王芳 孔亞洲

肺腺癌是呼吸系統(tǒng)中最常見的腫瘤，具有原位腺癌-微浸潤腺癌-浸潤性腺癌，漸進(jìn)發(fā)展的過程。浸潤性腺癌具有明顯的侵襲性，生物學(xué)行為不良，近年研究認(rèn)為腫瘤細(xì)胞中不同蛋白表達(dá)失調(diào)是其進(jìn)展的重要因素[1]。同源盒蛋白SIX-6(SIX-6)是機(jī)體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白中的一種，對細(xì)胞增殖的作用較強(qiáng)，并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)轉(zhuǎn)移[2]?；|(zhì)金屬蛋白酶-14(MMP-14)是轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白，是MMPs家族中的重要成員，是膜型基質(zhì)金屬蛋白酶，在腫瘤細(xì)胞中分泌增多，可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，使腫瘤轉(zhuǎn)移的通路打開，為轉(zhuǎn)移提供直捷能通路[3]。肺腺癌中SIX-6和MMP-14的檢測尚未見報道，本研究檢測肺腺癌中SIX-6和MMP-14的表達(dá)，分析其相關(guān)性及對判斷預(yù)后的價值。

資料與方法

一、標(biāo)本與資料

本研究為前瞻性研究。研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。選擇2013.5-2015.3期間在我院經(jīng)病理確診為肺腺癌并行根治術(shù)的患者作為觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床相關(guān)資料完整；②符合WHO中病理診斷標(biāo)準(zhǔn)；③家屬簽屬知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①肺部手術(shù)史；②有遺傳性疾病者；③術(shù)前行放、化療者。共觀察85例，其中男41例，女44例，年齡42～84歲，平均54.5歲。選擇42例肺微浸潤性腺癌作為對照組1，其中男22例，女20例，年齡44～80歲，平均55.7歲。選擇42例肺原位腺癌作為對照組2，其中男23例，女19例，年齡42～79歲，平均53.4歲。選擇觀察組中距腫物邊緣大于3厘米的正常肺組織42例作為對照組3，其中男21例，女21例，年齡43～81歲，平均56.5歲。組間的一般資料比較中無明顯差別，具有可比性(經(jīng)卡方檢驗和方差分析P>0.05)(見表1)。

表1 四組基線資料的比較

二、SIX-6和MMP-14表達(dá)

術(shù)后標(biāo)本均常規(guī)福爾馬林固定、脫水及石蠟包埋后切取4μm切片。SIX-6和MMP-14的檢測均基于石蠟包埋的組織。SIX-6和MMP-14均購自蘇州睿瀛生物技術(shù)公司，試劑均為濃縮液，預(yù)實驗判斷顯色最佳的濃度(SIX-6為1∶150，MMP-14為1∶200)。正式實驗應(yīng)用免疫組化二步法，DAB顯色，嚴(yán)格按說明操作，減少人為誤差，做好質(zhì)控。

三、SIX-6和MMP-14結(jié)果評定

SIX-6陽性表達(dá)部位是細(xì)胞漿，MMP-14的陽性表達(dá)部位是細(xì)胞漿和(或)細(xì)胞膜。以著色強(qiáng)度和陽性率二維角度進(jìn)行綜合評定陽性，即：著色強(qiáng)度：無0分；弱1分，中等2分，強(qiáng)3分。選擇上皮細(xì)胞集中的區(qū)域進(jìn)行陽性率的判斷(400倍視野)：以<5%為0分，6～10%為1分，11～30%為2分，31～50%為3分，>51%為4分。二者相乘，以≤4分計為陰性，以>4分計為陽性，計算陽性率。

四、統(tǒng)計學(xué)措施

應(yīng)用SPSS 17.0分析，組間率的比較行卡方檢驗，定量資料的組間比較采用t檢驗、多組間的兩兩比較采用P值修正的方法(P<0.0083才能認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異)。對數(shù)據(jù)進(jìn)行線性相關(guān)性分析及生存分析。所以統(tǒng)計均為雙側(cè)檢測以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、四組中SIX-6和MMP-14的比較

