楊廣容,馬 燕,蔣 賓,馬會(huì)杰,謝 瑾,呂才有,李永梅

1 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍潤(rùn)普洱茶學(xué)院,昆明 650201 2 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院,昆明 650201

茶樹[Camelliasinensis(L.)O.Kuntze]是我國(guó)南方重要多年生木本經(jīng)濟(jì)作物,2016年,中國(guó)茶葉種植面積達(dá)293.3×104hm2,約占全球植茶面積的60%以上[1]。茶園土壤環(huán)境質(zhì)量是影響茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素之一[2]。茶樹在長(zhǎng)期連作栽培中不斷適應(yīng)熱帶和亞熱帶氣候及土壤環(huán)境條件,逐漸進(jìn)化形成了其特有的土壤生態(tài)環(huán)境特征,如喜溫怕冷、喜酸怕堿、喜濕怕澇、喜銨厭硝、聚鋁嫌鈣、忌氯富錳等。茶樹作為典型的喜酸作物,能在pH3.2—6.8的土壤中生長(zhǎng)[3-4]。茶園土壤由于茶樹長(zhǎng)期單一化種植,作物根系分泌物多樣性低,施肥、修剪和茶樹凋落物歸還等原因,致使茶園土壤隨茶樹種植時(shí)間延長(zhǎng)而酸化[5-6]。

土壤微生物是土壤中最活躍且多樣性最為豐富的組分之一,其群落的組成結(jié)構(gòu)、活性及多樣性很大程度上決定了土壤中的營(yíng)養(yǎng)元素循環(huán)和土壤的肥力,是反映土壤質(zhì)量及評(píng)價(jià)土壤生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)性的重要生物學(xué)指標(biāo),對(duì)土壤養(yǎng)分、結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性上具有重要的影響[5-8]。同時(shí),植被類型和多樣性、土壤水分、pH、土壤類型及其理化性狀、土地利用方式、有機(jī)質(zhì)、有效磷和速效鉀均顯著影響微生物群落結(jié)構(gòu)[6,9-11]。如Lauber等認(rèn)為pH值是決定土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的主要因素[12],有研究表明在pH小于6.5的土壤中,土壤微生物多樣性隨著pH的降低隨之降低[13]。已有學(xué)者證實(shí),茶園土壤微生物及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受多種生態(tài)因子的影響,如：茶樹品種及樹齡、海拔、季節(jié)、施肥及修剪等[5,14-17]。

王秀青等[18]對(duì)茶園土壤微生物細(xì)菌、真菌和放線菌純培養(yǎng)研究表明,茶園土壤微生物數(shù)量普遍高于森林土壤,并且現(xiàn)代茶園微生物的總數(shù)量高于古茶園。細(xì)菌是土壤中數(shù)量最多、分布最廣的微生物,它占土壤微生物總數(shù)的70%—90%,其干重約占土壤有機(jī)質(zhì)的1%[4]。由于絕大多數(shù)土壤微生物難以培養(yǎng)分離,導(dǎo)致傳統(tǒng)研究方法獲得的土壤微生物信息較少,不能真實(shí)反映土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)及功能。采用現(xiàn)代分子生物學(xué)研究手段,從土壤中提取微生物宏基因組總DNA,并通過PCR擴(kuò)增及測(cè)序,準(zhǔn)確鑒別土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性[3-4,19-21],能有效克服傳統(tǒng)平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法的缺陷,也是目前土壤微生物研究的重要內(nèi)容。本研究以3個(gè)古茶園土壤為研究對(duì)象,分別以森林和現(xiàn)代茶園土壤為對(duì)照,通過直接提取土壤微生物基因組總DNA,采用16S rDNA基因的通用引物PCR擴(kuò)增及Illumina平臺(tái)Miseq高通量測(cè)序技術(shù),鑒定和比較森林、現(xiàn)代茶園和古茶園土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)多樣性與差異,為深入了解茶園土壤細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)演變規(guī)律、調(diào)節(jié)茶園土壤環(huán)境質(zhì)量和改善土壤管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土壤采樣與處理

