張博，賀茂芳，胡婭琪，韓祿，唐一梅，張育珍

(1.西安醫(yī)學(xué)院 藥物研究所，陜西 西安 710021；2.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021)

左氧氟沙星(Levofloxacin，LEV)是通過抑制細(xì)菌DNA旋轉(zhuǎn)酶的活性，阻止細(xì)菌DNA的合成和復(fù)制而導(dǎo)致細(xì)菌死亡，在臨床治療、農(nóng)牧養(yǎng)殖中被廣泛使用[1-3]。目前，可用于檢測(cè)左氧氟沙星的方法較多[4-8]，如紫外-可見分光光度法、熒光猝滅法、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法等，然而這些方法樣品前處理繁瑣、對(duì)目標(biāo)分子選擇性差、液-質(zhì)聯(lián)用實(shí)驗(yàn)成本高。為克服以上問題，本文制備Fe3O4@SiO2/IDA-Cu功能化磁性微球，并建立一種磁固相萃取-高效液相色譜法可對(duì)復(fù)雜生物樣品尿樣中左氧氟沙星特異性吸附富集，檢測(cè)專屬性強(qiáng)、便捷、可有效地降低樣品基質(zhì)的干擾。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

左氧氟沙星(純度為99%)、肉桂酸(CIN，純度為99%)、布洛芬(IBU，純度為98%)均由武漢那拉白醫(yī)藥化工有限公司提供；乙腈、甲酸均為色譜純；甲醇、無水乙醇、乙二醇、正硅酸乙酯(TEOS)、甲苯、3-(2，3-環(huán)氧丙基)丙基三甲基硅烷(KH-560)、亞氨基二乙酸(IDA)、無水三氯化鐵、檸檬酸三鈉、鹽酸、氨水均為分析純；空白尿液由健康受試者提供；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

DIONEX P680A型高效液相色譜儀；PB-10型酸度計(jì)；CPA225D型電子分析天平；SQP QUINTIX24-1CN型精密分析天平；JTF-100PPL型水熱合成反應(yīng)釜；TS-211B型氣浴搖床；SB-5200DTD型超聲波清洗器；DZF-6020型真空干燥箱；T09-1S型恒溫磁力攪拌器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 功能化磁性微球的制備 查閱相關(guān)文獻(xiàn)[9-12]，優(yōu)化部分實(shí)驗(yàn)條件，采用溶劑熱法合成Fe3O4磁性粒子。稱取適量上述磁性粒子，超聲分散于20%檸檬酸三鈉溶液中并靜置2 h，磁性分離，轉(zhuǎn)移至三頸瓶，加入水和無水乙醇，攪拌并超聲分散45 min，再加入適量濃氨水，超聲分散15 min，逐滴加入正硅酸乙酯(TEOS)，攪拌反應(yīng)12 h，磁性分離，依次用水、無水乙醇交替清洗粒子3次，50 ℃減壓干燥，即得到棕褐色Fe3O4@SiO2磁性微球。

取0.5 mL的KH-560，加入到10 mL無水甲苯中即為溶液Ⅰ。稱取適量Fe3O4@SiO2磁性微球于三頸瓶中，加無水甲苯50 mL，超聲分散10 min后110 ℃回流，緩慢滴加溶液Ⅰ，攪拌反應(yīng)12 h后，磁性分離。依次用甲苯、無水乙醇清洗粒子3次，即得到Fe3O4@SiO2@環(huán)氧基磁性微球。

在100 mL三頸瓶中，分別加入上述微球和純化水適量并超聲分散，再加入IDA溶液(無水碳酸鈉溶液溶解)調(diào)pH值為8.5，在80 ℃下油浴反應(yīng)12 h，磁性分離后置于50 mL離心管中，加入5 mmol/L的CuSO4溶液，在25 ℃下孵育3 h，反應(yīng)結(jié)束后用蒸餾水清洗磁性微球2次，50 ℃減壓干燥，即得Fe3O4@SiO2/IDA-Cu磁性復(fù)合材料。

1.2.2 色譜條件 色譜柱：Agilent HC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫25 ℃，流動(dòng)相：乙腈∶0.1%甲酸水溶液=15∶85，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)264 nm，進(jìn)樣體積20 μL。

1.2.3 對(duì)照品儲(chǔ)備液配制 精密稱取50.29 mg左氧氟沙星，置于100 mL容量瓶?jī)?nèi)，加入純化水稀釋至刻度，搖勻，即得0.497 9 mg/mL左氧氟沙星對(duì)照品儲(chǔ)備液。