四組中SIX-6和MMP-14的陽性率差別有統(tǒng)計學(xué)意義。(見圖1～8，表1、2)。

二、SIX-6和MMP-14在肺腺癌不同臨床特征分組中的比較

肺腺癌中SIX-6和MMP-14的表達(dá)與病理形態(tài)、脈管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)，SIX-6的表達(dá)與增殖指數(shù)、肺膜累犯相關(guān)，MMP-14的表達(dá)與腫瘤最大徑相關(guān)。二者的表達(dá)與性別、年齡及吸煙等因素?zé)o關(guān)(見表3)。

表2 四組中SIX-6和MMP-14陽性率的比較

注：組間比較進(jìn)行概率分割，即P值修正的方法。*vs對照組1,#vs對照組2,&vs對照組3P均<0.0083。

圖1 SIX-6在正常肺組織中陰性表達(dá)(IHC ×100) 圖2 SIX-6在原位腺癌中陰性表達(dá)(IHC 100倍) 圖3 SIX-6在肺微浸潤性腺癌中陽性表達(dá)(IHC ×100) 圖4 SIX-6在肺腺癌中陽性表達(dá)(IHC ×200) 圖5 MMP-14在正常肺組織中陰性表達(dá)(IHC ×100) 圖6 MMP-14在原位腺癌中陰性表達(dá)(IHC ×100) 圖7 MMP-14在肺微浸潤性腺癌中陽性表達(dá)(IHC ×200) 圖8 MMP-14在肺腺癌中陽性表達(dá)(IHC ×400)

表3 肺腺癌不同分組中SIX-6和MMP-14的陽性率比較

三、觀察組中SIX-6和MMP-14表達(dá)的相關(guān)性分析

線性相關(guān)分析顯示觀察組中SIX-6和MMP-14呈正相關(guān)(r=0.43，P=0.034)。

四、觀察組中SIX-6和MMP-14表達(dá)與生存時間的關(guān)系

對患者增加病例數(shù)到402例進(jìn)行隨訪，隨訪患者術(shù)后的生存時間為4～60個月，平均20.4個月。其中SIX-6陽性為203例，陰性為199例，MMP-14陽性為197例，陰性為205例。經(jīng)生存分析顯示SIX-6和MMP-14的表達(dá)與生存時間相關(guān)(P<0.05)，即二者高表達(dá)患者的預(yù)后差(見圖9～10)。

圖9 SIX-6蛋白的表達(dá)與生存時間的有關(guān)系

圖10 MMP-14蛋白的表達(dá)與生存時間的有關(guān)系

討 論

肺腺癌發(fā)生過程與肺泡上皮的不典型增生有關(guān)，病變具有多種類型，最常見的為腺泡型、貼壁生長型、乳頭型、微乳頭型及實體型。部分病例對肺膜可有累犯，并可對周圍組織形成明顯的侵襲，也可伴有淋巴道播散和遠(yuǎn)隔器官的轉(zhuǎn)移。腫瘤間質(zhì)中可以觀察到炎細(xì)胞浸潤和纖維化等間質(zhì)反應(yīng)[4]。MMPs既可以降解細(xì)胞外基質(zhì)、基底膜和IV型膠原，還對細(xì)胞的異位定植有重要作用[5]。MMP-14是間質(zhì)的溶解素，結(jié)構(gòu)特征是有N-末端前導(dǎo)肽、催化和C-末端血紅素結(jié)構(gòu)域，其對纖維連接蛋白的降解作用明顯。研究顯示正常肺泡上皮常無明顯的MMP-14的分泌，其常為陰性表達(dá)，在腫瘤性病變時MMP-14的生成明顯增多，在上皮細(xì)胞質(zhì)中高表達(dá)，與鋅和半胱氨酸連接的失控有關(guān)[6]。MMP-14還能通過絲氨酸蛋白酶降解因子及MMP-2等發(fā)揮轉(zhuǎn)移促進(jìn)作用[7]。MMP-14可以抑制細(xì)胞的凋亡，提高腫瘤的活性作用。SIX-6是近年發(fā)現(xiàn)的與多種組織器官發(fā)育有關(guān)的蛋白[8-9]，其在成熟組織和細(xì)胞中表達(dá)少，在細(xì)胞異型增生后表達(dá)上調(diào)。研究認(rèn)為SIX-6轉(zhuǎn)錄過程中能調(diào)控多種促癌基因的表達(dá)，如對cyclinAl表達(dá)進(jìn)行上調(diào)，有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的失控性增生[10-11]。近年也有研究認(rèn)為SIX-6能增強(qiáng)TGF的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)血管內(nèi)皮生成因子(VEGF)的分泌，調(diào)控腫瘤間質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，促進(jìn)脈管生成[12]。SIX-6可以促進(jìn)上皮細(xì)胞粘附作用的下降，引起細(xì)胞間連接的不穩(wěn)定，促進(jìn)轉(zhuǎn)移的發(fā)生。也有研究顯示SIX-6可以促進(jìn)上皮間質(zhì)的轉(zhuǎn)化，SIX-6引起腫瘤浸潤的前沿枝芽狀細(xì)胞表達(dá)間葉源性標(biāo)志物，使上皮和間充質(zhì)的抗原表達(dá)具有相似性[13]。