1.1.1采樣茶園位點(diǎn)概況

選擇云南西雙版納州勐海縣代表性古茶山景邁山(大平掌)、布朗山(賀開村)和南糯山(半坡竹林小組)的現(xiàn)代茶園(J2、B2和N2)、古茶園(J3、B3和N3)及其附近森林(J1、B1和N1)。各茶園均為生態(tài)茶園,除景邁山和布朗山的現(xiàn)代茶園每年進(jìn)行土壤翻耕外,其他茶園均處于免耕狀況,所有茶園栽培管理均為不施肥、不施農(nóng)藥的有機(jī)茶園或生態(tài)茶園。采樣茶園的生態(tài)環(huán)境概況見表1。

1.1.2土樣采集與處理

土樣采集時(shí)間為2015年5月中旬,云南春茶采摘末期。根據(jù)采樣茶園的地形條件,在20×20 m區(qū)域內(nèi),采用3—5點(diǎn)混合取樣法,每個(gè)采樣點(diǎn)沿著茶樹樹冠邊緣垂直投影取樣,適當(dāng)清除地表的枯枝落葉,用土鉆采集0—20 cm表層土壤,混合均勻,剔除雜質(zhì),形成一個(gè)土樣,每一茶園重復(fù)取3個(gè)土樣。一部分土樣(約20 g)裝入無菌袋及時(shí)用液氮冷凍后-86℃保存,供分子生物學(xué)研究,另一部分土樣(約500 g)24 h內(nèi)室內(nèi)自然風(fēng)干,過2 mm或0.15 mm篩用于土壤pH值、陽(yáng)離子交換量(CEC)、有機(jī)質(zhì)(SOM)、全氮(TN)、全磷(TP)、全鉀(TK)、有效氮(堿解氮)、速效磷(Olsen-P)、速效鉀及土壤礦質(zhì)元素有效性鈣鎂鐵銅鋅錳的測(cè)定。

表1 茶園采樣位點(diǎn)基本情況Table 1 The basic situation of soil sampling points of tea gardens

1.2 土壤特性及養(yǎng)分含量測(cè)定

1.2.1土壤pH值：采用1∶2.5土水(質(zhì)量)比,用玻璃復(fù)合電極法測(cè)定。

1.2.2陽(yáng)離子交換量(cation exchange capacity,CEC)用乙酸銨交換提取—蒸餾法。

1.2.3土壤有機(jī)質(zhì)(soil organic matter,SOM)用重鉻酸鉀容量法—外加熱法。

1.2.4全氮(total nitrogen,TN)用濃硫酸-雙氧水消煮—?jiǎng)P氏定氮法；全磷(total phosphorous,TP)用硫酸-雙氧水消煮—鉬銻抗比色法；全鉀(total potassium,TK)濃硫酸-雙氧水消煮—火焰光度法。

1.2.5有效氮磷鉀：堿解氮(alkali-hydrolyzable nitrogen)用1 mol/L NaOH堿解擴(kuò)散法；速效磷即Olsen-P用0.5 mol/L NaHCO3溶液浸提—鉬藍(lán)比色法；速效鉀(available potassium)用乙酸銨浸提—火焰光度法。

1.2.6土壤有效性銅(Cu)、鋅(Zn)、錳(Mn)用火焰原子吸收分光光度計(jì)法[22]。

各土壤樣品的理化性狀見表2。

表2 古茶園與現(xiàn)代茶園土壤基本化學(xué)性質(zhì)比較(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差,n=3)Table 2 The soil physical and chemical properties (means ± standard deviation,n=3)

不同大、小寫字母表示同一茶山不同土壤間的差異極顯著(P<0.01)和差異顯著(P<0.05)

1.3 土壤細(xì)菌測(cè)序

1.3.1土壤DNA提取

土壤DNA提取參照Proteous等[23]和楊建等[24]的方法,采用SDS-GITC-PEG法,并作適當(dāng)修改。稱取0.5 g土樣于2 mL離心管中,所加試劑均按照比例減少20倍,加入氯仿-異戊醇后離心速度改為15 000 g,10 min。其他操作步驟基本不變。

