趙剛，武青生，趙延禮，馬生彪，王巍，穆元忠

1 青海省第五人民醫(yī)院，西寧810000；2 青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院

直腸癌是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，根治性手術(shù)是臨床治療直腸癌的主要策略，但由于直腸解剖位置復(fù)雜，手術(shù)不易徹底清除，術(shù)后復(fù)發(fā)率高。為延長(zhǎng)直腸癌患者的生存期，常常輔以放療。然而，由于部分患者出現(xiàn)放療抵抗，大大降低了放療效果。因此，探究如何減少放療抵抗，提高放射敏感性并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡具有重要意義。近年來(lái)多項(xiàng)研究[1]表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞放療敏感性相關(guān)。研究[2]顯示，lncRNA睪丸發(fā)育相關(guān)基因1(TDRG1)在子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、精原細(xì)胞瘤等多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和化療耐藥密切相關(guān)。但lncRNA TDRG1和放療敏感性的相關(guān)研究較少。本研究觀察了lncRNA TDRG1、微小RNA-194-3p(miR-194-3p)在直腸癌組織中的表達(dá)變化，及其對(duì)直腸癌細(xì)胞凋亡、放療敏感性的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 直腸癌細(xì)胞和試劑 人直腸癌細(xì)胞系SW1643購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，Qiagen RNeasy Mini試劑盒、SYBR Green Master Mix購(gòu)自杭州沃森生物技術(shù)有限公司，DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、青鏈霉素溶液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，PCR引物、lncRNA TDRG1小干擾RNA序列si-TDRG1及其對(duì)照si-NC、miR-194-3p mimics及其對(duì)照miR-NC、miR-194-3p抑制物anti-miR-194-3p及其對(duì)照anti-miR-NC購(gòu)自上海英駿公司，膜聯(lián)蛋白V異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)裂解緩沖液購(gòu)于上海碧云天生物公司；兔源B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體、山羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)CST公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman公司。

1.2 直腸癌組織和癌旁組織的收集及組織中l(wèi)ncRNA TDRG1、miR-194-3p檢測(cè) 本研究共收集30對(duì)直腸癌組織及與其對(duì)應(yīng)的癌旁組織(距離癌灶5 cm以上的腸壁組織)，樣本均經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行手術(shù)切除，并經(jīng)病理學(xué)確診。所有樣本采集者均簽署知情同意書(shū)，并獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。采用RNeasy Mini試劑盒分別從直腸癌組織、癌旁組織中分離總RNA，利用ThermoScript RT-PCR系統(tǒng)將2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并利用SYBR Green Master Mix和roche Light Cycler 96進(jìn)行定量PCR。引物序列如下：TDRG1上游引物為5′-TCTTCCCTGGCTTGGC-3′，下游引物為5′-TGGGCTCTTTCGTGGC-3′；miR-194-3p上游引物為5′-ACACTCCCAGUGGGGCUG-3′，下游引物為5′-CAGAUAACAGTTGAGAGTACAT-3′；GAPDH上游引物為5′-CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3′，下游引物為5′-GCGCCCAATACGACCAAATC-3′；U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCG-3′。以U6和GAPDH為內(nèi)參，以2-ΔΔCt表示組織中l(wèi)ncRNA TDRG1、miR-194-3p的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 lncRNA TDRG1靶基因預(yù)測(cè)驗(yàn)證 使用LncBase Predicted v.2在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站分析lncRNA TDRG1的靶基因，發(fā)現(xiàn)lncRNA TDRG1的序列中含有與miR-194-3p互補(bǔ)的核苷酸序列，提示lncRNA TDRG1直接靶向miR-194-3p。采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證lncRNA TDRG1的靶基因：構(gòu)建含有miR-194-3p結(jié)合位點(diǎn)的野生型熒光素酶報(bào)告基因載體WT-TDRG1、含有miR-194-3p結(jié)合位點(diǎn)突變序列的突變型熒光素酶報(bào)告基因載體MUT-TDRG1，將miR-194-3p mimics、miR-NC分別與WT-TDRG1、MUT-TDRG1共轉(zhuǎn)染至SW1643細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定熒光素酶活性。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 SW1643細(xì)胞采用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)液置于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SW1643細(xì)胞按照2×105個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑分別將si-TDRG1、si-NC、miR-194-3p mimics、miR-NC、si-TDRG1+anti-miR-194-3p、si-TDRG1+anti-miR-NC分別轉(zhuǎn)染SW1643細(xì)胞，分別記為si-TDRG1組、si-NC組、miR-194-3p組、miR-NC組、、si-TDRG1+anti-miR-194-3p組si-TDRG1+anti-miR-NC組，轉(zhuǎn)染48 h后檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，合格后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

