夏 雪，許筱莉，龍金華,2，王 赟,3，張世超，歐陽(yáng)燕，朱貴明，胡祖權(quán)，曾 柱,3

樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells, DCs)是機(jī)體內(nèi)功能強(qiáng)大的抗原呈遞細(xì)胞[1]，臨床上利用DCs治療免疫相關(guān)疾病已經(jīng)取得大量進(jìn)展，在腫瘤治療領(lǐng)域的成功應(yīng)用更是令人矚目[2-3]。研究[4-5]表明腫瘤微環(huán)境中高表達(dá)的抑制性細(xì)胞因子能夠影響DCs的免疫學(xué)功能，白介素10(interleukin-10, IL-10)在腫瘤患者體內(nèi)的表達(dá)量較高，是一種具有免疫抑制特性的細(xì)胞因子，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示IL-10的活性能夠抑制DCs的分化成熟，并影響抗腫瘤免疫治療的效果[6-7]。從生物物理學(xué)的觀點(diǎn)來(lái)看，結(jié)構(gòu)決定功能，細(xì)胞骨架重構(gòu)在DCs的遷移和發(fā)揮免疫功能中起重要作用[7]。該文研究IL-10對(duì)人成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(mature DCs, mDCs) 細(xì)胞骨架的影響，為研究腫瘤微環(huán)境中DCs的免疫學(xué)功能以及探索提高DCs腫瘤疫苗的治療效率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；細(xì)胞裂解液、淋巴分離液均購(gòu)自北京索萊寶公司；免疫磁珠分選試劑盒購(gòu)自德國(guó)MACS公司；兔抗人絲切蛋白(Cofilin)、兔抗人磷酸化絲切蛋白(phosphorylation cofilin，p-Cofilin)購(gòu)自美國(guó)CST公司；小鼠抗人肌動(dòng)蛋白絲束蛋白(Fascin-1)購(gòu)自美國(guó)Santa公司；小鼠抗人β-actin單克隆抗體購(gòu)自北京全式金公司；重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CFS)、重組人白細(xì)胞介素4(rhIL-4)、腫瘤壞死因子α(rhTNF-α)、IL-10購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司；羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽購(gòu)自美國(guó)Thermo-Fisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1CD14+單核細(xì)胞的分離 在50 ml離心管中加入15 ml淋巴細(xì)胞分離液，再緩慢加入30 ml的新鮮人外周血濃集白細(xì)胞，該新鮮人外周血濃集白細(xì)胞用2倍體積RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋?zhuān)? 600 r/min離心15 min；吸取白膜層，與等量RPMI 1640培養(yǎng)基混勻，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，重復(fù)2～3次洗滌細(xì)胞。隨后，加入適量RPMI 1640培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)2～3 h，用0.25%胰蛋白酶消化收集外周血單核細(xì)胞。

1.2.2mDCs誘導(dǎo)培養(yǎng) 用含雞尾酒抗體的免疫磁珠陰性選擇獲得CD14+的單核細(xì)胞，加入150 ng/ml rhGM-CSF、100 ng/ml rhIL-4，培養(yǎng)5～7 d分化為未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(immature DCs, imDCs) 。然后，用RMPI 1640培養(yǎng)基漂洗imDCs 2次，加入含150 ng/ml rhGM-CSF、100 ng/ml rhIL-4和10 ng/ml TNF-α的細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)3 d獲得mDCs。

1.2.3IL-10處理mDCs 用RPMI 1640培養(yǎng)基將mDCs稀釋成1×106/ml，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入含150 ng/ml rhGM-CSF、100 ng/ml rhIL-4和10 ng/ml TNF-α的細(xì)胞培養(yǎng)液，處理組再加入10 ng/ml IL-10，置于CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)48 h。

1.2.4細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)分析 取蓋玻片置于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入1 ml 0.1 mg/ml多聚賴(lài)氨酸，37 ℃培養(yǎng)箱中放置2 h，每孔加入1 ml PBS漂洗蓋玻片2次，去除多聚賴(lài)氨酸。加入細(xì)胞懸液，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，每孔加入1 ml 3.7%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min。吸取上清液丟棄，加入1 ml 75 mg/ml甘氨酸室溫孵育10 min，再換1% Triton X-100室溫孵育10 min。隨后，每孔加入1 ml PBS置于搖床上晃動(dòng)清洗5 min，吸棄上清液，重復(fù)操作3次，每孔加入100 μl 1%BSA溶液室溫封閉1 h；PBS漂洗3次，加入50 μl 150 U/ml羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽，室溫下避光靜置40 min；PBS漂洗3次，加入50 μl DAPI溶液，室溫下避光靜置10 min。最后，PBS漂洗細(xì)胞3次，取出蓋玻片，加50 μl抗熒光淬滅劑固定在載玻片上。利用激光共聚焦顯微鏡在630倍物鏡下觀察mDCs的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)。

