孫紅英,辛全偉,林興生,羅海凌,林 輝,嚴少娟,4,劉文莉,蘭思仁

1 福建農(nóng)林大學國家菌草工程技術研究中心,福州 350002 2 福建農(nóng)林大學林學博士后科研流動站,福州 350002 3 福建農(nóng)林大學林學院,福州 350002 4 福建農(nóng)林大學資源與環(huán)境學院,福州 350002 5 臺州學院建筑工程學院,臺州 318000

人工濕地是一種強化自然過程的污水處理工程系統(tǒng),通過微生物轉(zhuǎn)化和植物吸收等途徑去除污水中各種污染物,如碳、氮和磷等[1]。人工濕地的建設、運行成本低,處理效果好,是一種綠色、有效的污水處理技術[2]。雖然有很多優(yōu)點,但由于污水中的碳含量較高,人工濕地也會釋放一定量的甲烷[3]。甲烷的全球變暖潛力是二氧化碳的28倍,是造成大氣變暖的最重要的溫室氣體之一[4]。此外,甲烷還通過其他化學反應對氣候產(chǎn)生間接影響[5]。因此,人工濕地的甲烷排放受到越來越多的關注。

甲烷排放是由甲烷產(chǎn)生和甲烷氧化共同決定的[6]。在人工濕地中,植物和微生物共同作用于甲烷的產(chǎn)生和氧化過程。植物在甲烷排放中扮演著重要的角色(I)通過植物根系為產(chǎn)甲烷菌提供可用的有機碳[7]；(II)將氧氣輸送到根際,從而抑制甲烷生成和增強甲烷氧化成二氧化碳[8]；(III)通過通氣組織傳輸甲烷[9]。除了植物,微生物在人工濕地中起著關鍵作用,決定了甲烷過程速率[10]。產(chǎn)甲烷菌和甲烷氧化菌分別是甲烷產(chǎn)生和氧化的微生物[11]。產(chǎn)甲烷菌是在有機物的厭氧降解過程產(chǎn)生甲烷[6],甲烷氧化菌僅利用甲烷為碳源和能源,將甲烷氧化成二氧化碳[9]。產(chǎn)甲烷菌相關的甲基輔酶M還原酶基因(mcrA)和甲烷氧化菌相關的甲烷氧化單加氧酶基因(pmoA)作為功能基因,分別可以定量產(chǎn)甲烷菌和甲烷氧化菌[6]。此外,其他因素如進水C/N比在甲烷排放中也起著關鍵作用[12]。

一些研究發(fā)現(xiàn),有植物的人工濕地系統(tǒng)比無植物的人工濕地系統(tǒng)排放更高強度的甲烷[13],也有研究發(fā)現(xiàn)人工濕地植物種類對甲烷排放有不同影響[6]。一些植物會促進甲烷排放,另一些植物會減少甲烷排放[14]。這些結(jié)果可能是由于不同的植物種類造成的,因為植物可以為微生物提供氧氣和有機物[15],調(diào)節(jié)甲烷過程。不同植物的代謝周期、氧氣釋放及通氣組織結(jié)構(gòu)和數(shù)量可能不同[16-17]。最近,在人工濕地中增加了植物多樣性設計,表明植物多樣性提高氮去除效率[18-20],增強微生物生物量和酶活性[21]、增加植物生物量[20,22]。然而,據(jù)我們所知,只有少數(shù)研究關注植物多樣性對甲烷排放的影響,并且,植物多樣性對甲烷排放的影響還存在爭議。一項研究發(fā)現(xiàn)植物多樣性促進甲烷排放[23],而另外兩項研究發(fā)現(xiàn)植物多樣性不影響甲烷排放[20,24]。所有這些研究都只測定了人工濕地甲烷釋放強度,未涉及甲烷過程相關功能基因等機理方面的內(nèi)容,也未分析植物豐富度與植物種類對甲烷釋放的相對貢獻比例,而且這些研究都是在低碳氮比水平(C/N<1∶1)的生境中進行的。入水碳氮比在微生物和甲烷排放中起著至關重要的作用。許多研究表明,中等比例的C/N比最有利于人工濕地甲烷的低水平排放和高營養(yǎng)去除[12,25-26]。目前尚不清楚,在C/N比率處于中間水平的生境中,植物多樣性對人工濕地甲烷排放及其功能基因豐度的影響。

