王慶康，宋早智，劉 雪，錢 軍

在我國(guó)，胃癌發(fā)病率和病死率分居惡性腫瘤的第二位和第三位，晚期胃癌的5年生存率小于5%[1- 2]。放化療主要用于中晚期胃癌患者的治療，但因其不良反應(yīng)較多，患者通常難以耐受。類端粒沉默干擾體-1(disruptor of telomeric silencing-1, DOT1)是一種在哺乳動(dòng)物進(jìn)化過程中發(fā)揮作用的保守蛋白，其在人類基因中被稱為DOT1-like(DOT1L)[3]。DOT1L可使組蛋白H3的第79位賴氨酸(H3K79)發(fā)生甲基化[4]。對(duì)肺癌A549或NCI-H1299細(xì)胞DOT1L基因干擾后，細(xì)胞常表現(xiàn)出非增殖的多核表型[5]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)是胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素，在胃癌侵襲、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的早期階段均發(fā)揮重要作用[6]。有研究[7]表明，EMT與H3K79甲基化修飾有一定相關(guān)性。該研究通過干擾胃癌MGC-803細(xì)胞中DOT1L基因，下調(diào)H3K79甲基化水平，進(jìn)而觀察DOT1L基因?qū)ξ赴㎝GC-803細(xì)胞增殖的影響,并探索遷移及侵襲能力改變與EMT的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與試劑MGC-803、BGC-823、SGC-7901細(xì)胞株均由本實(shí)驗(yàn)室提供；RPMI -1640培養(yǎng)基、1%青霉素-鏈霉素混合物均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；Real-time PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Primescript RT試劑購(gòu)自日本Takara公司；CCK-8試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、0.1%結(jié)晶紫均購(gòu)自上海碧云天公司；Transwell小室購(gòu)自北京Unique生物公司；matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司；polybrene、嘌呤霉素、胰酶均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DOT1L、H3K79me1、H3K79me2、H3K79me3、EMT標(biāo)識(shí)基因蛋白一抗(鼠抗)均購(gòu)自美國(guó)ABclonal公司；β-actin一抗(鼠抗)、DOT1L、H3K79me1、H3K79me2、H3K79me3、EMT標(biāo)識(shí)基因蛋白、β-actin二抗(羊抗鼠)均購(gòu)自美國(guó)Abbkine公司；DOT1L基因相關(guān)的上下游PCR引物(上海生工生物有限公司)；上海吉瑪公司構(gòu)建DOT1L-shRNA(正義序列：5′-CCGGGCCCGCAAGAAGAAGCTAAACCTCGAGG-TTTAGCTTCTTCTTGCGGGCTTTTTG-3′；反義序列：5′-AATTCAAAAAGCCCGCAAGAAGAAGCTAAACC-TCGAGGTTTAGCTTCTTCTTGCGGGC-3′)，命名為pLKO.1puro-DOT1L-shRNA；陰性對(duì)照shRNA(正義序列：5′-CCGGCCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGC-TCG AGCGAGGGCGACTTAACCTTAGGTTTTTG-3′；反義序列：5′-AATTCAAAAACCTAAGGTTAAGTCGCCCT CGCTCGAGCGAGGGCGACTTAACCTTAGG-3′),命名為pLKO.1puro-shNC。

