李良云，潘林鑫，楊俊發(fā)，胡 爽，張 濛，李 俊，徐 濤

跨膜蛋白88(transmembrane protein 88，TMEM88)發(fā)現(xiàn)于非洲爪蟾蜍胚胎細(xì)胞的細(xì)胞膜上，是一種潛在的2型跨膜型蛋白，在人類干細(xì)胞的蛋白質(zhì)分化和胚胎發(fā)育中起關(guān)鍵作用。研究[1]表明，非小細(xì)胞肺癌組織和多種上皮惡性腫瘤中均有TMEM88高表達(dá)現(xiàn)象，并且主要定位于大多數(shù)癌癥組織的細(xì)胞質(zhì)和肺癌細(xì)胞株中。而炎癥在癌癥的發(fā)展和進(jìn)展中具有重要的作用，在調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境的進(jìn)出中扮演關(guān)鍵角色，在抗腫瘤免疫中扮演重要角色。腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素6 (interleukin-6，IL-6)作為研究炎癥的代表性細(xì)胞因子，可以提高免疫功能，增強(qiáng)抗腫瘤免疫力[2]。課題組前期研究[3]表明在肝臟炎癥纖維化的模型中，TMEM88可以改善在Ⅰ型膠原1 和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白水平上轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞的活化和增殖[3]。為進(jìn)一步研究TMEM88對炎癥因子分泌的影響，課題組將通過構(gòu)建TMEM88的真核質(zhì)粒，研究其在RAW264.7細(xì)胞中炎癥因子(TNF-α、IL-6)的表達(dá)及其對細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料實(shí)驗(yàn)材料 RAW264.7細(xì)胞株(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院)；ELISA(TNF-α、IL-6)試劑盒(武漢基因美公司)；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(上海貝博生物公司)；TMEM88抗體(美國SANTA CRUZ 公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國Thermo scientific公司)；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板 (美國Corning Costar公司)；TRIzol Reagent RNA 提取試劑(美國Invitrogen公司)； PVDF膜(北京索萊寶科技有限公司)；脫脂牛奶(上海光明公司)；DMEM培養(yǎng)基；胎牛血清(美國Gibco公司)； Hind III、Kpn I內(nèi)切酶、DL2000 DNA Marker、Lambda DNA Marker、T4連接酶、質(zhì)粒抽提試劑盒(美國Axygen公司)。

1.2 方法

1.2.1構(gòu)建質(zhì)粒 在小鼠正常肝細(xì)胞株(alpha mouse liver 12，AML-12)中提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA于-20 ℃ 保存。使用前，將引物(上海生工公司設(shè)計(jì))取出適量稀釋到10 μmol/L，其余作為儲(chǔ)備液。采用常規(guī)PCR擴(kuò)增技術(shù)，反應(yīng)體系：5×PrimeSTAR Buffer、dNTP Mix(2.5 mmol/L)、上下游引物(10 μmol/L)、DNA、PrimeSTAR、高純水。取出5 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行12%的瓊脂糖凝膠電泳，純化回收，并用Hind III、Kpn I雙酶切PCR產(chǎn)物和pEGFP-C1載體(分別置于紫外分析儀下觀察結(jié)果，使用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物TMEM88于0.5 ml的離心管中混勻，37 ℃水浴4～6 h)。先對酶切回收的載體進(jìn)行克隆堿性磷酸酶處理，再進(jìn)行粘性末端連接，然后進(jìn)行連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化、挑菌、搖菌、質(zhì)粒小抽，酶切鑒定后，送至上海生工公司鑒定測序。

1.2.2轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-TMEM88質(zhì)粒 6孔板中培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，待長至60%時(shí)，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗3次。在1.5 ml EP管中，A液：200 μl的Opti-MEM加pEGFP-C1-TMEM88真核表達(dá)質(zhì)粒1 μg；B液：200 μl的 Opti-MEM加LipofectamineTM2000脂質(zhì)體4 μl，將AB液混勻靜置20 min后加入細(xì)胞中，再用Opti-MEM補(bǔ)至2 ml。轉(zhuǎn)染6 h后，更換含血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后提取蛋白。

1.2.3Western blot實(shí)驗(yàn) 棄去6孔板中的培養(yǎng)基，PBS清洗3遍，每孔用蛋白裂解液(RIPA裂解液：PMSF為100 ∶1)200 μl于冰上裂解細(xì)胞30 min，提取蛋白。利用Thermo NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測蛋白濃度。SDS-PAGE電泳，在恒流200 mA條件下濕轉(zhuǎn)60 min，5%牛奶中封閉3 h，孵育一抗β-actin、TMEM88過夜，室溫孵育二抗1 h，顯影試劑盒ECL 中A液與B液1 ∶1混合后，即可顯影拍照。

