竇曹帥 張 鴻 柯貴寶 連智雯 陳雪芹1, 史 偉 梁馨 劉雙信1,

蛋白尿通常與足細胞損傷密切相關[1]，足細胞損傷及數(shù)量減少可直接導致蛋白尿和腎小球硬化[2]，但其損傷機制尚不完全清楚。Krüppel樣因子15(KLF15)是KLFs轉錄因子家族成員，C端包含與DNA區(qū)域連接的鋅指結構，N端是一段高度保守的區(qū)域[3]，在腎臟中表達豐富[4]，國內外研究發(fā)現(xiàn)，KLF15可減弱足細胞損傷[5]，缺少KLF15的小鼠加速慢性足細胞損傷進展[6]，糖皮質激素可顯著提高足細胞中KLF15的表達，并促進足細胞分化[7]，但具體分子機制尚不明確。

核轉錄因子——活化T細胞核因子胞質1型(Nuclear factor of activated T cytoplasmic 1，NFATc1)靜息狀態(tài)下以磷酸化形式存在于胞質中，Ca2+流入后活化鈣調磷酸酶介導NFATc1脫磷酸入核介導下游基因轉錄，從而引起足細胞損傷[8]。我們課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，NFATc1活化在足細胞損傷、凋亡以及腎小球硬化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著至關重要的作用。近來有文獻報道，糖皮質激素可顯著提高KLF15的表達，并通過生物信息學分析預測發(fā)現(xiàn)KLF15與NFATc1啟動子區(qū)域有結合[7]。因此，本研究擬通過體外培養(yǎng)足細胞實驗探究KLF15是否通過影響NFATc1保護足細胞，并進一步完善糖皮質激素保護足細胞的分子機制。

材料和方法

實驗試劑RMPI 1640培養(yǎng)基(CORNING)；重組小鼠γ干擾素(IFN-γ)(ProSpec)；胎牛血清(FBS)；0.05%胰酶(Gibco)；核漿蛋白提取試劑盒、凋亡試劑盒(凱基)；ChIP試劑盒、熒光二抗488、熒光二抗555(Thermo)；NFATc1抗體(Abcam)；GAPDH 抗體(Bioworld)；BAX、KLF15抗體(Santa)；BCL2、Histone 抗體(CST)；逆轉錄試劑盒、Trizol、lipofectamine 2000(LifeTechnologies)；SYBR GREEN(Takara)；增強綠色熒光蛋白(EGFP)。

細胞培養(yǎng)條件永生化小鼠足細胞系由美國Jochen Reiser教授(Rush University Medical Center，Chicago，IL，USA)惠贈。足細胞復蘇后在含10% FBS 及(2～10)×104U/L 的 IFN-γ培養(yǎng)基、33 ℃含5%CO2培養(yǎng)箱中增殖，細胞融合達到70%～80%時轉入 5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中在5% FBS 及不含IFN-γ的培養(yǎng)基中分化，在37 ℃培養(yǎng)10～12d，足細胞分化成熟。本研究所做實驗均在分化成熟后進行。

實驗分組

免疫熒光分組 腎癌患者周邊正常腎組織(Normal組)；糖尿病腎病患者腎穿組織標本(DN組)；微小病變型腎病患者腎穿組織標本(MCD組)；局灶節(jié)段性腎小球硬化患者腎穿組織標本(FSGS組)。

足細胞損傷刺激分組 CON組：空白對照組；脂多糖(LPS)組：含100 μg/ml的LPS培養(yǎng)基培養(yǎng)48h；HG組：含30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)48h；阿霉素(ADR)組：含0.25 μg/ml ADR培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。

足細胞過表達及過表達損傷處理分組 EGFP組：腺病毒瞬時感染過表達對照組；KLF15組：腺病毒瞬時感染過表達KLF15組；EGFP+LPS組：過表達對照后加入LPS干預24h；EGFP+HG組：過表達對照后加入高糖干預24h；EGFP+ADR組：過表達對照后加入ADR干預24h；KLF15+LPS組：過表達KLF15后加入LPS干預24h。KLF15+HG組：過表達KLF15后加入高糖干預24h；KLF15+ADR組：過表達KLF15后加入ADR干預24h。

足細胞地塞米松處理分組 0h：空白對照組；6h：地塞米松(10 μmol/L)處理6h組；12h：地塞米松處理12h組；24h：地塞米松處理24h組；48h：地塞米松處理48h組。