1.2 Western blot法比較3種不同胃癌細(xì)胞株DOT1L基因的表達(dá)水平收集MGC-803、BGC-823、SGC-7901離心后細(xì)胞沉淀，提取總蛋白。檢測(cè)蛋白濃度后，使用RIPA裂解液調(diào)整各組蛋白樣品至等體積等濃度后，加入上樣緩沖液，沸水煮浴10 min使蛋白變性。取等體積3組蛋白樣品組上樣。110 V恒壓電泳完成后電轉(zhuǎn)移至0.45 μm PVDF膜上，經(jīng)5%脫脂牛奶封閉2 h后，轉(zhuǎn)移至孵育盒中，加入TBST稀釋后的DOT1L抗體和β-actin的抗體并4 ℃孵育過夜。次日用TBST洗膜3次，每次10 min。加入二抗室溫?fù)u床孵育2 h，洗膜3次，每次10 min。ECL發(fā)光液發(fā)光顯色，使用Image J軟件圖像分析，計(jì)算出各組細(xì)胞中DOT1L基因蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 選取胃癌MGC-803細(xì)胞進(jìn)行病毒感染將胃癌MGC-803細(xì)胞均勻接種于6孔板中，每孔約種5×105個(gè)細(xì)胞，控制polybrene終濃度為6 μg/ml，按使用說明，用pLKO.1puro-DOT1L-shRNA和pLKO.1puro-shNC分別感染胃癌細(xì)胞。病毒感染48 h后更換含10%血清培養(yǎng)基，加入調(diào)整后濃度為3 μg/ml的嘌呤霉素，篩選MGC-803細(xì)胞2周后繼續(xù)擴(kuò)增。

1.4 Real-time PCR檢測(cè)DOT1L基因的轉(zhuǎn)染提取總RNA，使用Primescript RT試劑對(duì)不含DNA的RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。通過使用Step One Plus Real-time PCR系統(tǒng)，用SYBR Green RT-PCR試劑盒進(jìn)行所有qRT-PCR的mRNA分析。以下引物用于qRT-PCR：DOT1L上游引物:5′-CATCACTATGGCGTCGAGAAA-3′，下游引物:5′-CGCCTCTCTCCAATGTGTATT-3′；β-actin上游引物:5′-CAGGAAGGAAGGCTGGAAG-3′，下游引物:5′-CGGGAAAT CGTGCGTGAC-3′。PCR反應(yīng)總體系為10 μl：ddH2O 3.2 μl、Rox 0.2 μl、上游和下游引物各0.3 μl、Mix 5 μl、cDNA 1 μl。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s后60 ℃退火34 s，共40個(gè)循環(huán)。β-actin作為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。各組Ct值與β-actin的Ct值相減得到△Ct，用2-△△Ct方法比較。

1.5 Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果按1.2項(xiàng)步驟，檢測(cè)MGC-803細(xì)胞轉(zhuǎn)染慢病毒后，各組細(xì)胞中H3K79甲基化水平。

1.6 細(xì)胞集落克隆實(shí)驗(yàn)和CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

1.6.1細(xì)胞集落克隆實(shí)驗(yàn) 消化各組細(xì)胞并計(jì)數(shù)，以1×103/孔的密度接種在6孔板中，每組均設(shè)置3個(gè)亞孔。培養(yǎng)至肉眼下可見細(xì)胞集落后，棄培養(yǎng)基并加入PBS洗滌，加入600 μl 0.1%的結(jié)晶紫染色。室溫下晾干，倒置顯微鏡40倍鏡下相同拍照位置拍照，計(jì)算單克隆集落數(shù)并作圖。

1.6.2CCK-8實(shí)驗(yàn) 消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞密度為3×103/孔并接種接種于4塊96孔板，每組均設(shè)置3個(gè)亞孔。培養(yǎng)24、48、72、96 h后向各孔中加入10 μl CCK-8溶液，37 ℃孵育1.5 h后。在波長(zhǎng)450 nm下檢測(cè)各組細(xì)胞吸光度值，繪制增殖曲線圖。

1.7 細(xì)胞劃痕損傷實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MGC-803細(xì)胞體外遷移能力6孔板每孔約接種5×105個(gè)細(xì)胞，各組均設(shè)3個(gè)亞孔。待細(xì)胞隔夜剛長(zhǎng)滿貼壁，吸出培養(yǎng)基，加入PBS洗滌3次。經(jīng)皿底垂直劃直線，加入PBS洗去漂浮細(xì)胞。使用不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，0、24 h后顯微鏡下拍照并標(biāo)記拍照位置。用Photoshop軟件測(cè)量細(xì)胞劃痕距離。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。劃痕愈合率=(1-24 h距離/0 h距離)×100%。