1.3.216S rDNA基因擴(kuò)增與測(cè)序

16S rDNA基因擴(kuò)增：用16S rDNA基因通用引物341F、806R(見表3)以50 μL體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件：用帶有barcode的特異引物擴(kuò)增樣本16S rDNA特定的V3—V4區(qū)域,擴(kuò)增體系為：50 μL反應(yīng)體系中包含5 μL的10× KOD Buffer,5 μL的2.5 mmol/L dNTPs,1.5 μL引物(5 μmol/L),1 μL的KOD聚合酶,和100 ng模版DNA。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性2 min,隨后98℃變性10 s,62℃退火30 s,68℃延伸30 s,共27個(gè)循環(huán),最后68℃延伸10 min。

表3 研究中使用的引物Table 3 PCR primers used in this study

測(cè)序：對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收,用QuantiFluorTM熒光計(jì)進(jìn)行定量。選擇符合測(cè)序要求的樣品16S rDNA送基迪奧生物科技有限公司(廣州)對(duì)V3和V4區(qū)域進(jìn)行細(xì)菌宏基因組測(cè)序,將純化的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行等量混合,連接測(cè)序接頭,根據(jù)Illumina官方說明構(gòu)建測(cè)序文庫(kù),Hiseq2500的PE250模式上機(jī)測(cè)序[25]。

數(shù)據(jù)質(zhì)量控制：去除測(cè)序過程中產(chǎn)生的接頭污染序列和一些低復(fù)雜度序列(如poly A)及含有N的序列,若reads與接頭序列可以連續(xù)比對(duì)上15 bp的長(zhǎng)度,則認(rèn)為該reads有接頭污染；若reads中poly序列的長(zhǎng)度≥10 bp,則為低復(fù)雜度序列的reads。在進(jìn)行后續(xù)分析之前,還需要對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)中質(zhì)量值較低的堿基質(zhì)量值小于20的堿基序列進(jìn)行過濾,保證將一條reads上質(zhì)量值高于20的堿基數(shù)占?jí)A基總數(shù)的百分比小于80%的reads過濾掉。

通過重疊關(guān)系將雙末端測(cè)序得到的成對(duì)序列組裝成一條序列。拼接的條件是最小匹配長(zhǎng)度為 50 bp,重疊區(qū)域允許的錯(cuò)配率為0.02,符合條件的序列即為目標(biāo)序列。每個(gè)樣品測(cè)序深度,通過繪制shannon稀釋曲線來評(píng)價(jià)測(cè)序量是否足夠,并間接反映樣品中物種的豐富程度。當(dāng)曲線趨于平緩或者達(dá)到平臺(tái)期時(shí)也就可以認(rèn)為測(cè)序量趨于飽和,基本覆蓋樣品中所有物種,測(cè)序深度增加已經(jīng)不影響物種多樣性。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

1.4.1土壤基本性質(zhì)的分析處理

用SPSS 21.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,采用單因素方差分析(oneway-ANOVA)和多重比較(LSD)法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)和多重比較分析(α=0.05和0.01),圖表中的數(shù)據(jù)均為mean ± SD。

1.4.216S rDNA基因組多樣性的標(biāo)準(zhǔn)信息分析

16S rDNA細(xì)菌宏基因組V3和V4區(qū)域測(cè)序結(jié)果通過PE reads過濾,獲得符合條件的序列即為目標(biāo)序列tag,利用Mothur[25](v.1.34.0)軟件包對(duì)tag序列進(jìn)行了去冗余處理,從中挑選出unique tag序列,并對(duì)unique tag的豐度分布進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)；使用基于Naive Bayesian方法的分類器rdp classifier工具對(duì)tag進(jìn)行物種注釋[26]。根據(jù)序列長(zhǎng)度的變化,選擇恰當(dāng)?shù)腃onfidence Threshold(為0.5)參數(shù)進(jìn)行物種分類與豐度分析。

1.4.3細(xì)菌宏基因組多樣性的高級(jí)信息分析

為了更好地獲得樣品中物種的多樣性信息,利用Mothur計(jì)算0.03距離下(97%的相似度)的 OTU(Operating Taxonomic Unit)數(shù)量及其高級(jí)信息OTU豐度、Alpha多樣性及聚類等[27-29]。

結(jié)合OTU的物種注釋信息以及OTU在不同樣品中的表達(dá),統(tǒng)計(jì)界、門、綱、目、科、屬和種每一個(gè)分類水平上各樣品的表達(dá)情況,獲得物種分類表達(dá)譜,根據(jù)物種的分類表達(dá)譜的數(shù)據(jù),選取豐度較高的部分物種分類單元,用Canoco5.0進(jìn)行主成分分析(principal component analysis,PCA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同土壤細(xì)菌群落豐度及多樣性分析