1.2.4MTT測細(xì)胞增殖 將RAW264.7細(xì)胞以每孔5 000的數(shù)量接種至96孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長至70 %時(shí)開始轉(zhuǎn)染。每孔轉(zhuǎn)染約70 ng pEGFP-C1-TMEM88質(zhì)粒，6 h后更換培養(yǎng)基。再培養(yǎng)48 h后每孔加入20 μl MTT，4 h后，用5 ml注射器棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μl DMSO，充分裂解10 min后，測定吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 將RAW264.7細(xì)胞接種至6孔板中，分別轉(zhuǎn)染對照組空載體和pEGFP-C1-TMEM88質(zhì)粒。48 h后收集細(xì)胞上清液，PBS清洗3次，胰酶消化細(xì)胞并收集于15 ml離心管中。每組用400 μl Binding Buffer重懸細(xì)胞，并加入5 μl Annexin V染液，避光孵育15 min，然后加入10 μl PI，避光孵育5 min，流式儀器檢測細(xì)胞凋亡率，觀察并記錄。

1.2.6ELISA 檢測炎癥因子 將RAW264.7細(xì)胞接種至6孔板中，分別轉(zhuǎn)染對照組空載體和pEGFP-C1-TMEM88質(zhì)粒。每孔轉(zhuǎn)染1 μg的pEGFP-C1-TMEM88質(zhì)粒，6 h后換成含血清的培養(yǎng)基，48 h后收集細(xì)胞上清。用ELISA試劑盒檢測細(xì)胞上清液中炎癥細(xì)胞因子IL-6、TNF-α的表達(dá)。

1.2.7實(shí)驗(yàn)分組 正常組(N組)：不經(jīng)任何處理的正常細(xì)胞分組；對照組(Control組)：轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-C1的對照組；TMEM88組：轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-TMEM88質(zhì)粒的過表達(dá)組。

2 結(jié)果

2.1 pEGFP-C1-TMEM88真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功在小鼠肝細(xì)胞AML-12中提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄后PCR擴(kuò)增TMEM88的編碼序列(coding sequence，CDS)，利用Hind III、Kpn I雙酶切擴(kuò)增產(chǎn)物和pEGFP-C1載體，并用T4 DNA連接酶連接兩產(chǎn)物。將其轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌TG1，用抽提試劑盒提取質(zhì)粒。酶切鑒定(Hind III、Kpn I雙酶切)結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒酶切后得到兩條亮帶，一條大小約4 700 bp，大小與pEGFP-C1的酶切產(chǎn)物基本一致，另一條大小約480 bp，大小與TMEM88的PCR產(chǎn)物基本一致，表明pEGFP-C1-TMEM88質(zhì)粒連接成功，將陽性克隆送至上海生工公司鑒定測序，pEGFP-C1-TMEM88質(zhì)粒成功構(gòu)建，見圖1。

圖1 重組質(zhì)粒 pEGFP-C1-TMEM88 的酶切鑒定

M1：DL2000 DNA Marker； M2：Lambda DNA Marker；1：TMEM88的PCR產(chǎn)物；2：pEGFP-C1-TMEM88的酶切鑒定；3：pEGFP-C1的酶切鑒定

2.2 pEGFP-C1-TMEM88真核表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)將pEGFP-C1-TMEM88表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞中，利用Western blot檢測其蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，過表達(dá)質(zhì)粒組的TMEM88的蛋白表達(dá)量明顯高于Control組(F=134.64，P<0.01)；當(dāng)用TMEM88抗體免疫印跡時(shí)，過表達(dá)TMEM88組分別在約17 ku(內(nèi)源性TMEM88)和44 ku(GFP-TMEM88過表達(dá)，即27 ku + 17 ku)顯現(xiàn)蛋白印跡，而Control組僅在約17 ku(內(nèi)源性TMEM88)的顯現(xiàn)蛋白印跡，表明pEGFP-C1-TMEM88能夠成功表達(dá)，見圖2。

圖2 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-TMEM88的蛋白表達(dá)

A：Western blot檢測重組質(zhì)粒pEGFP-C1-TMEM88的蛋白表達(dá)；B：TMEM88蛋白表達(dá)圖；與Control組比較：**P<0.01

2.3 TMEM88對RAW264.7細(xì)胞增殖的影響MTT檢測將pEGFP-C1-TMEM88表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞后的細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示48 h后N組和Control組的細(xì)胞增殖率分別為(0.95±0.05)和(0.94±0.06)，過表達(dá)TMEM88組的細(xì)胞增殖率為(0.71±0.04)，顯著低于N組和Control組(F=21.55，P<0.01)，見圖3。

2.4 TMEM88對RAW264.7細(xì)胞凋亡的影響將生長對數(shù)期的RAW.264.7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-TMEM88質(zhì)粒，48 h后用凋亡試劑盒在流式儀上檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示，N組的細(xì)胞凋亡率為(6.72±0.92)%，Control組的細(xì)胞凋亡率為(7.78±1.67)%，過表達(dá)TMEM88組的細(xì)胞凋亡率為(11.52±1.43)%，顯著高于Control組 (F=10.07，P<0.05)，結(jié)果顯示，過表達(dá)TMEM88后，能夠促進(jìn)RAW.264.7細(xì)胞的凋亡，見圖4A、4B。

