謝輝 陳振崗 史學(xué)軍 鄧增華 孫長青 王輝 李一鳴 秦鈞 王廣舜

肺癌作為一種發(fā)病率和死亡高居世界第二，在中國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，已經(jīng)嚴重影響到人類的生命健康[1-2]。中國國家癌癥中心數(shù)據(jù)顯示，2014年全國惡性腫瘤估計新發(fā)病例380.4萬，死亡病例229.6萬例，其中肺癌每年發(fā)病約78.1萬，死亡病例62.6萬例，均位居全國首位[3]。2000-2014年全球癌癥生存率變化趨勢監(jiān)測研究報告(CONCORD-3)顯示，中國肺癌的發(fā)病占所有癌癥的22.6%，而5年生存率僅19.8%[4]。雖然針對肺癌的研究一直在持續(xù)進行，但進展很難令人滿意。繼靶向治療后，隨著CAR-T[5-6]細胞治療及PD1/PD-L1抑制劑[7-8]的橫空出世，免疫治療極大的改變了癌癥科研和治療的理念，為肺癌的治療帶來了新的革命性進展，但免疫治療尚處于高速發(fā)展階段，很多技術(shù)環(huán)節(jié)仍有待細化與改進，有效率較低(約20%)、優(yōu)勢人群還不很明確、免疫相關(guān)不良事件(immune-related adverse events, irAE)等[9-10]問題仍需要進一步全面認識。近期由吳一龍教授牽頭的全國多中心隨機對照Ⅱ期臨床研究[11]：新輔助靶向治療對比化療的頭對頭研究(CTONG1103)結(jié)果發(fā)表在J Clin Oncol雜志上，研究顯示術(shù)前應(yīng)用靶向藥物(厄洛替尼)，有效率高于化療約20%，手術(shù)成功率提高約15%，并且降低了術(shù)后復(fù)發(fā)風險，中位無進展生存期(median progression-free survival, mPFS)提高了10個月，首次證實了EGFR-TKI在新輔助及輔助階段的應(yīng)用，但總體而言，如客觀緩解率(objective response rate, ORR)等獲益并未達到預(yù)期。新的方向的研究仍迫在眉睫。

轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor,TF)作為與DNA特異性結(jié)合并調(diào)控轉(zhuǎn)錄功能的蛋白質(zhì)家族，幾乎所有的生物過程，都是由轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)系統(tǒng)調(diào)控的[12]。多種疾病的發(fā)生就是源于一個調(diào)控體系的失調(diào)，研究發(fā)現(xiàn)[13]164個TF直接與277種疾病或癥狀相關(guān)聯(lián)。許多TF在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的過程中就起到關(guān)鍵作用，如轉(zhuǎn)錄因子EGFR，KRAS，HER2等。所以，基于目前肺癌的高發(fā)病率、高死亡率及TF在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中所起關(guān)鍵作用，在轉(zhuǎn)錄水平上研究肺癌組織與癌旁組織中TF的差異表達，可能對肺癌發(fā)病機制、早期診斷、轉(zhuǎn)移及治療有重要的指導(dǎo)意義。

鑒于TF作為核提取物(nuclear extract, NE)，其低豐度性[14]，將其從高豐度的蛋白質(zhì)中大規(guī)模鑒定出來一直是個難題。我們研發(fā)了基于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的可以有效富集低豐度TF的檢測技術(shù)——catTFRE(a concatenated tandem array of the consensus transcription factor response elements，TF富集技術(shù))[14]，可以從細胞中大規(guī)模鑒定內(nèi)源性TF。但其在肺癌組織水平上對TF的富集效率如何還不得而知，本文首次利用catTFRE技術(shù)對肺癌及癌旁組織的TF進行富集，并初步探討其調(diào)控的生物過程。

資料與方法

一、標本和取材

來自天津醫(yī)科大學(xué)寶坻臨床學(xué)院腫瘤科病理證實的肺癌組織及癌旁組織6例。受試者均被告知組織標本用于研究目的，知情同意。

二、生物素標記的DNA(Biotin-DNA)的獲得

1 DNA 反應(yīng)元件的設(shè)計

根據(jù)已知高等脊椎動物的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合譜(http://jaspar.genereg.net/, The high-quality transcriptionfactor binding profile database)，人工合成串聯(lián)的結(jié)合序列，并將其構(gòu)入載體 pGEX4T2中。

2 體外擴增DNA序列

通過人工合成生物素(biotin)標記的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)引物，以構(gòu)建好的pGEX4T2-catTFRE為模板，經(jīng)PCR來擴增目的產(chǎn)物片段。

3 瓊脂糖凝膠電泳及DNA回收

按照Gel Extraction Kit(快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒)的說明書進行，得到Biotin-DNA。

三、組織樣本核蛋白的制備

肺癌組織及癌旁組織核提取物(NE)的提取按照從Thermo Scientific公司購買的“NE-PER?Nuclearand Cytoplasmic Extraction Reagents”試劑盒上的說明書進行提取。提取完成之后用Bradford法[15]測定核蛋白的濃度。