病毒感染足細胞分化成熟后，在5 ml不含血清RMPI 1640培養(yǎng)基中加入5 μl病毒，24h后換為含5%血清的RMPI 1 640培養(yǎng)基，再做其他干預。

地塞米松處理8 ml 5%血清的RMPI 1 640培養(yǎng)基加入2 μl 40 mmol/L地塞米松后培養(yǎng)6h、12h、24h、48h。

WesternBlot 細胞干預到時間后，每皿加入100 μl蛋白裂解液刮取蛋白，BCA法測得蛋白濃度后按照20∶ 1加入變性液，98℃變性10 min，按照每孔60 μg上樣蛋白，80V恒壓電泳分離后，200 mA恒流120 min濕轉至PVDF膜上，用5%牛奶封閉1h，一抗4℃孵育過夜，用相應二抗4℃孵育2h，用電化學發(fā)光液(ECL)曝光，Image J軟件分析灰度值。

實時定量PCR(RT-PCR)Trizol法提取細胞總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明逆轉錄RNA為cDNA,按照SYBR-Green PCR試劑盒說明檢測目的基因表達。引物序列：GAPDH正義鏈5′-A￣G￣G￣T￣C￣G￣G￣T￣G￣T￣G￣A￣A￣C￣G￣G￣A￣T￣T￣T￣G-3′，反義鏈5′-T￣G￣T￣A￣G￣A￣C￣C￣A￣T￣G￣T￣A￣G￣T￣T￣G￣A￣G￣G￣T￣C￣A-3； NFATc1正義鏈5’-G￣G￣A￣G￣A￣G￣T￣C￣C￣G￣A￣G￣A￣A￣T￣C￣G￣A￣G￣A￣T-3’反義鏈5’-T￣T￣G￣C￣A￣G￣C￣T￣A￣G￣G￣A￣A￣G￣T￣A￣C￣G￣T￣C￣T-3’;KLF15正義鏈5’-G￣A￣G￣A￣C￣C￣T￣T￣C￣T￣C￣G￣T￣C￣A￣C￣C￣G￣A￣A￣A-3’,反義鏈5’-G￣C￣T￣G￣G￣A￣G￣A￣C￣A￣T￣C￣G￣C￣T￣G￣T￣C￣A￣T-3’;BAX正義鏈5’-A￣G￣A￣C￣A￣G￣G￣G￣G￣C￣C￣T￣T￣T￣T￣T￣G￣C￣T￣A￣C-3’反義鏈5’-A￣A￣T￣T￣C￣G￣C￣C￣G￣G￣A￣G￣A￣C￣A￣C￣T￣C￣G-3’; BCL2 正義鏈5’-G￣C￣T￣A￣C￣C￣G￣T￣C￣G￣T￣G￣A￣C￣T￣T￣C￣G￣C-3’反義鏈 5’-C￣C￣C￣C￣A￣C￣C￣G￣A￣A￣C￣T￣C￣A￣A￣A￣G￣A￣A￣G￣G￣F￣Z￣D9-3’;FZD9正義鏈5’-C￣G￣C￣A￣C￣G￣C￣A￣C￣T￣C￣T￣G￣T￣A￣T￣G￣G￣A￣G-3’，反義鏈 5’-G￣C￣C￣G￣A￣G￣A￣C￣C￣A￣G￣A￣A￣C￣A￣C￣C￣TC-3’；RCAN1正義鏈 5’-C￣T￣C￣C￣T￣C￣C￣C￣G￣T￣T￣G￣G￣C￣T￣G￣G￣A￣A￣A-3’，反義鏈 5’-C￣T￣G￣G￣G￣A￣G￣T￣G￣G￣T￣G￣T￣C￣T￣G￣T￣C￣G￣C-3’; PLARU正義鏈 5’-G￣A￣C￣T￣A￣C￣C￣G￣T￣G￣C￣T￣T￣C￣G￣G￣G￣A￣A￣T￣G -3’，反義鏈5’-A￣T￣G￣G￣T￣C￣C￣T￣G￣T￣T￣G￣G￣T￣C￣T￣T￣T￣T￣C￣G-3’。