1.5 各組細(xì)胞凋亡率測(cè)算 采用流式細(xì)胞術(shù)。各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞并重懸于結(jié)合緩沖液中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL。取100 μL細(xì)胞懸液，按照Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明，檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=(早期凋亡數(shù)+晚期凋亡數(shù))/細(xì)胞總數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6 各組細(xì)胞中Bcl-2、Bax蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。取各組細(xì)胞，RIPA裂解緩沖液裂解細(xì)胞，獲得細(xì)胞蛋白。配置濃縮膠和分離膠，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細(xì)胞蛋白，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，并在5%牛血清蛋白中于室溫封閉1 h。封閉后，將膜置于1∶1 000稀釋的Bcl-2、Bax、GAPDH抗體溶液中孵育1 h，TBST洗膜，將膜置于相應(yīng)的1∶1 000稀釋的二抗溶液中孵育1 h。采用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯影，Image J軟件進(jìn)行光密度測(cè)定，以目的蛋白和GAPDH光密度值比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.7 各組細(xì)胞放療敏感性測(cè)算 采用克隆形成實(shí)驗(yàn)。將各組細(xì)胞接種到6孔板，分別采用0、2、4、6、8 Gy劑量射線照射細(xì)胞，照射后將各組細(xì)胞置于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)、甲醇固定、結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)≥50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，計(jì)算細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)，并利用GraphPadPrism 5軟件繪制每個(gè)實(shí)驗(yàn)的存活曲線，計(jì)算放射增敏比(SER)。SER是反應(yīng)放射敏感性的主要參數(shù)。SER>1表示放射敏感性增強(qiáng)，SER<1表示放射敏感性降低。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 直腸癌組織和癌旁組織中l(wèi)ncRNA TDRG1、miR-194-3p相對(duì)表達(dá)量比較 直腸癌組織中l(wèi)ncRNA TDRG1、miR-194-3p的相對(duì)表達(dá)量分別為3.15±0.33、0.58±0.05，癌旁組織中l(wèi)ncRNA TDRG1、miR-194-3p的相對(duì)表達(dá)量分別為1.01±0.08、1.00±0.09，兩者相比，P均<0.05。

2.2 lncRNA TDRG1靶基因驗(yàn)證結(jié)果 轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-TDRG1、miR-194-3p mimics的SW1643細(xì)胞熒光素酶活性為0.36±0.04，轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-TDRG1、miR-NC的SW1643細(xì)胞熒光素酶活性為1.00±0.09，兩者相比，P<0.05；轉(zhuǎn)染MUT-TDRG1、miR-194-3p mimics的SW1643細(xì)胞熒光素酶活性為1.01±0.09，轉(zhuǎn)染MUT-TDRG1、miR-NC的SW1643細(xì)胞熒光素酶活性為0.99±0.08，兩者相比，P>0.05。

2.3 各組細(xì)胞凋亡率比較 si-TDRG1組、si-NC組細(xì)胞凋亡率分別為22.14%±2.21%、6.98%±0.65%，兩組相比，P<0.05。miR-194-3p組、miR-NC組細(xì)胞凋亡率分別為19.65%±1.84%、7.12%±0.71%，兩組相比，P<0.05。si-TDRG1+anti-miR-194-3p組、si-TDRG1+anti-miR-NC組細(xì)胞凋亡率分別為13.47%±1.35%、23.34%±2.33%，兩組相比，P<0.05。

2.4 各組細(xì)胞中Bcl-2、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 si-TDRG1組Bcl-2、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.32±0.03、0.68±0.06，si-NC組Bcl-2、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.72±0.07、0.23±0.03，兩組相比，P均<0.05。miR-194-3p組Bcl-2、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.37±0.03、0.62±0.06，miR-NC組Bcl-2、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.74±0.07、0.22±0.03，兩組相比，P均<0.05。si-TDRG1+anti-miR-194-3p組Bcl-2、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.62±0.05、0.35±0.03，si-TDRG1+anti-miR-NC組Bcl-2、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.31±0.03、0.69±0.05，兩組相比，P均<0.05。

2.5 各組細(xì)胞放療敏感性比較 si-TDRG1組、si-NC組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)分別為0.330、0.657，SER為2.016。miR-194-3p組、miR-NC組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)分別為0.370、0.669，SER為1.913。si-TDRG1+anti-miR-194-3p組、si-TDRG1+anti-miR-NC組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)分別為0.547、0.320，SER為0.574。