圖3 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-TMEM88對RAW264.7細(xì)胞增殖影響

與Control組比較：**P<0.01

2.5 TMEM88在RAW264.7細(xì)胞中對炎癥因子分泌的影響在RAW264.7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-TMEM88質(zhì)粒，ELISA檢測細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α炎癥因子的表達(dá)。轉(zhuǎn)染后的過表達(dá)組中的IL-6表達(dá)較Control組升高 (F=18.78，P<0.05)；TNF-α的表達(dá)較Control 組升高 (F=22.77，P<0.05)，表明在RAW264.7細(xì)胞中，TMEM88促進(jìn)炎癥因子IL-6、TNF-α的表達(dá)。見圖5。

3 討論

TMEM88是一種定位在17號染色體，分子量約為17 ku的雙跨膜蛋白，其CDS序列長度為477 bp，由159個(gè)氨基酸殘基組成的編碼[4-5]。通過抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白經(jīng)典通路[6]，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤的形成等[7]。而腫瘤又與炎癥密切相關(guān)[2]，所以課題組探究在RAW264.7細(xì)胞中，TMEM88對炎癥因子IL-6、TNF-α表達(dá)及其對細(xì)胞增殖凋亡的影響。RAW264.7細(xì)胞是研究病原菌感染吞噬、自噬、黏附后遞呈抗原的常用細(xì)胞株[8]，具有很強(qiáng)的黏附和吞噬抗原的能力，其中主要研究的炎癥細(xì)胞因子有IL-6、TNF-α[9]。TNF-α可由單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、脂肪組織、肝細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞等多種組織和細(xì)胞分泌。體內(nèi)IL-6可由免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞分泌[10]。綜上，IL-6和TNF-α與炎癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。大量實(shí)驗(yàn)表明抑制這些炎癥因子的分泌有助于炎癥的治療[11]。

課題組前期構(gòu)建了人源pEGFP-C2-TMEM88真核表達(dá)質(zhì)粒，研究了其對肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并已發(fā)表[7]。在此基礎(chǔ)上為了深入了解TMEM88的功能，該研究構(gòu)建了鼠源pEGFP-C1-TMEM88的真核表達(dá)質(zhì)粒，質(zhì)粒構(gòu)建酶切圖和Western blot結(jié)果顯示質(zhì)粒成功構(gòu)建和表達(dá)，接下來研究TMEM88對細(xì)胞增殖的影響。MTT結(jié)果顯示48 h后， N組的細(xì)胞增殖率為(0.95±0.05)；Control 組的細(xì)胞增殖率為(0.94±0.06)；過表達(dá)TMEM88組的細(xì)胞增殖率為(0.71±0.04)，顯著低于N組(F=21.55，P<0.01)。結(jié)果表明，過表達(dá)TMEM88能夠明顯抑制RAW264.7細(xì)胞的增殖。細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示：N組的細(xì)胞凋亡率為(6.72±0.92)%，Control組的細(xì)胞凋亡率為(7.78±1.67)%，過表達(dá)TMEM88組的細(xì)胞凋亡率 (11.52±1.43) %，顯著高于Control組(F=10.07，P<0.05)，過表達(dá)pEGFP-C1-TMEM88后的細(xì)胞凋亡率顯著高于N組。表明過表達(dá)TMEM88能夠顯著促進(jìn)RAW.264.7的凋亡。ELISA結(jié)果顯示：過表達(dá)TMEM88后，IL-6、TNF-α的表達(dá)升高。表明TMEM88促進(jìn)炎癥因子IL-6和TNF-α的表達(dá)。據(jù)文獻(xiàn)[12]顯示，TNF-α和IL-6有明顯的肝臟毒性，可引起肝細(xì)胞壞死，造成肝功能損傷。因?yàn)镮L-6和TNF-α二者均能激活T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞，單核巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞與肝細(xì)胞膜受體發(fā)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，造成肝細(xì)胞壞死。因此研究IL-6和TNF-α的表達(dá)對今后研究TMEM88在肝臟上炎癥的表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。該研究結(jié)果表明TMEM88在RAW264.7細(xì)胞的增殖和凋亡中起關(guān)鍵作用，抑制細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，且對炎癥具有一定的促進(jìn)作用。這為今后炎癥的治療打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，課題組將繼續(xù)深入探討TMEM88與炎癥的關(guān)系及機(jī)制。

圖4 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-TMEM88對RAW264.7細(xì)胞凋亡的影響 A：過表達(dá)TMEM88流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果；B：細(xì)胞凋亡率柱狀圖；與Control組比較：*P<0.05

圖5 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-TMEM88轉(zhuǎn)染后 ELISA檢測炎癥因子IL-6和TNF-α的表達(dá) 與Control組比較：*P<0.05