免疫熒光腎組織先進行冰甲醇固定15～20 min、0.5% trionx-100透化10 min、5%BSA封閉30 min，再孵育一抗4℃過夜，然后用相應的熒光二抗避光孵育15 min，DAPI染核15 min，封片，共聚焦顯微鏡下觀察，所用圖片均在400倍油鏡下拍攝。

染色質免疫共沉淀(chromatin Immunoprecipitation，CHIP)：甲醛處理并收集足細胞，超聲破碎，然后加入KLF15抗體，與KLF15蛋白-NFATc1 DNA復合物相互結合，加入Protein A結合KLF15抗體-KLF15蛋白-NFATc1 DNA復合物，并沉淀，清洗，得到富集的KLF15蛋白-NFATc1 DNA復合物，加熱解交聯(lián)，純化富集的NFATc1 DNA片斷通過PCR分析，PCR特異擴增NFATc1啟動子-984/-1 861 bp區(qū)域，引物序列NFATc1正義鏈5’-T￣C￣C￣C￣C￣A￣A￣G￣G￣T￣C￣T￣C￣G￣G￣G￣T￣G￣G￣G-3’，反義鏈5’-T￣T￣C￣C￣G￣T￣C￣C￣C￣C￣G￣C￣C￣C￣T￣T￣C￣C￣C￣T-3’。

流式細胞儀檢測細胞凋亡收集各組足細胞，用Binding Buffer重懸足細胞，在足細胞懸液中先加入Annexin V-APC避光孵育15 min，再加入PI后，在1h內用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

統(tǒng)計學方法利用《SPSS 22.0》進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布計量資料用均數(shù)±標準差表示，組間比較用單因素方差分析，兩組間比較用LSD檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

KLF15在腎小球疾病患者的足細胞中表達降低用免疫熒光染色通過synaptopodin定位足細胞，觀察正常腎小球足細胞與病變腎小球足細胞中KLF15的表達，發(fā)現(xiàn)與正常腎小球相比，病變腎小球足細胞中的KLF15的表達明顯降低(圖1)。

足細胞KLF15在損傷刺激后表達明顯降低足細胞用含0.25 μg/ml ADR、含30 mmol/L葡萄糖、含100 μg/L LPS的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)24h、48h、48h，通過RT-PCR和Western Blot檢測KLF15的mRNA和蛋白表達，發(fā)現(xiàn)與空白對照組相比,ADR組、LPS組以及HG組中KLF15的表達明顯降低(圖2)。

圖2 KLF15在ADR、LPS、HG刺激體外培養(yǎng)的足細胞中表達降低A：KLF15的mRNA水平表達；B、C：KLF15的蛋白水平表達；KLF15：Krüppel樣因子15；CON：空白對照組；ADR：阿霉素；LPS：脂多糖；HG：高糖；*：與CON組相比P<0.05,**: 與CON組相比P<0.01,***: 與CON組相比P<0.001

過表達KLF15對足細胞的保護作用通過腺病毒感染足細胞過表達KLF15后，通過RT-PCR、Western Blot驗證KLF15的過表達效率，結果顯示過表達效率很高(圖3A、B)；足細胞在過表達KLF15后通過Western Blot、RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)與對照組相比，在mRNA及蛋白水平，促凋亡蛋白BAX表達降低(P<0.01)，抗凋亡蛋白BCL2表達升高(P<0.05)(圖3C、D)；分別在含有LPS(100 μg/ml)、ADR(0.25 μg/ml)、HG(30 mmol/L)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，檢測細胞凋亡情況，結果發(fā)現(xiàn)，過表達KLF15組比對照組凋亡減少(P<0.05)見圖3E、圖3F，過表達KLF15后給予ADR、LPS、HG等培養(yǎng)后與對照組給予ADR、LPS、HG培養(yǎng)相比凋亡減少(P<0.05)(圖3G～L)。

轉錄因子KLF15對NFATc1表達的調控足細胞過表達KLF15后，通過RT-PCR、 western blot檢測NFATc1的表達，結果發(fā)現(xiàn)，過表達KLF15后NFATc1的表達降低(P<0.05)(圖4A、B)；足細胞LPS(100 μg/ml)處理48h后，按照ChIP試劑盒的操作流程，通過普通瓊脂糖凝膠電泳檢測、RT-PCR定量分析發(fā)現(xiàn)，轉錄因子KLF15與NFATc1的啟動子區(qū)域存在結合，并且在LPS刺激后結合減少(P<0.001)(圖4C、D)；KLF15可通過結合NFATc1抑制其下游靶基因FZD9、RCAN1、PLAUR表達，從而抑制NFATc1活性(圖4E)。