四、轉(zhuǎn)錄因子的富集

使用catTFRE方法對組織樣本的TF進行富集。每組樣品用3pmol(6μg)Biotin-DNA與120μL Dynal M280 鏈霉親和素磁珠結(jié)合后，再與600μg的組織核提取物結(jié)合，得到的protein-DNA復(fù)合物，然后洗去磁珠上非特異結(jié)合的蛋白，經(jīng)過10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對富集的樣品進行預(yù)分離，進行膠內(nèi)酶解、肽段萃取，并將每組樣品合并為3個組份，經(jīng)60 ℃真空抽干，進行質(zhì)譜分析及鑒定。

五、生物信息學(xué)分析

應(yīng)用基于強度的絕對定量方法(iBAQ)，依據(jù)組間 iBAQ值之間的比值對蛋白的表達量變化進行評定[16]。對于鑒定到的發(fā)生變化的TF及蛋白，通過KEGG _Pathway Analysis進行生物信息學(xué)分析。當Student t-檢驗P<0.05 時，認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、catTFRE可高效富集肺癌及癌旁組織的轉(zhuǎn)錄因子

研究報道[13]TF的表達數(shù)量在組織類型之間變化很大，范圍從闌尾、皮膚約150種，到全腦、甲狀腺超過300種，其中肺的TF約270種。然而，所有表達基因相關(guān)的TF在所有樣本表達基因中的比例穩(wěn)定在6%左右[13,17]。由于富集的TF復(fù)合體以及相關(guān)蛋白的復(fù)雜程度較高，為提高TF的鑒定水平，我們通過傳統(tǒng)的SDS-PAGE，在蛋白水平對富集樣品進行預(yù)分離，經(jīng)膠內(nèi)酶解和肽段萃取后為分3個組分進行質(zhì)譜鑒定。質(zhì)譜鑒定結(jié)果如下：肺癌組的質(zhì)譜掃描譜圖的平均利用率>50%，通過數(shù)據(jù)庫搜索，得到高可信度肽段數(shù)7369～10423，平均高可信度肽段數(shù)9916；鑒定到蛋白數(shù)為1256～1689，平均蛋白數(shù)1431種 (特異性肽段數(shù)量≥1)，含有轉(zhuǎn)錄因子193～264種，平均223種；癌旁組中，得到高可信度肽段數(shù)6984～9843，平均高可信度肽段數(shù)8756；鑒定到蛋白數(shù)為1236～1590，平均蛋白數(shù)1383種 (特異性肽段數(shù)量≥1)，含有轉(zhuǎn)錄因子182～207種，平均191種TF(見表1)。所富集到的TF包含了bZIP(Basic Leucine Zipper family)、ETS(E-twenty six)、HMG-box (High Mobility Group box family)、HLH(basic helix-loop-helix family)、FOX(Forkhead box family)、HOMEO(Homeobox family)、NHR(Nuclear hormone receptors family)、ZNF(Zinc finger family)以及p53 等各家族的TF。

表1 肺癌組織及癌旁組織轉(zhuǎn)錄因子鑒定對比

我們既往通過catTFRE對人類的HeLa、MCF-7及小鼠的Miliver等11個細胞系的TF進行富集，每個細胞系在肽段萃取后分為12個組分，質(zhì)譜鑒定時間為16小時。檢測到單個細胞系的TF從207到460 種，平均290種[14]。同時，為了提高效率及節(jié)約經(jīng)濟成本，本研究中組織樣品經(jīng)肽段萃取后僅分為3個組分，質(zhì)譜鑒定時間縮短為6小時，鑒定的TF基本上就可以達到細胞水平。此外，由于TF在細胞內(nèi)的表達豐度極低(僅占細胞總蛋白的0.001%～0.01% )[14]，而本研究中每組鑒定到的TF的總量(iBAQ)值約占每組鑒定到的蛋白總量的10%以上。說明catTFRE確實可以對癌及癌旁組織中的TF進行有效富集。

二、差異表達蛋白及差異表達轉(zhuǎn)錄因子

應(yīng)用基于強度的絕對定量方法(iBAQ)，對鑒定到的蛋白質(zhì)進行定量，依照兩組間iBAQ 值之間的比值對蛋白及TF的表達量變化進行評定。肺癌組與癌旁組相比，表達上調(diào)的蛋白和TF(iBAQ 比值>3，同時鑒定到的肽段數(shù)>3個)分別有378種和有108(見表2)種，表達下調(diào)的蛋白和TF(iBAQ 比值小于0.33，同時鑒定到的肽段數(shù)>3個)分別有245種和50種(見表3)。