本研究結(jié)果顯示四組中SIX-6和MMP-14的表達(dá)差別有統(tǒng)計學(xué)意義，提示二者在原位癌到浸潤性腺癌發(fā)展過程中的促進(jìn)作用明顯，SIX-6和MMP-14的作用類似癌基因，SIX-6對腺癌的作用可能更直接。結(jié)果顯示SIX-6和MMP-14的表達(dá)與病理形態(tài)、脈管浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示二者表達(dá)上調(diào)可以促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展及播散。SIX-6的表達(dá)與增殖指數(shù)和肺膜累犯相關(guān)，提示SIX-6可以促進(jìn)腫瘤的增殖和肺膜累犯，SIX-6對細(xì)胞增殖的作用與促進(jìn)PCNA和CyclinA1活性直接相關(guān)，SIX-6可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的局部侵襲，使其呈枝芽狀浸潤及局部播散。MMP-14可能對腫瘤生長有一定作用，但是其主要作用是降解腺癌細(xì)胞周圍的基底膜，使腫瘤細(xì)胞能穿過基底膜，形成轉(zhuǎn)移灶。線性相關(guān)分析顯示觀察組中SIX-6和MMP-14呈正相關(guān)，提示二者具有正向協(xié)同作用，SIX-6可能是上游蛋白，高表達(dá)后促進(jìn)MMP-14的分泌，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移。SIX-6對腫瘤細(xì)胞遷移的調(diào)控作用還表現(xiàn)為對基質(zhì)金屬蛋白酶的調(diào)節(jié)上，使腫瘤間質(zhì)中轉(zhuǎn)移的屏障作用減弱或消失[14]。SIX-6對腫瘤的調(diào)節(jié)作用還表現(xiàn)為抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，使細(xì)胞具有“永生化”的特征[15]。因此SIX-6的作用較SIX家族中其它成員的作用可能更廣泛，其調(diào)控腫瘤進(jìn)展的通路更多。SIX-6能通過調(diào)節(jié)核因子-κB等分子生物學(xué)途徑發(fā)揮作用，核因子-κB在激活后可以加速腫瘤細(xì)胞的遷移[16]。還有研究顯示其它因子可以調(diào)節(jié)MMP-14蛋白的表達(dá)，如FSCN1和HIF-1a等[4,7]。因此SIX-6和MMP-14的作用機(jī)制可能更復(fù)雜，需要更多的實驗來驗證其調(diào)控的具體過程。本實驗在一定程度上證實了SIX-6和MMP-14表達(dá)與生存時間的關(guān)系，檢測二者的表達(dá)與預(yù)后可能有關(guān)，但是具體應(yīng)用需要進(jìn)一步增加病例，并經(jīng)過多中心研究并進(jìn)行統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析后證實。但是我們在實驗中也發(fā)現(xiàn)，本研究僅在蛋白水平上觀察了SIX-6和MMP-14的表達(dá)，其mRNA水平和DNA水平的研究可能對證實本研究更有意義，后繼研究我們將針對SIX-6和MMP-14表達(dá)的分子水平進(jìn)行關(guān)注，并探討其更多的影響因素對SIX-6和MMP-14的干擾作用，多層次、多角度闡明SIX-6和MMP-14在肺腺癌中的臨床意義及作用機(jī)理。

總之，肺腺癌中SIX-6和MMP-14表達(dá)升高可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展，二者有一定的相關(guān)性，聯(lián)合檢測SIX-6和MMP-14表達(dá)可能對判斷預(yù)后有一定價值。