精密稱取10.64 mg布洛芬，置于100 mL容量瓶?jī)?nèi)，加入純化水稀釋至刻度，搖勻，即得0.104 3 mg/mL 布洛芬對(duì)照品儲(chǔ)備液。

精密稱取40.17 mg肉桂酸，置于100 mL容量瓶?jī)?nèi)，加入純化水稀釋至刻度，搖勻，即得0.397 7 mg/mL 肉桂酸對(duì)照品儲(chǔ)備液。

1.2.4 供試品溶液配制 精密吸取1.2.3節(jié)左氧氟沙星儲(chǔ)備液1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加純化水稀釋至刻度，即得濃度為49.79 μg/mL的左氧氟沙星對(duì)照品溶液。

精密吸取尿液2.0 mL，轉(zhuǎn)移至50 mL具塞塑料離心管中，加入上述左氧氟沙星對(duì)照品溶液0.5 mL，加純化水稀釋至50 mL，再稱取1.2.1節(jié)Fe3O4@SiO2/IDA-Cu磁性微球約30 mg，加至離心管中，氣浴搖床25 ℃吸附30 min，磁性分離，5%氨水-甲醇溶液0.4 mL振蕩洗滌2次，合并2次洗脫液，并定容至1.0 mL，用0.45 μm微孔濾膜過濾，HPLC分析。

1.2.5 陰性對(duì)照溶液配制 參照1.2.4節(jié)實(shí)驗(yàn)步驟，不加左氧氟沙星對(duì)照品溶液，制成陰性對(duì)照溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 吸附-解吸附性能考察

2.1.1 磁性微球用量對(duì)吸附容量的影響 精密吸取尿液5份各2.0 mL，分別置于5支50 mL離心管中，加入1.2.4節(jié)左氧氟沙星對(duì)照品溶液各 0.5 mL，再依次加入20，25，30，35，40 mg的磁性微球。按照1.2.4節(jié)步驟進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)，按照1.2.2節(jié)色譜條件分析，以峰面積判斷吸附容量與磁性微球用量之間的關(guān)系，結(jié)果見圖1。

圖1 洗脫液色譜峰面積與磁性微球用量的關(guān)系Fig.1 Relationship between peak area of elution chromatography and magnetic beads dosage

由圖1可知，磁性微球用量20～30 mg時(shí)，左氧氟沙星測(cè)定的峰面積快速變大，而用量超過30 mg時(shí)，峰面積變化趨于穩(wěn)定，顯示不能進(jìn)一步提高吸附容量，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)磁性微球用量定為30 mg。

2.1.2 吸附時(shí)間對(duì)吸附容量的影響 精密吸取尿液2.0 mL 5份，每份加入30 mg的磁性微球，按照1.2.4節(jié)步驟操作，分別吸附10，20，30，40，50 min，以峰面積判斷吸附容量與吸附時(shí)間之間的關(guān)系，結(jié)果見圖2。

圖2 洗脫液色譜峰面積與吸附時(shí)間的關(guān)系Fig.2 Relationship between peak area of elution chromatography and adsorption time

由圖2可知，當(dāng)吸附30 min時(shí)，吸附容量達(dá)到最大值。

2.1.3 洗脫溶劑的組成對(duì)解吸附的影響 按照1.2.4節(jié)步驟操作，分別加入0，2%，5%，10%，20%氨水-甲醇溶液洗脫，對(duì)比5種不同洗脫結(jié)果的色譜峰面積，結(jié)果見圖3。

圖3 洗脫液色譜峰面積與洗脫溶劑的關(guān)系Fig.3 Relationship between peak area of elution chromatography and eluting solvent

由圖3可知，濃度在5%以上氨水-甲醇溶液并不能快速顯著的提高洗脫效率，可能是因?yàn)樽笱醴承恰彼虲u2+競(jìng)爭(zhēng)性吸附趨于平衡，所以確定5%氨水-甲醇溶液洗脫效果最佳。

2.1.4 洗脫時(shí)間對(duì)解吸附的影響 稱取30 mg磁性粒子4份，按照1.2.4節(jié)步驟操作，第1次洗脫10，20，30，45 min，結(jié)果顯示30 min洗脫效果最佳，繼續(xù)對(duì)該份樣品進(jìn)行第2次洗脫，分別洗脫10，15，30 min，結(jié)果顯示15 min基本洗脫完全。最終確定為2次洗脫，第1次30 min，第2次15 min，結(jié)果見圖4。