針對上述問題,我們在中國東南部的福建省福州市福建農(nóng)林大學構(gòu)建了實驗尺度的人工濕地微宇宙系統(tǒng),配置了千屈菜單種系統(tǒng)、海壽花單種系統(tǒng)、千屈菜和海壽花混種系統(tǒng),研究(1)人工濕地處理中C/N比廢水時,植物多樣性是否影響系統(tǒng)甲烷排放？(2)人工濕地處理中C/N比廢水時,植物多樣性是否影響產(chǎn)甲烷菌和甲烷氧化菌的功能基因豐度？(3)如果植物多樣性影響系統(tǒng)甲烷排放,植物豐富度與植物種類對甲烷釋放的相對貢獻比例如何？(4)如果植物多樣性影響系統(tǒng)甲烷排放,甲烷排放是否與產(chǎn)甲烷菌功能基因豐度、甲烷氧化菌功能基因豐度和系統(tǒng)氮去除效率一致。

1 材料與方法

1.1 實驗設計

2017年1—9月,在福建省福州市福建農(nóng)林大學校園實驗基地(120° 05′ E,30° 18′ N)設計了一套垂直流人工濕地微宇宙系統(tǒng)。為保證植物根系有充足的生長空間,人工濕地微宇宙采用正方體設計(長 × 寬 × 高 = 45 cm × 45 cm × 45 cm),并填充用自來水清洗過的河沙作為培養(yǎng)基質(zhì),填充深度為30 cm。選取了千屈菜(LythrumsalicariaL.)和海壽花(PontederiacordataL.)2種人工濕地常用、景觀效果好的植物。2017年3月初,從園藝公司購買了兩種植物的幼苗。選取生長健壯、株高、體積、長勢基本一致的幼苗,分別配置了2個單種處理和1個兩物種混種處理,每個處理重復3次。每個人工濕地微宇宙系統(tǒng)隨機種植12棵植物,混種系統(tǒng)中的兩種植物隨機分布且棵數(shù)相同,均為6棵。

本實驗用的模擬污水是在霍格蘭營養(yǎng)液的基礎上加以調(diào)整,即無機氮濃度為112 mg/L,硝銨比為1∶1。在此基礎上,我們添加葡萄糖作為碳源,碳氮比為5∶1。依據(jù)人工濕地的水力停留時間,我們每10 d注入一次污水,使水面高于沙面5 cm。

1.2 取樣與分析

采用國際通用的靜態(tài)氣密箱和氣象色譜技術檢測系統(tǒng)的甲烷通量。氣密箱是由聚氯乙烯材料定制的圓柱箱體,其尺寸(高120 cm,直徑44 cm)是根據(jù)本實驗人工濕地微宇宙的尺度和所種植植物的高度確定。按照Zhang等[23]的方法,我們于2017年8月26日,采集了每個人工濕地微宇宙的氣體樣品。氣體樣品在氣象色譜7890B(Agilent 7890B,USA)上測定。

2017年8月27日,我們依次打開每個微宇宙系統(tǒng)的出水開關,收集出水樣品。水樣暫存于4℃冰箱,用于測定水樣中的碳氮濃度。隨后,從各個微宇宙系統(tǒng)收獲整株植物樣品。之后,采集每個微宇宙系統(tǒng)的基質(zhì)樣品,每個系統(tǒng)隨機采集5個點,然后混合成一個基質(zhì)樣品?；|(zhì)樣品暫存于4℃冰箱和 -20℃冰柜中,分別用于定量基質(zhì)中微生物生物量和甲烷功能基因。植物樣品于65℃烘干至恒重,用于計算植物生物量?；|(zhì)微生物生物量采用氯仿熏蒸-總有機碳分析儀(TOC-L,Japan)測定。水樣中的硝態(tài)氮和銨態(tài)氮濃度用全自動間斷分析儀(Smart Chen 200,Italy)測定,水樣中的總有機碳濃度用總有機碳分析儀(TOC-L,Japan)測定。

1.3 DNA提取與實時熒光定量PCR

用Soil DNA kits DcP336 (TIANGEN,China)試劑盒提取和純化基質(zhì)樣品基因組DNA,具體方法步驟參照試劑盒說明。用1%瓊脂糖凝膠電泳對所提取的基質(zhì)DNA樣品質(zhì)量進行檢測?；|(zhì)DNA樣品暫存于-20 ℃冰箱保存,待分析。