1.8 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MGC-803細(xì)胞遷移和侵襲能力

1.8.1細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/ml，加入100 μl至Transwell上室，每組均設(shè)置3個(gè)亞室。下室加入含15%血清的培養(yǎng)基500 μl。培養(yǎng)24 h后，棄去小室內(nèi)培養(yǎng)基，PBS洗滌并用棉簽輕輕擦拭濾膜上層。甲醇和結(jié)晶紫分別進(jìn)行固定和染色，時(shí)長(zhǎng)均為20 min，相同位置下取5個(gè)高倍視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.8.2細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將提前24 h預(yù)冷的10 μl Matrigel與60 μl的無血清培養(yǎng)基混勻，晾干后還需加入50 μl無血清培養(yǎng)基水化基底膜。培養(yǎng)箱中孵育30 min。余步驟同Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。

1.9 Western blot法檢測(cè)EMT標(biāo)識(shí)基因蛋白表達(dá)水平按1.2項(xiàng)步驟檢測(cè)胃癌細(xì)胞中E-Cadherin、N-Cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 Western blot法比較胃癌MGC-803、BGC-823、SGC-7901細(xì)胞DOT1L表達(dá)水平Western blot結(jié)果顯示，3種胃癌細(xì)胞系中，胃癌MGC-803細(xì)胞DOT1L表達(dá)水平最高。本研究擬挑選胃癌MGC-803細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見圖1。

圖1 Western blot法檢測(cè)3種胃癌細(xì)胞株中 DOT1L基因蛋白的相對(duì)表達(dá)水平

2.2 Real-time PCR檢測(cè)DOT1L mRNA表達(dá)水平將pLKO.1puro-DOT1L-shRNA和pLKO.1puro-shNC分別感染胃癌MGC-803細(xì)胞，檢測(cè)3組細(xì)胞中DOT1L mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果表明，感染慢病毒shDOT1L組細(xì)胞mRNA表達(dá)水平較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=54.200,P<0.05)，見圖2。

圖2 Real-time PCR檢測(cè)DOT1L mRNA水平

與空白對(duì)照組比較：*P<0.05；與陰性對(duì)照組比較：#P<0.05

2.3 Western blot法檢測(cè)3組細(xì)胞DOT1L甲基化水平shDOT1L組細(xì)胞內(nèi)H3K79me1、H3K79me2和H3K79me3的表達(dá)水平顯著降低，灰度值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=71.100,P<0.05；F=104.800,P<0.05；F=33.940,P<0.05)。H3K79甲基化水平下調(diào)表明MGC-803細(xì)胞的DOT1L基因干擾有效。這與熒光定量PCR結(jié)果一致，證明該細(xì)胞可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見圖3。

A：Western blot法檢測(cè)干擾DOT1L表達(dá)對(duì)H3K79甲基化蛋白相對(duì)表達(dá)水平的影響；B：干擾DOT1L表達(dá)對(duì)H3K79甲基化蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響；與空白對(duì)照組比較：*P<0.05；與陰性對(duì)照組比較：#P<0.05

2.4 細(xì)胞集落克隆實(shí)驗(yàn)和CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力① 細(xì)胞集落克隆結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染DOT1L-shRNA慢病毒后細(xì)胞形成的集落密度大小尚不及對(duì)照組。選取5個(gè)固定位置，使用倒置顯微鏡40倍鏡下拍照，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組及shDOT1L組平均集落數(shù)分別為(11.80±0.97)、(12.00±1.00)和(4.20±0.66)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=24.920,P<0.05)，見圖4。② CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， shDOT1L組細(xì)胞在48、72、96 h的增殖效率明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=21.440,P<0.05；F=11.390,P<0.05；F=36.620,P<0.05)。以上結(jié)果提示干擾DOT1L基因表達(dá)抑制MGC-803細(xì)胞的增殖能力，見圖5。