1.2.5Western blot實(shí)驗(yàn)分析 用RIPA提取mDCs總蛋白，通過(guò)BCA法測(cè)定蛋白濃度后，取50 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，置于5%脫脂奶粉中封閉1 h。TBST溶液洗3次后，分別加入抗Fascin-1、抗Cofilin、抗p-Cofilin和抗β-actin抗體，室溫2 h。TBST溶液洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫輕搖1 h。最后，用TBST和TBS洗滌3次，在暗室中加入化學(xué)發(fā)光顯色試劑，曝光顯影后利用Image J軟件分析蛋白條帶。

1.2.6免疫熒光實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞處理同細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)分析，在加入BSA溶液封閉后，分別加入抗Fascin-1、抗Cofilin、抗p-Cofilin抗體，37 ℃孵育2 h。用PBST和PBS洗滌3次后，加入500 μl熒光標(biāo)記二抗，37 ℃培養(yǎng)箱放置1 h。隨后，PBST和PBS分別洗滌細(xì)胞3次，取出蓋玻片，加50 μl抗熒光淬滅劑固定在載玻片上，利用熒光顯微鏡分析細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白在mDCs中的定位情況。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察在培養(yǎng)過(guò)程中，外周血單核細(xì)胞分化為imDCs后，細(xì)胞體積比單核細(xì)胞略大，形態(tài)為多邊形，細(xì)胞表面伸出許多毛刺樣突起，細(xì)胞抱團(tuán)，呈集落樣生長(zhǎng)(圖1A)。當(dāng)細(xì)胞成熟為mDCs后，變?yōu)椴灰?guī)則形狀，細(xì)胞表面伸出許多長(zhǎng)短不一、粗細(xì)不等、疏密不同的樹(shù)枝狀、毛刺狀或絨線狀的突起(圖1B)。

圖1 顯微鏡明場(chǎng)下imDCs和mDCs的形態(tài) ×40A：imDCs；B：mDCs

2.2 細(xì)胞骨架纖維狀肌動(dòng)蛋白(fibros actin，F(xiàn)-actin)結(jié)構(gòu)的變化細(xì)胞經(jīng)IL-10處理后，用羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽特異性標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)F-actin，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察其結(jié)構(gòu)。結(jié)果如圖2所示，對(duì)照組mDCs的F-actin主要分布于細(xì)胞膜下，而IL-10處理后mDCs的F-actin多聚集于細(xì)胞表面的突起，提示細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的重組，說(shuō)明IL-10能夠影響mDCs的細(xì)胞骨架重排。

圖2 mDCs細(xì)胞骨架F-actin結(jié)構(gòu)的變化 ×630A：對(duì)照組；B：IL-10處理組

2.3 細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白的表達(dá)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)及其結(jié)合蛋白的表達(dá)與細(xì)胞的生物物理學(xué)特性和運(yùn)動(dòng)能力密切相關(guān)。結(jié)合前期10 ng/ml的IL-10處理mDCs后基因芯片的結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)利用Western blot實(shí)驗(yàn)分析IL-10對(duì)細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白Fascin-1、Cofilin和p-Cofilin的表達(dá)影響(圖3)。IL-10處理后，DCs中Cofilin的表達(dá)變化不明顯，F(xiàn)ascin-1和p-Cofilin的表達(dá)上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白在mDCs的F-actin重排過(guò)程中的起到調(diào)節(jié)作用。

圖3 Western blot檢測(cè)細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白的表達(dá)情況

A：Fascin-1；B: Cofilin; C：p-Cofilin；D：蛋白相對(duì)表達(dá)量分析結(jié)果；與對(duì)照組比較：*P<0.05

2.4 細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白的定位分析細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白在發(fā)揮其功能的過(guò)程中，除了表達(dá)量外，在細(xì)胞中的定位也起著重要作用。10 ng/ml的IL-10處理mDCs后，免疫熒光實(shí)驗(yàn)分析Fascin-1、Cofilin和p-Cofilin在細(xì)胞中的定位情況。結(jié)果如圖4所示，3種細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白的定位都發(fā)生了明顯的變化，其中Fascin-1定位于細(xì)胞張力纖維和細(xì)胞膜褶皺邊緣的絲狀偽足和微棘等細(xì)胞突起的核心肌動(dòng)蛋白束上，而Cofilin和p-Cofilin位于質(zhì)膜和胞質(zhì)，與肌動(dòng)蛋白絲共定位。