對基質(zhì)樣品中的產(chǎn)甲烷菌相關的甲基輔酶M還原酶基因(mcrA)和甲烷氧化菌相關的甲烷氧化單加氧酶基因α亞基(pmoA)進行絕對定量分析。用于mcrA基因擴增的引物序列分別為mcrA上游引物5′-CAAAGGGAACCCAGGAAGT-3′和mcrA下游引物5′-GCAGGTCGTAGCCGAAGA-3′。用于pmoA基因擴增的引物序列分別為上游引物5′-GGNGACTGGGACTTCT-GG-3′和下游引物5′-GGTAARGACGTTGCNCCGG-3′。

利用ABI7500 (Applied Biosystems,USA)測定產(chǎn)甲烷菌mcrA基因和甲烷氧化菌pmoA基因的拷貝數(shù)。簡短的講就是：反應體系(20 μL)：10 μL 2 × Master Mix,0.5 μL 上游特異引物 (10 μmol/L),0.5 μL 下游特異引物(10 μmol/L),2 μL DNA模板,7 μL水。PCR反應條件為：95 ℃,30 s；40個PCR循環(huán)(95 ℃,5 s,60 ℃,40 s(收集熒光))。為了建立PCR產(chǎn)物的溶解曲線,擴增反應結(jié)束后,按(95 ℃,10 s,60 ℃,60 s,95 ℃,15 s),并從60 ℃緩慢加熱到99 ℃(儀器自動進行-Ramp Rate 為0.05 ℃ /s)。最后結(jié)合土壤干土百分數(shù)計算基因拷貝數(shù)(copies/g dried weight (dw)soil)。

1.4 植物豐富度和植物種類對各響應變量的相對貢獻分析

參照Graham等[27]和Duffy等[28]方法,對混種系統(tǒng)與單種系統(tǒng)有顯著差異的指標進行植物豐富度和植物種類的相對貢獻分析,即先進行單因素方差分析再將該平方和分為單種與混種之間的先驗對比,即豐富度效應,剩余平方和代表植物種類的效應,這兩種效應使用方差分析中誤差的均方MS作為F檢驗的分母,計算植物種類和豐富度效應的大小,ω2表示植物種類或豐富度對總變異的解釋度,ω2的數(shù)值越大表示植物種類或豐富度的作用越強。

1.5 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析均在SPSS 16.0中完成,所有數(shù)據(jù)均用平均值±標準誤表示。采用單因素方差分析比較植物單種系統(tǒng)與混種系統(tǒng)各指標是否存在差異(P=0.05),若差異顯著則進行多重比較(Tukey method)。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物種類和多樣性對甲烷釋放及功能基因豐富的影響

千屈菜單種系統(tǒng)和海壽花單種系統(tǒng)間的甲烷釋放強度分別為5.42 mg CH4m-2d-1和8.51 mg CH4m-2d-1,兩系統(tǒng)間存在顯著差異(圖1,P<0.001)。千屈菜與海壽花混種系統(tǒng)的甲烷釋放強度高于兩物種單種系統(tǒng)的平均值,其釋放強度分別為8.78 mg CH4m-2d-1和6.97 mg CH4m-2d-1(圖1,P<0.001)。此外,混種系統(tǒng)的甲烷釋放強度顯著高于千屈菜單種系統(tǒng),但與海壽花單中系統(tǒng)間無顯著差異(圖1C,P<0.001)。通過植物種類和豐富度對甲烷釋放變異的解釋度(ω2)發(fā)現(xiàn),植物種類和豐富度分別解釋變異的66.0%和29.9%(表1),說明植物種類對甲烷釋放的影響大于植物豐富度。

圖1 植物種類、多樣性和植物種類與多樣性對甲烷釋放的影響Fig.1 Effects of plant species,diversity,plant species and diversity on methane emission植物種類簡寫：Ls (千屈菜),Lythrum salicaria;Pc (海壽花),Pontederia cordata

千屈菜單種系統(tǒng)和海壽花單種系統(tǒng)間的mcrA基因絕對豐度分別為410355.2 copies/g dw soil和759938.3 copies/g dw soil,但兩系統(tǒng)間無顯著差異(圖2,P>0.05)。千屈菜與海壽花混種系統(tǒng)的mcrA基因絕對豐度高于兩物種單種系統(tǒng)的平均值,其絕對豐度分別為977541.6 copies/g dw soil和585146.8 copies/g dw soil(圖2,P<0.001)。通過植物種類和豐富度對mcrA基因絕對豐度變異的解釋度(ω2)發(fā)現(xiàn),植物種類和豐富度分別解釋變異的36.8%和61.9%(表1),說明植物豐富度對mcrA基因絕對豐度的影響大于植物種類。