對于這些差異表達的TF，通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)，有許多已經(jīng)被報道與肺癌或者與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。如UHRF1在多種癌癥中過表達，以其在維持DNMT1介導(dǎo)的DNA甲基化中的積極作用而聞名，并通過促進細胞增殖及在癌細胞的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[18]。有研究[19]指出FOXA1通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，在肺癌轉(zhuǎn)移的早期是一種重要的負性調(diào)節(jié)劑。NFATc1是一種調(diào)節(jié)破骨細胞生成、T細胞發(fā)育和巨噬細胞功能的轉(zhuǎn)錄因子。通過以獨立于TGF-β信號傳導(dǎo)的方式上調(diào)轉(zhuǎn)錄抑制因子Snail和Zeb1來抑制E-鈣粘蛋白表達，促進腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移[20]。這些差異表達的TF可能就是潛在的生物標志物或可作為治療的靶點，也為接下來的大樣本和深入研究指明了一些方向。

三、差異表達蛋白及轉(zhuǎn)錄因子的信號通路分析

為了對肺癌組織及癌旁組織的分子特征得到更進一步的認識，我們對組織中差異表達蛋白及TF調(diào)節(jié)的信號通路進行了KEGG信號通路分析，結(jié)果顯示，這些差異的表達蛋白及TF，除了在細胞質(zhì)DNA感應(yīng)途徑(Cytosolic DNA-sensing pathway)、Notch信號傳導(dǎo)途徑(Notch signaling pathway)、核苷酸切除修復(fù)(Nucleotide excision repair)、錯配修復(fù)(Mismatch repair)、基底轉(zhuǎn)錄因子(Basal transcription factors)、剪切體(Spliceosome)明顯的富集現(xiàn)象之外，在VEGF信號通路(VEGF signaling pathway)、細胞周期(Cell cycle)、癌癥轉(zhuǎn)錄失調(diào)(Transcriptional misregulation in cancer)等也有明顯的富集現(xiàn)象。對于上述信號通路，有些與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，有些被運用到抗腫瘤的策略中。如研究已證實VEGF信號通路參與腫瘤周圍新生內(nèi)皮細胞的遷移、增殖，在腫瘤周圍血管新生的過程中具有重要的作用。VEGF受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可作為抗腫瘤治療方案的理想靶點[21]。又如Notch信號通路是一條決定細胞命運、保守而重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，影響發(fā)育過程中多種細胞的分化、增殖和凋亡，研究發(fā)現(xiàn)其與肺癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[22]。TF在大多數(shù)人類癌細胞中過分活躍，這讓他們成為抗癌藥物的開發(fā)的目標。研究差異表達蛋白及TF的信號通路，說明它們的確起著關(guān)鍵的作用，為未來深入的研究提供了一些重要的依據(jù)。

表2 上調(diào)TF

表3 下調(diào)TF

討 論

近年來隨著對肺癌研究的不斷深入，對其病因、發(fā)生發(fā)展、治療及預(yù)后知識不斷更新。除了形態(tài)學(xué)特征之外，近年來越來越多的研究致力于尋找能評估和預(yù)警肺癌術(shù)后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的分子標記物、篩選可以為肺癌個體化治療提供依據(jù)的靶點，與肺癌相關(guān)的分子生物學(xué)研究成為肺癌研究的熱點。

低豐度的TF中蘊含著豐富的與疾病相關(guān)的病理信息，通過確保特定基因的正確表達，轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)在控制許多生物過程中起著核心作用，但在樣品的處理過程中，由于與容器表面發(fā)生非特異性結(jié)合及其他溶劑的稀釋，低豐度的蛋白在分離和檢測前就已經(jīng)丟失，如何將其從高豐度的蛋白中分離出來并進行鑒定一直是困擾著我們的一個問題。經(jīng)過不斷的嘗試與努力，我們研發(fā)的catTFRE技術(shù)，極大的提高了TF的富集效率及鑒定效率。本研究證實了在組織水平上catTFRE技術(shù)同樣可以高效富集和鑒定TF，為接下來大樣本、高數(shù)量鑒定肺癌組織的TF提供了技術(shù)支持。本研究還對差異表達的TF及蛋白做了KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)一些通路的確與一些腫瘤相關(guān)，而這些TF及相關(guān)通路可能就是我們未來研究的方向，或許我們可以從中找到肺癌發(fā)生發(fā)展甚至新的治療策略的突破口。

綜上所述，本研究提供的一種高效富集肺癌及癌旁組織轉(zhuǎn)錄因子的方法-catTFRE技術(shù)，并根據(jù)富集到的TF及蛋白復(fù)合物，對肺癌與癌旁組織差異表達TF和蛋白的分析，我們發(fā)現(xiàn)一些TF在肺癌的發(fā)生、發(fā)展的過程中起到調(diào)控作用，TF的表達變化，可能使一些與細胞生長、分裂和增殖有關(guān)的蛋白異常表達而導(dǎo)致增殖失控、凋亡受阻以及侵襲與轉(zhuǎn)移等，使細胞在整個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)上表現(xiàn)出與正常細胞的許多區(qū)別，最終引起肺癌的發(fā)生。通過對肺癌組織及癌旁組織TF的鑒定及分析研究，有助于解釋TF與肺癌發(fā)生之間的關(guān)系，為未來對大規(guī)模肺癌的深入研究提供一些重要的依據(jù)和基礎(chǔ)。