3 討論

DCs是機(jī)體免疫系統(tǒng)中功能最強(qiáng)的專(zhuān)職抗原提呈細(xì)胞，在體內(nèi)直接激活初始T細(xì)胞，生成輔助性T細(xì)胞和殺傷性T細(xì)胞，也能誘使B細(xì)胞生成抗體，基于DCs的抗腫瘤免疫治療被認(rèn)為是目前最有希望攻克癌癥的方法之一，但是該治療方法在臨床試驗(yàn)的過(guò)程中還存在一些問(wèn)題[2-3, 8]，本實(shí)驗(yàn)以腫瘤微環(huán)境中高表達(dá)的IL-10為研究對(duì)象，分析其對(duì)mDCs細(xì)胞骨架的影響，這對(duì)深入理解DCs的免疫學(xué)功能以及提高DCs腫瘤疫苗的臨床治療效率來(lái)說(shuō)具有重要意義。

細(xì)胞骨架是細(xì)胞核骨架、細(xì)胞質(zhì)骨架、細(xì)胞膜骨架和細(xì)胞外基質(zhì)所形成的網(wǎng)絡(luò)體系，核骨架、核纖層與中間纖維在結(jié)構(gòu)上互相連接，貫穿于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的網(wǎng)架體系，具有維持細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)有序性的功能，在調(diào)控細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、物質(zhì)運(yùn)輸、能量轉(zhuǎn)換、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分化、基因表達(dá)以及生物物理學(xué)特性等方面起著關(guān)鍵的作用[9-11]，這些過(guò)程還受到細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白的精密調(diào)控[9,12]。研究[13]表明，腫瘤微環(huán)境中高表達(dá)的IL-10能夠抑制DCs的分化成熟和免疫學(xué)功能，因此，研究IL-10對(duì)mDCs細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)及其結(jié)合蛋白表達(dá)和定位的影響對(duì)于深入研究腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)理具有重要意義。

圖4 免疫熒光分析mDCs細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白的定位情況 ×630

Fascin-1是一種結(jié)構(gòu)獨(dú)特的細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白，定位于肌動(dòng)蛋白束的核心，通過(guò)與F-actin結(jié)合能夠使細(xì)胞形成絲狀、片狀偽足及微棘，參與細(xì)胞黏附、遷移以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，與細(xì)胞形態(tài)、遷移能力、應(yīng)力纖維以及DCs的抗原提呈功能等具有密切聯(lián)系。絲切蛋白Cofilin是一種高度保守的蛋白，同樣能夠與F-actin結(jié)合，使磷酸化的Cofilin失去活性。Cofilin可結(jié)合在微絲的負(fù)端使微絲解聚，在微絲快速組裝和去組裝的結(jié)構(gòu)中具有重要的作用，涉及細(xì)胞的黏附、遷移和內(nèi)吞等功能。本實(shí)驗(yàn)用IL-10處理mDCs 48 h后，DCs的F-actin表達(dá)量上升，絲狀偽足的數(shù)量和長(zhǎng)度有增加的趨勢(shì)(圖2)，而且細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白Fascin-1和p-Cofilin的表達(dá)量上調(diào)，Cofilin的表達(dá)量略有降低(圖3)，而且在細(xì)胞中的定位也發(fā)生明顯變化，表明細(xì)胞骨架在此過(guò)程中發(fā)生了重組。

DCs是免疫細(xì)胞中最活躍的成員之一，存在imDCs和mDCs兩種不同的功能狀態(tài)，imDCs表面的突起短小而稀疏，而當(dāng)其捕獲抗原并成熟后，其細(xì)胞體積增大，突起變長(zhǎng)且密度增加，細(xì)胞骨架發(fā)生了明顯的變化。本課題組的前期研究[14]結(jié)果表明，在DCs兩種不同的分化階段，其生物物理學(xué)特性存在明顯的差異：膜流動(dòng)性、滲透脆性、電泳遷移率及細(xì)胞的變形能力均有所變化。由此可見(jiàn)，細(xì)胞骨架的重構(gòu)與DCs的功能有著密切的關(guān)系。有研究[2，4，7，15]表明，細(xì)胞骨架的重構(gòu)在DCs免疫作用過(guò)程中發(fā)揮了不可或缺的作用，包括吞噬、抗原提呈、遷移能力等。在腫瘤微環(huán)境中，DCs的運(yùn)動(dòng)能力下降，生物物理學(xué)特性受到損傷，其機(jī)制之一就是腫瘤微環(huán)境中的多種成分可以改變細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)[14-15]。因此，推測(cè)IL-10影響骨架結(jié)合蛋白的表達(dá)和定位，使細(xì)胞F-actin含量以及絲狀偽足的數(shù)量和長(zhǎng)度發(fā)生改變。mDCs的細(xì)胞骨架發(fā)生重構(gòu)，打破了細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白的平衡，直接影響mDCs的免疫學(xué)功能，這也可能是腫瘤細(xì)胞逃脫免疫監(jiān)視的一種重要方式。