3 討論

越來(lái)越多的研究[3，4]證實(shí)，許多l(xiāng)ncRNA在直腸癌發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。本研究通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)證實(shí)，直腸癌組織中l(wèi)ncRNA TDRG1的表達(dá)較其鄰近正常組織顯著升高，并通過(guò)功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)lncRNA TDRG1在直腸癌中具有致癌因子作用，干擾lncRNA TDRG1表達(dá)可誘導(dǎo)直腸癌細(xì)胞SW1643凋亡、降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)、升高促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平，并提高其放療敏感性。與本研究結(jié)果類似，lncRNA TDRG1在宮頸癌、卵巢癌等惡性腫瘤中均發(fā)揮致癌作用。研究[5]顯示，宮頸癌組織和癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA TDRG1的表達(dá)明顯增加，其高表達(dá)促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖和遷移。lncRNA TDRG1高表達(dá)與精原細(xì)胞瘤的惡性生物學(xué)行為和腫瘤分期具有相關(guān)性，干擾lncRNA TDRG1表達(dá)可降低NTERA-2細(xì)胞增殖和侵襲能力，并提高其凋亡水平。此外，干擾lncRNA TDRG1表達(dá)還可提高精原細(xì)胞瘤TCam-2細(xì)胞對(duì)順鉑的化學(xué)敏感性[6]。以上研究說(shuō)明，干擾lncRNA TDRG1表達(dá)可促進(jìn)直腸癌細(xì)胞凋亡，并提高其放療敏感性。

研究[7]顯示，lncRNA中含有miRNA結(jié)合位點(diǎn)，可通過(guò)發(fā)揮miRNA海綿作用拮抗其功能。研究[5]發(fā)現(xiàn)，lncRNA TDRG1通過(guò)海綿作用拮抗miR-330-5p對(duì)ELK1的抑制作用，從而促進(jìn)宮頸癌進(jìn)展。為揭示TDRG1在直腸癌中的作用機(jī)制，采用生物信息學(xué)網(wǎng)站LncBase Predicted v.2在線預(yù)測(cè)miR-194-3p與lncRNA TDRG1之間存在潛在結(jié)合位點(diǎn)，隨后通過(guò)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)確定miR-194-3p為lncRNA TDRG1在直腸癌細(xì)胞SW1643中的靶miRNA。先前研究[8]表明，miR-194-3p在膠質(zhì)瘤中具有抑癌因子作用，過(guò)表達(dá)miR-194-3p可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的干細(xì)胞特性。同時(shí)，過(guò)表達(dá)miR-194-3p還可增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞放療敏感性和細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞遷移、侵襲和增殖，并抑制裸鼠成瘤。此外，過(guò)表達(dá)miR-194-3p還可抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖和遷移。本研究結(jié)果顯示，直腸癌組織中miR-194-3p呈低表達(dá)，且lncRNA TDRG1能負(fù)性調(diào)控miR-194-3p表達(dá)，于是推測(cè)miR-194-3p在直腸癌中具有抑癌作用。進(jìn)一步功能實(shí)驗(yàn)顯示，過(guò)表達(dá)miR-194-3p促進(jìn)直腸癌細(xì)胞SW1643凋亡、抑制Bcl-2表達(dá)、促進(jìn)Bax表達(dá)，并提高SW1643細(xì)胞放療敏感性。此外，抑制miR-194-3p表達(dá)可逆轉(zhuǎn)干擾lncRNA TDRG1對(duì)SW1643細(xì)胞凋亡和放療敏感性的影響。以上研究提示，lncRNA TDRG1通過(guò)靶向調(diào)控miR-194-3p影響直腸癌細(xì)胞的凋亡和放療敏感性。

綜上所述，直腸癌組織中l(wèi)ncRNA TDRG1高表達(dá)、miR-194-3p低表達(dá)；干擾lncRNA TDRG1表達(dá)和過(guò)表達(dá)miR-194-3p均可誘導(dǎo)直腸癌細(xì)胞SW1643凋亡、降低Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量、升高Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量、增強(qiáng)放療敏感性；干擾miR-194-3p表達(dá)可逆轉(zhuǎn)干擾lncRNA TDRG1對(duì)SW1643細(xì)胞凋亡和放療敏感性的影響。干擾lncRNA TDRG1可能是通過(guò)靶向miR-194-3p促進(jìn)直腸癌細(xì)胞凋亡，并提高其放療敏感性，lncRNA TDRG1有望成為提高直腸癌放療敏感性的治療靶點(diǎn)。