表1 植物種類及豐富度對各參數(shù)影響的相對貢獻Table 1 The relative contributions of plant species and species richness on various parameters in constructed wetlands

圖2 植物種類對mcrA 和pmoA 絕對豐度的影響與植物多樣性對mcrA 和pmoA 絕對豐度的影響Fig.2 Effects of plant species on absolute abundance of mcrA and pmoA gnen and plant diversity on absolute abundance of mcrA and pmoA gene

千屈菜單種系統(tǒng)和海壽花單種系統(tǒng)間的pmoA基因絕對豐度有顯著差異,分別為305145.3 copies/g dw soil和1782087.6 copies/g dw soil(圖2,P<0.001)。千屈菜與海壽花混種系統(tǒng)的pmoA基因絕對豐度低于兩物種單種系統(tǒng)的平均值,其絕對豐度分別為326956.6 copies/g dw soil和1043616.0 copies/g dw soil(圖2,P<0.001)。通過植物種類和豐富度對pmoA基因絕對豐度變異的解釋度(ω2)發(fā)現(xiàn),植物種類和豐富度分別解釋變異的76.1%和23.9%(表1),說明植物種類對pmoA基因絕對豐度的影響大于植物豐富度。

2.2 植物種類和多樣性對微生物與植物生物量的影響

千屈菜單種系統(tǒng)和海壽花單種系統(tǒng)間的微生物量存在顯著差異,分別為32.98 mg/kg和92.67 mg/kg(圖3,P<0.01)。千屈菜與海壽花混種系統(tǒng)的微生物量高于兩物種單種系統(tǒng)的平均值,其微生物量分別為87.95 mg/kg和62.82 mg/kg(圖3,P<0.01)。通過植物種類和豐富度對微生物量變異的解釋度(ω2)發(fā)現(xiàn),植物種類和豐富度分別解釋變異的77.8%和17.6%(表1),說明植物種類對微生物量的影響大于植物豐富度。

千屈菜單種系統(tǒng)和海壽花單種系統(tǒng)間的植物生物量存在顯著差異,分別為1.74 mg/kg和7.85 mg/kg(圖3,P<0.01)。千屈菜與海壽花混種系統(tǒng)的植物生物量高于兩物種單種系統(tǒng)的平均值,其生物量分別為6.17 mg/kg和4.79 mg/kg(圖3,P<0.01)。通過植物種類和豐富度對植物生物量變異的解釋度(ω2)發(fā)現(xiàn),植物種類和豐富度分別解釋變異的88.9%和4.8%(表1),說明植物種類對植物生物量的影響大于植物豐富度。

圖3 植物種類對微生物量碳和植物生物量的影響與植物多樣性對微生物量碳和植物生物量的影響Fig.3 Effects of plant species on microbial biomass carbon and plant biomass and plant diversity on microbial biomass carbon and plant biomass

2.3 植物種類和多樣性對碳氮移除的影響

千屈菜單種系統(tǒng)和海壽花單種系統(tǒng)間的出水總有機碳濃度分別為12.33 mg/kg和10.84 mg/kg,但兩系統(tǒng)間無顯著差異(圖4,P>0.05)。千屈菜與海壽花混種系統(tǒng)的出水總有機碳濃度低于兩物種單種系統(tǒng)的平均值,但差異不顯著,其出水總有機碳濃度分別為8.54 mg/kg和11.59 mg/kg(圖4,P>0.05)。

圖4 植物種類和多樣性對出水TOC濃度的影響Fig.4 Effects of plant species and diversity on effluent TOC concentration

千屈菜單種系統(tǒng)和海壽花單種系統(tǒng)間的出水銨態(tài)氮濃度有顯著差異,分別為10.02 mg/L和3.03 mg/L(圖5,P<0.01)。千屈菜與海壽花混種系統(tǒng)的出水銨態(tài)氮濃度低于兩物種單種系統(tǒng)的平均值,其出水銨態(tài)氮濃度分別為3.92 mg/L和6.52 mg/L(圖5,P<0.05)。通過植物種類和豐富度對出水銨態(tài)氮濃度變異的解釋度(ω2)發(fā)現(xiàn),植物種類和豐富度分別解釋變異的78.1%和12.8%(表1),說明植物種類對出水銨態(tài)氮濃度的影響大于植物豐富度。