根據(jù)細(xì)菌16S rDNA的V3—V4區(qū)域測(cè)序結(jié)果,統(tǒng)計(jì)9個(gè)土壤樣品細(xì)菌群落豐度及多樣性的各項(xiàng)指標(biāo)(表4)。結(jié)果分析表明,所建立細(xì)菌文庫(kù)的覆蓋率,除景邁山古茶園土壤(coverage=52.73%)外,其余樣本達(dá)73.66%—99.55%,平均為83.56%。說明研究所建立的文庫(kù)可比較真實(shí)有效地反映樣本環(huán)境細(xì)菌多樣性。森林、現(xiàn)代茶園與古茶園土壤的細(xì)菌OTU數(shù)目分別為327—17009、5547—25866和10816—27837,表明3座茶山森林土壤的細(xì)菌OTU數(shù)目差異高達(dá)數(shù)十倍至數(shù)百倍。本研究9個(gè)土壤樣本細(xì)菌群落的Alpha多樣性統(tǒng)計(jì)表明,chao1和ACE指數(shù)變化趨勢(shì)與OTU指數(shù)相一致；景邁山森林(J1)和南糯山森林(N1)與現(xiàn)代茶園(N3)Shannon指數(shù)較低,分別為3.17和4.77與4.69,而其他6個(gè)土壤的平均Shannon指數(shù)達(dá)6.98—8.82,說明這6個(gè)土壤細(xì)菌群落多樣性水平較高。一般高肥力土壤中細(xì)菌含量較多,本研究3種古茶園和2個(gè)樹齡較長(zhǎng)(50年以上,表1)土壤中細(xì)菌含量較為豐富(表4),總體上,同一座茶山古茶園土壤細(xì)菌的OTU數(shù)、Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)均高于森林和現(xiàn)代茶園土壤,說明古茶園土壤細(xì)菌多樣性相對(duì)更為豐富。

表4 樣本細(xì)菌Alpha多樣性統(tǒng)計(jì)Table 4 Statistical analysis of bacterial Alpha deversity in samples

2.2 不同土壤細(xì)菌在門水平上的分布

在門分類水平上,經(jīng)微生物16S rDNA基因測(cè)序,檢測(cè)到樣品中共有47個(gè)菌門,平均豐度達(dá)0.11%及以上的菌門共計(jì)21個(gè)(表5)。從中可知,不同茶山的森林土壤(J1、B1和N1)及同一茶山的森林、現(xiàn)代茶園和古茶園土壤細(xì)菌群落分布差異明顯。首先,變形菌門(Proteobacteria)是明顯的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群,其在9個(gè)樣品中所占豐度達(dá)42.16%—71.85%,平均為50.63%,其次為酸桿菌門(Acidobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、WPS-2、綠彎菌門(Chloroflexi)、藍(lán)藻細(xì)菌門(Cyanobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)、AD3、疣微菌門(Verrucomicrobia)10個(gè)菌門其相對(duì)豐度平均達(dá)1.06%以上,而其他菌門如芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、泉古菌門(Crenarchaeota)、綠菌門(Chlorobi)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)和梭菌門(Fusobacteria)等10個(gè)門的相對(duì)豐度低于1.00%。其次,21個(gè)主要菌門中,布朗山和南糯山森林土壤(B1和N1)細(xì)菌覆蓋度達(dá)20個(gè)菌門,明顯高于景邁山森林土壤(J1,僅10個(gè)菌門)。最后,除景邁山外,古茶園土壤細(xì)菌群落的門類豐度及均勻度均有增加趨勢(shì)。

表5還表明,9個(gè)土壤樣本中茶園土壤細(xì)菌群落種群分布相對(duì)較為穩(wěn)定,3座茶山現(xiàn)代茶園和古茶園土壤優(yōu)勢(shì)菌門變形菌門的平均相對(duì)豐度為51.30%和40.92%,其次為酸桿菌門19.61%和19.78%、放線菌門5.46%和7.19%、厚壁菌門4.42%和3.16%與擬桿菌門1.26%和6.03%,此5個(gè)菌門相對(duì)豐度之和分別為82.48%和77.08%,低于森林土壤5個(gè)菌門相對(duì)豐度之和的91.86%。表明,植茶和植茶年齡的增加將促進(jìn)土壤細(xì)菌群落優(yōu)勢(shì)種群的形成,構(gòu)成茶園土壤特殊的微生物環(huán)境。

