ERCC1表達顯著下調(diào)(圖5B)。綜上，實驗結(jié)果表明了沉默DHRS2可通過P53依賴的方式下調(diào)ERCC1表達，從而增加HCT116/OXA細胞對奧沙利鉑的敏感性。

3 討論

結(jié)直腸癌發(fā)病率高，因早期診斷率低，患者在就診時大都處于中晚期，從而導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者5年生存率僅有10%左右[1]?；熕幬锬退幍某霈F(xiàn)是結(jié)直腸癌高死亡率的一個重要原因,了解導(dǎo)致個體化療藥物耐藥的機制有助于確定新的藥物靶點和藥物研發(fā),從而改善癌癥治療。奧沙利鉑作為第三代鉑類化療藥，主要是通過形成鉑-DNA復(fù)合物，破壞DNA正常結(jié)構(gòu)從而抑制DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[3]。研究認為DNA損傷主要是通過核苷酸切除修復(fù)途徑(nucleotide excision repair，NER)修復(fù)，ERCC1作為核苷酸切除修復(fù)途徑中的關(guān)鍵基因，在奧沙利鉑耐藥過程中起到了非常重要的作用[4]。

圖4 干擾DHRS2對耐藥株細胞HCT116/OXA化療敏感性的影響

A：DHRS2- siRNA轉(zhuǎn)染HCT116/OXA后DHRS2的表達；1：si-NC；2：si-DHRS2-1；3：si-DHRS2-2；B：干擾DHRS2的表達可提高耐藥細胞HCT116/OXA對奧沙利鉑的敏感性；與si-NC比較：*P<0.05，**P<0.01

圖5 沉默DHRS2通過P53依賴方式抑制ERCC1表達

A：Western blot檢測干擾DHRS2后P53、ERCC1表達變化；B：Western blot檢測干擾P53后，ERCC1表達情況；1：si-NC； 2：si-DHRS2-1； 3：si-DHRS2-2；4：si-NC；5：si-p53-1；6：si-p53-2

DHRS2蛋白屬于短鏈脫氫還原酶超家族(superfamily of short-chain dehydrogenases/reductases，SDR)，其基因位于人類染色體 14q11 上，編碼一種NAD/NADP依賴的氧化還原酶[5]。最近多項研究表明DHRS2參與多種腫瘤進程。例如，DHRS2在食管鱗癌中高表達，沉默DHRS2后促進食管鱗癌細胞凋亡以及抑制其遷移侵襲能力[6]。此外，在急性髓細胞白血病和胃癌中DHRS2的表達與耐藥相關(guān)[7-8]。然而，DHRS2蛋白是否參與結(jié)直腸癌細胞耐藥尚未見文獻報道。該研究利用TMT定量蛋白組學(xué)技術(shù)篩選結(jié)直腸癌耐藥細胞株HCT116/OXA與其親本HCT116蛋白表達差異，結(jié)果顯示DHRS2在耐藥株HCT116/OXA顯著上調(diào)，提示DHRS2可能參與HCT116/OXA對奧沙利鉑的耐藥。CCK-8結(jié)果表明，沉默DHRS2可增加耐藥株HCT116/OXA細胞對奧沙利鉑敏感性。

DHRS2通過和MDM2結(jié)合降低了MDM2介導(dǎo)的P53降解，從而穩(wěn)定并活化P53[9]。P53作為一個轉(zhuǎn)錄因子，在被激活后可影響下游一系列基因表達變化。研究[10]顯示, 細胞在暴露于DNA損傷的藥物后，p53會表達上調(diào), 表明它可能參與促進DNA修復(fù)。并有文獻[11]報道P53可通過與ERCC1啟動子結(jié)合，增強其表達從而抑制順鉑引起的DNA損傷。因此，本課題組推測沉默DHRS2是否是通過下調(diào)HCT116/OXA細胞內(nèi)P53表達進而影響ERCC1的表達，從而提高耐藥株HCT116/OXA對奧沙利鉑的敏感性。為此，該實驗檢測了在HCT116/OXA細胞內(nèi)干擾DHRS2后P53和ERCC1的表達。結(jié)果顯示，干擾DHRS2后，HCT116/OXA細胞內(nèi)P53和ERCC1內(nèi)蛋白表達水平明顯下調(diào)。且干擾P53后，ERCC1蛋白水平下調(diào)。上述結(jié)果表明，沉默DHRS2可通過P53下調(diào)ERCC1表達，從而增強耐藥株HCT116/OXA對奧沙利鉑化療敏感性。

綜上，該實驗表明DHRS2在結(jié)直腸癌耐藥細胞株HCT116/OXA上調(diào)，同時沉默DHRS2可促進奧沙利鉑的化療敏感性。初步探索其中的機制，有可能是DHRS2通過抑制P53表達從而下調(diào)ERCC1表達實現(xiàn)的。研究結(jié)果可為探究DHRS2影響結(jié)直腸癌惡性生物學(xué)行為提供一個新的理論依據(jù), 為逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌奧沙利鉑耐藥提供新的靶點研究策略。