地塞米松通過KLF15保護足細胞的機制有研究發(fā)現(xiàn)[7]，糖皮質激素可通過升高KLF15的表達促進足細胞分化，本研究通過對足細胞在含10umol/L地塞米松培養(yǎng)基中培養(yǎng)不同時間段后用RT-PCR檢測KLF15的表達發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，在含地塞米松培養(yǎng)基中培養(yǎng)6h、12h、24h、48h后，KLF15的表達明顯上調(P<0.05)(圖5A)；通過RT-PCR及Western Blot檢測不同時間點足細胞中NFATc1的表達，發(fā)現(xiàn)NFATc1的表達明顯下調(P<0.05)，其中以24h最為明顯(P<0.01)(圖5B、C)。

圖3 過表達KLF15對足細胞凋亡的影響A、B：mRNA、蛋白水平驗證過表達KLF15效率；C：過表達KLF15后BAX、BCL2的mRNA表達；D：過表達KLF15后BAX、BCL2的蛋白表達；E：EGFP組流式凋亡圖；F：KLF15組流式凋亡圖；G：EGFP+ADR組流式凋亡圖；H：KLF15+ADR組流式凋亡圖；I：EGFP+LPS組流式凋亡圖；J：KLF15+LPS組流式凋亡圖；K：EGFP+HG組流式凋亡圖；L：KLF15+HG組流式凋亡圖；M：細胞凋亡定量統(tǒng)計結果；KLF15：Krüppel樣因子15；BAX：促凋亡蛋白；BCL2：抗凋亡蛋白；EGFP：增強綠色熒光蛋白；ADR：阿霉素；LPS：脂多糖；HG：高糖； *：與對照組相比P<0.05,**: 與對照組相比P<0.01，***: 與對照組相比P<0.001

圖4 轉錄因子KLF15對NFATc1表達的調控CON：空白對照組，LPS：脂多糖處理組，Input：陽性對照組，IgG組抗體為IgG(陰性對照組)，KLF15組抗體為KLF15;A：RT-PCR示過表達KLF15后NFATc1的mRNA表達；B：Western Blot示過表達KLF15后NFATc1蛋白表達；C：染色質免疫共沉淀(CHIP)后普通瓊脂糖凝膠電泳，引物為針對NFATc1的啟動子區(qū)域序列；D：CHIP針對NFATc1啟動子區(qū)域進行的RT-PCR定量分析(C、D兩者為不同類型實驗)；E：NFATc1下游靶基因mRNA表達； *：與對照組相比，P<0.05；**：與對照組相比，P<0.01；***:與對照組相比，P<0.001；NFATc1:活化T細胞核因子胞質1型

圖5 地塞米松處理不同時間點NFATc1、KLF15表達NFATc1:活化T細胞核因子胞質1型;KLF15:Krüppel樣因子15;A：地塞米松處理不同時間點足細胞中KLF15的mRNA表達水平；B： 地塞米松處理不同時間點足細胞中NFATc1 mRNA表達；C、D：地塞米松處理不同時間點足細胞中NFATc1的蛋白表達；*：與對照組(0h)相比，P<0.05,**：與對照組(0h)相比，P<0.01

討 論

蛋白尿是導致終末期腎病的重要危險因素之一[9]，足細胞作為腎臟濾過功能的最后屏障，足細胞損傷是蛋白尿產(chǎn)生的重要病理基礎。足細胞損傷在糖尿病腎病及其他導致蛋白尿腎病中常表現(xiàn)為足突融合[10]，進而導致足細胞的死亡、脫落及數(shù)量減少，但足細胞的損傷機制尚不完全清楚，是近年來慢性腎病的研究熱點。