表5 不同土壤細(xì)菌在門水平上的分布統(tǒng)計(jì)Table 5 Soil bacterial communities at the phylum level

2.3 不同土壤細(xì)菌在目水平上的最佳物種分類及聚類分析

為了確定最佳的物種分類水平,統(tǒng)計(jì)了9個(gè)土壤樣品在各個(gè)分類水平上的tag序列數(shù)及物種分類單元(從上往下)為：界(100%)>門(92.87%)>綱(83.70%)>目(76.76%)>科(44.58%)>屬(10.11%)>種(2.00%)。圖1為9個(gè)樣品測(cè)序量的OTU稀釋曲線及樣品間bray距離層級(jí)聚類,間接反映樣品中物種的豐富程度以及在OTU水平上各樣品的相似性。從圖1可知,景邁山森林(J1)和南糯山森林(N1)及現(xiàn)代茶園(N2)土壤的OTUs指數(shù)(即物種豐富程度)明顯低于其他土壤,同時(shí)景邁山森林(J1)及古茶園(J3)土壤的OTUs指數(shù)(即細(xì)菌數(shù)量)明顯低于其他茶山土壤。布朗山3種土壤(B1、B2和B3)與景邁山現(xiàn)代茶園(J2)土壤細(xì)菌群落的物種結(jié)構(gòu)比較相似,而景邁山森林(J1)和南糯山古茶園(N3)土壤的細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)與其他土壤差異性最大(圖1)。

圖1 各土壤細(xì)菌在97%相似性的OTU稀釋曲線圖及OTU的bray距離聚類分析圖Fig.1 Rarefaction curve at 97% similarity and clustering analysis of OTUs by bray distance

圖2是最佳分類水平(目)的物種表達(dá)譜熱圖,它展示了不同的物種在樣本間的表達(dá)變化情況,熱圖上的聚類關(guān)系,也可以反應(yīng)樣本關(guān)系。本研究在目最佳分類水平上總共檢測(cè)到89個(gè)土壤細(xì)菌目,它們從屬于17個(gè)菌門。由于涉及細(xì)菌群落的種類很多,圖2僅對(duì)物種至少在一個(gè)樣本中包含tags數(shù)量達(dá)到總tags數(shù)量的1%作為閾值的43個(gè)目進(jìn)行作圖。結(jié)果表明,變形菌門的伯克霍爾德氏菌目(Burkholderiales)和根瘤菌目(Rhizobiales)為森林(J1、B1和N1)、現(xiàn)代茶園(J2、B2和N2)及古茶園(J3、B3和N3)的優(yōu)勢(shì)菌目,其在9個(gè)土壤樣品中的平均豐度分別達(dá)13.91%和8.17%,此外,Ellin329、黃單胞菌目(Xanthomonadales)、紅螺菌目(Rhodospirillales)、紅細(xì)菌目(Rhodobacterales)、鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)、柄桿菌目(Caulobacterales)、假單胞菌目(Pseudomonadales)、奈瑟菌目(Neisseriales)和粘球菌目(Myxococcales)的平均豐度分別達(dá)6.09%、4.52%、4.40%、3.64%、2.69%、2.20%、1.98%、1.82%和1.56%,變形菌門這11個(gè)目的累計(jì)平均豐度為50.99%；其次,酸桿菌門的酸桿菌目(Acidobacteriales)、Solibacterales、Ellin6513和iii1-15,其平均豐度分別為9.00%、4.62%、3.64%和1.67%；第三,厚壁菌門的芽孢桿菌目(Bacillales)和乳桿菌目(Lactobacillales)平均豐度分別為4.60%和1.67%,放線菌門的放線菌目(Actinomycetales)和酸微菌目(Acidimicrobiales)則分別為3.46%和1.39%,擬桿菌門的擬桿菌目(Bacteroidales)為2.09%。目最佳分類水平上樣品間物種表達(dá)聚類結(jié)果與圖1 OTUs最佳分類水平上的聚類分析結(jié)果相一致。