圖4 細(xì)胞集落克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MGC-803細(xì)胞增殖效率

A：不同組別細(xì)胞平板克隆結(jié)晶紫染色結(jié)果；B：不同組別倒置顯微鏡下細(xì)胞團(tuán)塊數(shù)量×40；與空白對(duì)照組比較：*P<0.05；與陰性對(duì)照組比較：#P<0.05

2.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞體外遷移能力空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組細(xì)胞遷移率為(56±1.05)%、(51±1.31)%，shDOT1L組遷移率為(25±1.33)%。結(jié)果表明，干擾DOT1L表達(dá)的MGC-803細(xì)胞24 h的遷移能力顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=43.600,P<0.05)，見圖6。

2.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移及侵襲能力Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，24 h后shDOT1L組遷移細(xì)胞數(shù)(62.33±6.89)較空白對(duì)照組(226.70±9.39)和陰性對(duì)照組(208.30±12.67)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=82.190,P<0.05)。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 24 h后空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和shDOT1L組細(xì)胞穿膜數(shù)分別為(356.70±21.17)、(331.30±12.81)、(169.00±9.64)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=44.110,P<0.05)。這表明干擾DOT1L基因表達(dá)能夠明顯減弱MGC-803細(xì)胞的遷移和侵襲能力，見圖7。

2.7 Western blot法檢測(cè)EMT標(biāo)識(shí)基因蛋白表達(dá)水平結(jié)果顯示,干擾DOT1L表達(dá)可以減少M(fèi)GC-803細(xì)胞中N-Cadherin和Vimentin的表達(dá), 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=20.400,P<0.05；F=23.730,P<0.05)，而E-Cadherin蛋白表達(dá)增加(F=76.060,P<0.05)。這一結(jié)果說明，下調(diào)DOT1L基因能部分逆轉(zhuǎn)MGC-803細(xì)胞的EMT表型，見圖8。

圖5 CCK-8驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖效率

與空白對(duì)照組比較：*P<0.05；與陰性對(duì)照組比較：#P<0.05

3 討論

DOT1L是一種賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，可以使組蛋白H3的第79位賴氨酸(H3K79)產(chǎn)生單甲基、二甲基和三甲基化[8]。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，H3K79甲基化與轉(zhuǎn)錄的活性相關(guān)[9]。有研究[10]表明，在混合譜系白血病中，DOT1L抑制劑讓機(jī)體可以產(chǎn)生較強(qiáng)的抗腫瘤作用。針對(duì)DOT1L基因高表達(dá)的肺癌和乳腺癌以及伴有MYCN擴(kuò)增的的神經(jīng)母細(xì)胞瘤，DOT1L基因同樣也是潛在的治療靶點(diǎn)[11-13]。然而，目前DOT1L對(duì)胃癌的發(fā)生發(fā)展有何影響，尚無相關(guān)報(bào)道。

本研究以DOT1L基因高表達(dá)的胃癌細(xì)胞系MGC-803為研究對(duì)象，設(shè)計(jì)針對(duì)DOT1L的pLKO.1puro-DOT1L-shRNA感染MGC-803細(xì)胞。成功篩選出DOT1L低表達(dá)的細(xì)胞株后，探討其對(duì)細(xì)胞增殖能力的改變以及EMT與遷移侵襲能力改變與的相關(guān)性。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)組mRNA和相關(guān)蛋白的表達(dá)均較對(duì)照組顯著降低，表明轉(zhuǎn)染模型成功建立。通過CCK-8法驗(yàn)證其抑制MGC-803細(xì)胞的增殖活性。細(xì)胞集落克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DOT1L表達(dá)能力降低可顯著抑制MGC-803細(xì)胞集落的形成能力，表現(xiàn)為集落數(shù)目顯著減少，細(xì)胞形態(tài)多種多樣，而對(duì)照組細(xì)胞大小形態(tài)一致，集落生長(zhǎng)旺盛。該結(jié)果表明，DOT1L基因在胃癌MGC-803細(xì)胞惡性增殖過程中發(fā)揮著重要作用。遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾DOT1L表達(dá)后，胃癌MGC-803細(xì)胞體外遷移速度明顯減慢，Transwell上室的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少。在Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中，自上室侵襲至下室的細(xì)胞數(shù)目同樣減少。因此，DOT1L基因表達(dá)降低也會(huì)減弱MGC-803細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