KLF15是轉錄因子Krüppel-like factors家族中的一員，最早發(fā)現(xiàn)于果蠅體內，與果蠅的Krüppel蛋白結合[3]。人體內已被發(fā)現(xiàn)的KLFs包含KLF1-KLF18，已知KLF2、KLF4、KLF5、KLF6、KLF15參與到腎臟疾病調節(jié)中。有研究發(fā)現(xiàn)，KLF15是促進果蠅腎原細胞分化的關鍵調節(jié)因子[11]；KLF15參與調節(jié)足細胞的分化，敲除KLF15的小鼠與野生型相比有更嚴重的蛋白尿，并且足細胞分化減少[12]。本研究發(fā)現(xiàn)在腎小球疾病患者足細胞中KLF15的表達降低；通過給予足細胞ADR、LPS、HG三種損傷處理發(fā)現(xiàn)KLF15的表達明顯下調；通過對足細胞過表達KLF15后發(fā)現(xiàn)，促凋亡蛋白BAX表達降低，抗凋亡蛋白BCL2表達升高，并通過流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)，過表達KLF15后，足細胞凋亡降低，而且在損傷刺激下的足細胞，過表達KLF15后相比于對照組，凋亡明顯下降，進一步說明KLF15可顯著減少足細胞損傷，這提示，KLF15在足細胞中是一個保護性因子，而KLF15保護足細胞的具體機制尚不明確。

以往研究發(fā)現(xiàn)[13]，生理狀態(tài)的NFAT磷酸化位于細胞漿中，經(jīng)典的CaN-NFATc1調節(jié)通路中，在損傷刺激時，Ca2+流入后活化鈣調磷酸酶(CaN)介導NFATc1脫磷酸入核從而介導下游靶基因FZD9、RCAN1、PLARU轉錄,FZD9、RCAN1的轉錄可直接導致足細胞功能紊亂[14]，PLAUR編碼蛋白uPAR增加足細胞的活動性可促進足細胞的脫落，引起足細胞損傷[15]；NFATc1的活化可通過升高促凋亡蛋白BAX促進足細胞凋亡[16]，導致腎小球硬化[14]，除此之外，NFATc1還被發(fā)現(xiàn)在糖尿病腎病中活性增強，參與到糖尿病腎病足細胞損傷進程[17]；國內外研究及本課題組[8,17-19]發(fā)現(xiàn)，RANK，ATF3,SOS2等分子都可通過調節(jié)NFATc1影響足細胞損傷；有研究通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)[7]，KLF15與NFATc1的啟動子區(qū)域可能存在結合。本研究通過對足細胞過表達KLF15觀察NFATc1的表達發(fā)現(xiàn)，過表達KLF15的足細胞NFATc1的表達明顯下調，并通過CHIP實驗證實，KLF15與NFATc1的啟動子區(qū)域結合，并在損傷刺激下結合減弱，足細胞過表達KLF15后NFATc1的下游靶基因FZD9、RCAN1、PLAUR表達減少，表明KLF15可通過抑制NFATc1的表達而保護足細胞。

糖皮質激素因為其強大的抗炎作用而被廣泛用于各種腎臟疾病的治療中，研究證實，人類足細胞中存在糖皮質激素受體[20]，糖皮質激素可以直接對足細胞起作用并對足細胞分化有著重要作用[21-22]，但糖皮質激素對于足細胞分化調節(jié)的具體分子機制尚不明確。近年研究發(fā)現(xiàn)[7]，糖皮質激素可通過升高KLF15的表達來促進足細胞分化，在LPS誘導小鼠腎損傷模型中，地塞米松可明顯改善小鼠蛋白尿水平，而在KLF15敲除鼠中，地塞米松不能改善小鼠蛋白尿，說明KLF15表達受抑制后地塞米松的治療效果明顯降低，KLF15是地塞米松的直接治療靶點。本研究中，通過用地塞米松處理足細胞6h、12h、24h、48h發(fā)現(xiàn)，KLF15的表達水平顯著升高，并且NFATc1的表達降低，表明糖皮質激素有可能通過KLF15-NFATc1通路保護足細胞。

本研究首次探討了轉錄因子KLF15通過抑制NFATc1信號通路保護足細胞的可能機制，豐富了NFATc1的分子調節(jié)機制，在經(jīng)典CaN-NFATc1通路之外從基因轉錄水平探索了NFATc1調節(jié)新思路，為臨床治療蛋白尿及慢性腎小球疾病提供新策略；KLF15是否還通過其他分子途徑保護足細胞尚待進一步探索；本研究還初步探索了糖皮質激素保護足細胞可能的新的分子機制，豐富了糖皮質激素的作用機制，但糖皮質激素是否通過KLF15抑制NFATc1、糖皮質激素在ADR、HG誘導的足細胞損傷的治療效果尚待進一步研究。