圖2 目分類水平各土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig.2 Soil bacterial communities at order level

圖3 各土壤細(xì)菌OTU相對(duì)豐度的PCA分析Fig.3 PCA analysis of the soil bacterial communities based on the relative abundance of OTU

此外,本研究以O(shè)TUs為指標(biāo)對(duì)9個(gè)土壤樣本進(jìn)行PCA統(tǒng)計(jì)分析(圖3),表明：9個(gè)土壤PC1=47.62%,PC2=15.97%,布朗山森林(B1)、現(xiàn)代茶園(B2)、古茶園(B3)和景邁山現(xiàn)代茶園土壤(J2)與其他5種土壤細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)差異可以區(qū)分開,南糯山古茶園土壤(N3)也明顯區(qū)別于其他4種土壤,同理,同一座山不同類型茶園間土壤細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)也存在明顯差異。與此同時(shí),OTUs的PCA分析土壤樣本間的相互關(guān)系,與上述OTUs最佳分類水平聚類分析(圖1)和熱圖上的物種表達(dá)譜的聚類分析(圖2)結(jié)果相一致。

3 討論

茶樹是廣泛適應(yīng)于熱帶亞熱帶酸性土壤的作物,鄧欣等[30]和王秀青等[18]采用稀釋平板涂抹法等對(duì)茶園土壤微生物的數(shù)量研究表明,茶園土壤的微生物數(shù)量普遍高于森林、農(nóng)田和旱地土壤。薛冬等[3]采用變性梯度凝膠電泳(DGGE)研究龍井茶產(chǎn)地梅家塢不同茶園、荒地和林地利用方式的土壤微生物群落基因多樣性指數(shù)表明：荒地 >茶園 >林地。秦紅靈等[6]采用RT-PCR分析對(duì)紅壤坡地不同土地利用方式對(duì)土壤細(xì)菌數(shù)量及結(jié)構(gòu)的影響也表明,茶園 >自然恢復(fù)區(qū)(不耕種、不施肥,植被自然演替)>農(nóng)田,茶園土壤細(xì)菌數(shù)量豐富,并保持較高的多樣性。本研究通過對(duì)3座茶山森林、現(xiàn)代茶園和古茶園土壤的細(xì)菌宏基因組16S rDNA測(cè)序及OTUs分子生物信息分析表明：9種土壤樣本的細(xì)菌數(shù)量及Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)(表4)均為：古茶園 >現(xiàn)代茶園 >森林,說明茶園土壤的細(xì)菌種類普遍增加,古茶園土壤細(xì)菌多樣性相對(duì)現(xiàn)代茶園更為豐富,與前人的研究結(jié)果基本一致。這可能與茶樹長(zhǎng)期栽培下,茶園土壤中茶樹凋落物、根系分泌物及茶園施肥等使茶園土壤pH值變化及肥力提高(表2)[3-4,14-16,21]及古茶園林下栽培模式下良好的生態(tài)環(huán)境[18]更有利與茶園土壤細(xì)菌的繁衍與生存。

目前國(guó)內(nèi)針對(duì)茶園土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)的基因組學(xué)研究較少,僅盧開陽(yáng)等[20]采用平板涂布分離法和16S rRNA基因序列分析鑒定南糯山古茶樹和臺(tái)地茶根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性表明：茶樹根際土壤細(xì)菌分屬于放線菌門、厚壁菌門和變形菌門,其中古茶樹生境分離到20個(gè)屬,臺(tái)地茶生境則為17個(gè)屬,在屬一級(jí)水平,古茶樹根際土壤細(xì)菌群落的多樣性和豐富度均高于臺(tái)地茶。本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)森林和茶園土壤細(xì)菌群落組成的分子生物信息分析表明：在門分類水平上,9個(gè)土壤樣本細(xì)菌共分屬于47個(gè)菌門,其中,變形菌門是森林、現(xiàn)代茶園和古茶園土壤的明顯優(yōu)勢(shì)類群,平均豐度達(dá)50.63%,其次,酸桿菌門、放線菌門、厚壁菌門與擬桿菌門,它們和變形菌門相對(duì)豐度之和占森林、現(xiàn)代茶園和古茶園的91.86%、82.48%和77.08%。盡管,研究角度和方法不同,但研究結(jié)果之間具有很大的相似性,共同表明：茶樹栽培管理中,人為干預(yù)度較小的林下古茶園栽培模式土壤微生物多樣性和豐富度高于人為干預(yù)度較大現(xiàn)代茶園。