圖6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌MGC-803細(xì)胞遷移能力
A：不同組別細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果×100；B：不同組別細(xì)胞遷移率結(jié)果比較分析；與空白對(duì)照組比較：*P<0.05；與陰性對(duì)照組比較：#P<0.05

圖7 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲和遷移能力

A：Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)不同組別穿透小室的結(jié)晶紫染色結(jié)果×200；B：Transwell遷移實(shí)驗(yàn)不同組別穿透小室的結(jié)晶紫染色結(jié)果×200；C：Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)不同組別穿透小室細(xì)胞數(shù)量；D：Transwell遷移實(shí)驗(yàn)不同組別穿透小室細(xì)胞數(shù)量；與空白對(duì)照組比較：*P<0.05；與陰性對(duì)照組比較：#P<0.05

圖8 干擾DOT1L表達(dá)對(duì)EMT標(biāo)識(shí)基因蛋白表達(dá)的影響

A：Western blot法檢測(cè)干擾DOT1L表達(dá)對(duì)EMT標(biāo)識(shí)蛋白相對(duì)表達(dá)水平的影響；B：干擾DOT1L表達(dá)對(duì)EMT標(biāo)識(shí)蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響；與空白對(duì)照組比較：*P<0.05；與陰性對(duì)照組比較：#P<0.05

EMT不僅是一種復(fù)雜的多步驟過程, 它還是一種復(fù)雜的形態(tài)學(xué)變化過程, 并與上皮和間充質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)水平改變有關(guān)[14]。例如上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-Cadherin表達(dá)減少, 會(huì)導(dǎo)致上皮細(xì)胞的極性降低，細(xì)胞與細(xì)胞之間的連接減弱，而N-Cadherin與Vimentin表達(dá)增加則使腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲潛力增強(qiáng)[15]。本研究發(fā)現(xiàn), 干擾DOT1L基因正常表達(dá)后, 胃癌MGC-803細(xì)胞的EMT過程也會(huì)受到影響，表現(xiàn)為E-Cadherin的表達(dá)上調(diào)而N-Cadherin及Vimentin的表達(dá)下調(diào)。這或許表明干擾DOT1L基因表達(dá)導(dǎo)致EMT過程受到抑制，進(jìn)而導(dǎo)致胃癌MGC-803細(xì)胞的侵襲和遷移能力發(fā)生改變。

該研究通過成功干擾DOT1L基因表達(dá)，研究實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組MGC-803細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的改變。結(jié)果表明，干擾DOT1L基因表達(dá)后可顯著減弱MGC-803細(xì)胞的體外增殖能力。體外侵襲和遷移能力同樣減弱明顯，其機(jī)制可能與調(diào)控EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。因此，考慮靶向阻斷或者干擾人體內(nèi)DOT1L基因生物學(xué)作用，或許能給胃癌的治療提供新的思路。由于胃癌MGC-803細(xì)胞并不能完全代表其他類型的胃癌細(xì)胞系，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)亦不能夠完全模擬體內(nèi)生理生化環(huán)境，因此該實(shí)驗(yàn)也存在一定的局限性。為明確DOT1L基因作用于胃癌細(xì)胞的具體機(jī)制，需要進(jìn)一步的探索研究。