圖4 洗脫液色譜峰面積與洗脫時(shí)間、洗脫次數(shù)的關(guān)系Fig.4 Relationship between peak area of elution chromatography and elution time，elution times

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 作用機(jī)制與專屬性考察 左氧氟沙星藥物分子結(jié)構(gòu)中3，4位分別為羧基和酮羰基，易與金屬離子形成配位化合物，而肉桂酸、布洛芬等其它藥物分子結(jié)構(gòu)中沒有此結(jié)構(gòu)，因此這些物質(zhì)不能與Cu2+發(fā)生該配位反應(yīng)。所以可以推斷，制備的Fe3O4@SiO2/IDA-Cu可以特異性的吸附左氧氟沙星。

精密吸取空白尿液2.0 mL，加入1.2.3節(jié)左氧氟沙星、肉桂酸與布洛芬對(duì)照品溶液各0.2 mL，按照1.2.4節(jié)操作制備供試品溶液，另取1.2.5節(jié)陰性對(duì)照溶液，并按照1.2.2節(jié)色譜條件，結(jié)合梯度洗脫分析，0～5 min乙腈∶0.1%甲酸水溶液=15∶85，5～30 min乙腈∶0.1%甲酸水溶液=50∶50，30～50 min乙腈∶0.1%甲酸水溶液=50∶50，色譜分析結(jié)果見圖5。

圖5 專屬性考察色譜圖Fig.5 Chromatogram of specific investigation test

a.混合液中左氧氟沙星、肉桂酸與布洛芬色譜圖；b.洗脫液中左氧氟沙星色譜圖；c.陰性對(duì)照色譜圖

結(jié)果表明，本文中制備的磁性微球，在復(fù)雜樣本體系中可選擇性的吸附左氧氟沙星而布洛芬與肉桂酸無干擾，專屬性良好。

2.2.2 線性關(guān)系考察及檢出限、定量限 將左氧氟沙星對(duì)照品儲(chǔ)備液稀釋成濃度為0.50，1.99，4.98，19.92，49.79，99.58 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，并按照1.2.2節(jié)色譜條件，進(jìn)樣分析，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，求得回歸方程及相關(guān)系數(shù)為y=0.794 2x-0.296 1，r=0.999 8，表明線性關(guān)系良好，線性范圍0.5～99.58 μg/mL，分別以3倍、10倍信噪比(S/N)計(jì)算得出檢出限(LOD)為0.2 μg/mL和定量限(LOQ)0.5 μg/mL。再以19.92 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液為分析對(duì)象，按照1.2.4節(jié)分析，計(jì)算得精密度RSD為1.93%。

2.2.3 加標(biāo)回收率 精密吸取6份尿液各2.0 mL，按照1.2.4節(jié)方法制備供試品溶液，再分別加入低、中、高三個(gè)不同濃度的左氧氟沙星溶液，按照1.2.2節(jié)色譜條件分析，結(jié)果見表1。

表1 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Experimental results of spiked recoveries

由表1可知，平均回收率為95.85%，RSD為1.97%，表明該方法的回收率良好。

2.3 樣品測(cè)定

精密吸取空白尿液5份，各2.0 mL，分別轉(zhuǎn)移至5個(gè)50 mL離心管中，按照1.2.4節(jié)步驟制備供試品溶液，同時(shí)按照1.2.2節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析，分別記錄峰面積，并計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 尿液樣本含量測(cè)定結(jié)果Table 2 Test results of five human serum samples

3 結(jié)論

本文制備了一種新型功能化Fe3O4@SiO2/IDA-Cu磁性微球材料，通過大量的吸附-解吸附性能考察實(shí)驗(yàn)，對(duì)影響吸附-解吸附性能的主要因素進(jìn)行了研究，進(jìn)而優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，并對(duì)尿樣中左氧氟沙星進(jìn)行萃取、富集和檢測(cè)，獲得滿意的結(jié)果。

(1)在樣品前處理過程中，分別對(duì)不同樣品進(jìn)行了萃取、富集，研究了經(jīng)Cu2+修飾的磁性微球?qū)ψ笱醴承堑倪x擇性吸附機(jī)理。

(2)將Cu2+鍵合在Fe3O4磁性微球表面，使其表面金屬親和活性增加，選擇性吸附性能增強(qiáng)，聯(lián)合高效液相色譜儀建立MSPE-HPLC法，可有效降低尿液中基質(zhì)的干擾，富集微量乃至痕量的左氧氟沙星，為復(fù)雜生物樣本檢測(cè)提供了方便、快捷、低成本的檢測(cè)新方法。