千屈菜單種系統(tǒng)和海壽花單種系統(tǒng)間的出水硝態(tài)氮濃度分別為20.69 mg/L和16.51 mg/L,但兩系統(tǒng)間無顯著差異(圖5,P>0.05)。千屈菜與海壽花混種系統(tǒng)的出水硝態(tài)氮濃度低于兩物種單種系統(tǒng)的平均值,但差異不顯著,其出水硝態(tài)氮濃度分別為16.29 mg/L和18.60 mg/L(圖5,P>0.05)。

圖5 植物種類對出水銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的影響與植物多樣性對出水銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的影響Fig.5 Effects of plant species on effluent

3 討論

甲烷是系統(tǒng)碳轉(zhuǎn)化過程的產(chǎn)物之一,甲烷排放主要由植物和微生物過程驅(qū)動[6]。在本研究中,海壽花單種系統(tǒng)的甲烷釋放強度顯著高于千屈菜單種系統(tǒng),并且千屈菜與海壽花混種系統(tǒng)的甲烷釋放強度(8.78 mg CH4m-2d-1)高于兩物種單種系統(tǒng)的平均值(6.97 mg CH4m-2d-1),說明增加植物多樣性有利于提高人工濕地系統(tǒng)的甲烷釋放強度,植物多樣性對人工濕地系統(tǒng)的甲烷釋放強度有正效應,同時植物種類也顯著影響系統(tǒng)甲烷釋放。支持了Zhang等[23]的研究結(jié)論,植物多樣性對甲烷釋放具有促進作用。Zhang等[23]將多樣性對甲烷釋放的促進作用解釋為植物生物量對甲烷的促進作用和多樣性條件下互補效應導致甲烷的超排放效應。本研究,我們發(fā)現(xiàn)混種系統(tǒng)的植物生物量顯著高于單種系統(tǒng),混種增加的植物生物量會通過根系向基質(zhì)釋放更多的有機碳,這些有機碳被產(chǎn)甲烷菌轉(zhuǎn)化成甲烷而促進甲烷的產(chǎn)生[11],因此,植物多樣性對甲烷釋放的正效應可能與多樣性對植物生物量的正效應有關。然而,我們發(fā)現(xiàn)混種系統(tǒng)甲烷釋放強度與單種系統(tǒng)甲烷釋放強度的最高值(海壽花單種系統(tǒng))之間無顯著差異,說明本研究中多樣性高的系統(tǒng)并未出現(xiàn)甲烷的超排放效應,即不存在互補效應,與Zhang等[23]的研究結(jié)果不同。這可能與人工濕地系統(tǒng)處理的污水成分有關,本研究污水的碳氮比為5∶1,產(chǎn)甲烷菌可能主要利用污水中的碳,但Zhang等[23]所處理的污水中未添加任何碳,也就是說產(chǎn)甲烷菌利用的碳完全依賴于植物供給的碳,這部分植物碳可能被產(chǎn)甲烷菌互補利用導致甲烷的超排放效應。此外,為了更好地解釋植物多樣性對甲烷釋放的效應,我們除了同前人的研究一樣,測定了多樣性條件下的植物生物量和超排放效應外[20,23],還檢測了與甲烷釋放直接相關的微生物。產(chǎn)甲烷菌和甲烷氧化菌是甲烷產(chǎn)生和氧化過程涉及的兩類微生物[11]。由于分子生物學技術的發(fā)展,產(chǎn)甲烷菌和甲烷氧化菌的數(shù)量可以分別由功能基因mcrA和pmoA來定量[6]。與傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)計數(shù)相比,實時熒光定量PCR方法不僅省時、省力,而且準確率更高。然而,在人工濕地中,基于植物多樣性栽培條件下,用定量PCR技術探討甲烷排放與產(chǎn)甲烷菌和甲烷氧化菌功能基因關系的研究卻很少。本研究,千屈菜與海壽花混種提高了mcrA基因絕對豐度(P<0.001),但卻降低了pmoA基因絕對豐度(P<0.001)。mcrA基因通過產(chǎn)甲烷菌的轉(zhuǎn)化過程催化甲烷的產(chǎn)生[6],因此,混種對甲烷釋放的正效應可能主要取決于產(chǎn)甲烷菌對產(chǎn)甲烷的正效應。另一方面,人工濕地產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)生的甲烷有一部分未到達大氣之前被甲烷氧化菌氧化成二氧化碳[9]。本研究中,混種系統(tǒng)較高的產(chǎn)甲烷菌數(shù)量、較低的甲烷氧化菌數(shù)量與較高的甲烷釋放強度一致。因此,混種對甲烷釋放的正效應也可能與甲烷氧化菌對甲烷氧化的負效應有關。

4 結(jié)論