本研究中關(guān)于茶園土壤細(xì)菌群落的物種表達(dá)熱圖(圖2)說明：3座茶山土壤43個(gè)細(xì)菌目,從屬于9個(gè)菌門,其中變形菌門平均豐度達(dá)50.99%；其次為酸桿菌門、厚壁菌門、放線菌門及擬桿菌門。這一研究結(jié)果與常安然等[31]關(guān)于16S rDNA測(cè)序技術(shù)對(duì)煙草根際土壤細(xì)菌分類結(jié)構(gòu)研究結(jié)果：煙草根際土壤共有25個(gè)菌門,其中變形菌門、擬桿菌門、酸桿菌門、疣微菌門四類菌門占明顯優(yōu)勢(shì),變形菌門是最為豐富的土壤細(xì)菌類群,在不同土壤類型中豐度占39.04%—53.71%相似。此外,國(guó)內(nèi)關(guān)于森林及農(nóng)田土壤細(xì)菌多樣性的測(cè)序研究[32-33]也表明,土壤中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門為變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、厚壁菌門和芽單胞菌門。與其他作物栽培的土地利用方式相比,茶樹作為高酚酸含量及根系分泌酚酸較高的多年生作物[3-4],其生物學(xué)特性和耕作制度對(duì)土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)群落在門水平?jīng)]有顯著的影響。但是,從OTUs物種注釋聚類分析(圖1)和PCA統(tǒng)計(jì)結(jié)果(圖3)則表明,每座茶山森林、現(xiàn)代茶園和古茶園3種土壤類型的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)是有明顯的差別的。Meta-群落假說認(rèn)為[34],細(xì)菌群落分布主要受內(nèi)部環(huán)境和外部環(huán)境兩類作用因子的影響,且本土環(huán)境特征是調(diào)節(jié)細(xì)菌組成與分布的主要因素。為揭示茶園土壤環(huán)境因子和細(xì)菌群落組分的內(nèi)在聯(lián)系,在今后研究中需要在明確季節(jié)、茶園土壤水分、pH值、有機(jī)質(zhì)及速效氮磷鉀等因素對(duì)細(xì)菌群落的影響[6,14-15,31]外,還要進(jìn)一步擴(kuò)大茶園土壤微生物研究區(qū)域范圍、提高土壤微生物基因組的測(cè)序深度及物種注釋與分類水平,在屬或種水平上探明茶園土壤細(xì)菌種群結(jié)構(gòu),才能闡明茶園土壤細(xì)菌對(duì)土壤環(huán)境質(zhì)量的調(diào)控機(jī)制。此外,本研究?jī)H對(duì)細(xì)菌群落進(jìn)行分析,對(duì)于茶園土壤其他種類的微生物類群,如真菌、古菌等的分布結(jié)構(gòu),還有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

1)土壤細(xì)菌16S rDNA高通量測(cè)序表明：森林、現(xiàn)代茶園和古茶園土壤細(xì)菌群落的平均覆蓋率分別為93.59%、87.05%和71.22%,Shannon指數(shù)平均分別為5.32、7.03和8.03,表明3座茶山不同土壤的細(xì)菌群落豐度為：古茶園 >現(xiàn)代茶園 >森林。

2)在門分類水平上,變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、厚壁菌門與擬桿菌門是森林、現(xiàn)代茶園和古茶園土壤的優(yōu)勢(shì)類群,它們的相對(duì)豐度占比分別達(dá)91.86%、82.48%和77.08%；在目最佳分類水平上,變形菌門的伯克霍爾德氏菌目、根瘤菌目為森林和茶園土壤的優(yōu)勢(shì)菌種,其平均豐度分別達(dá)13.91%和8.17%。

3)3座茶山3種土壤類型的最佳分類水平(目)和OTUs指數(shù)PCA統(tǒng)計(jì)分析均表明：森林、現(xiàn)代茶園和古茶園土壤類型的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯,除景邁山外,古茶園土壤細(xì)菌群落的多樣性和豐度均高于森林和現(xiàn)代茶園。