杜婷婷，李軍*，曹春莉，陳銘，徐麗紅，馬婷，王甲嘉，葛肖艷，劉閃閃，童瑾

(1 石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院超聲科,新疆 石河子832008;2 石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院消化內科,新疆 石河子832008;3 石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院普外科，新疆 石河子832008)

慢性肝臟疾病是嚴重危害人類健康的常見病，可引起持續(xù)、反復的肝實質炎癥以及壞死，使肝臟內彌漫性細胞外基質過度沉積而降解不足進而形成肝纖維化[1-2]。門靜脈壓隨著肝硬化程度的加重而增加、升高。肝靜脈壓力梯度(Hepatic Venous Pressure Gradient，HVPG)、術中游離門靜脈壓(Free Portal Pressure，FPP)是公認的評價門靜脈壓力的可靠指標[3]，但是HVPG及 FPP 的檢測具有侵入性，對患者的要求較高，很難在臨床大規(guī)模應用，尤其是偏遠地區(qū)。因此非侵入性、簡單易行、診斷效能高的門靜脈壓力評估方法成為近年的研究的熱點。

聲脈沖輻射力彈性成像(Acoustic Radiation Force Impulse Elastography，ARFI)[4-6]作為一種新的彈性成像技術，它通過測量感興趣區(qū)(Region of Interest,ROI)的剪切波速度(Shear Wave Velocities,SWV)來評估組織彈性，即組織的硬度或質地，已廣泛應用腹部及淺表器官疾病的定性診斷。超聲造影(Contrast Enhanced Ultrasound，CEUS)在超聲醫(yī)學中占有重要的地位，可以清楚地顯示組織微小血管內的血流灌注，增加圖像的可分辨清晰度，增加超聲病變檢出率及對慢性肝病發(fā)生纖維化診斷的敏感性和特異性[7-8]。

本研究構建了不同程度的兔肝纖維化模型，進行ARFI和CEUS檢查，將此兩種方法獲得的影像學參數與所測FPP進行對照研究，研究各參數與FPP的相關性，尋找能較準確評價FPP的參數，并獲取該參數的截斷值，為臨床診斷及治療PHT提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 兔肝纖維化模型的建立方法

選用健康新西蘭大白兔44只，隨機抽取8只作為對照組，背部皮下注射0.9%氯化鈉溶液，剩余36只作為實驗組，背部皮下注射純CCl4，2次/周，共16周，起始劑量為0.3 mL/kg，3周后增加劑量為0.4 mL/kg，5周后增加劑量為0.5 mL/kg，此后維持劑量在0.5 mL/kg。

1.2 聲脈沖輻射力彈性成像技術(ARFI)檢測活體及離體兔肝硬度的方法

活體兔聲脈沖輻射力彈性成像技術(ARFI)檢測使用西門子公司生產的Acuson S 2000彩色多普勒超聲診斷儀，9 L4探頭，頻率4～9 MHz，配置VTQ定量分析系統(tǒng)，探查深度0.5～4 cm，于第一次造模后第4、6、8、10、12、14周，分別從實驗組隨機選取3～6只新西蘭大白兔，對照組隨機選取1只，第16周處死剩余實驗組及對照組兔，所有需行檢查的兔當日禁食水、空腹8 h，8%水合氯醛鹽溶液2 mL/kg耳緣靜脈緩慢推注進行麻醉。麻醉后進行固定，充分暴露其腹部送至腹部彩超室接受檢查。由同1名高年資超聲醫(yī)師對所有受試兔進行常規(guī)超聲檢查及ARFI檢查，記錄肝臟大小、邊緣狀態(tài)、實質回聲、肝動脈、門靜脈、肝靜脈的血流方向及速度等情況，在二維超聲的基礎上，采用ARFI技術檢測兔肝臟橫向剪切波速度SWV(m/s)。待兔門靜脈壓力測量完成后，利用空氣栓塞法處死實驗兔，并快速結扎兔肝臟血管及周圍韌帶并游離出兔肝臟，然后取出兔肝進行ARFI檢測，離體兔肝剪切波速度記為SWV1，感興趣區(qū)域(ROI)的選擇應避開肝內管道系統(tǒng)，取樣深度為0.5～2 cm，檢測10次，最后取平均值。

1.3 超聲造影技術(CEUS)檢測兔肝血流動力學方法

使用日立Ascendus(日本Hitachi公司)超聲診斷儀，L52線振探頭(頻率3～7 MHz)，造影軟件為EZU-CH9，造影劑采用SonoVue。

全部聲學造影檢測為具備10年以上工作經驗的腹部超聲醫(yī)生完成，ARFI檢查結束后，先行常規(guī)二維超聲及彩色多普勒超聲檢查，在兔肝臟尋找一個能同時包含有肝動脈、肝靜脈及門靜脈的切面并開啟造影模式，在開始注射造影劑的同時開始錄像并計時，持續(xù)錄像3 min。將感興趣區(qū)域(ROI)放在兔肝實質、門靜脈、肝靜脈以及肝動脈上。對于血管，始終使ROI保持在血管結構內，對于肝實質，放置在距離超聲探頭1～4 cm的深度，同時避開肝內管道結構。

超聲造影錄像中前5 s的平均值被定義為基線強度。肝靜脈到達時間(HVAT)、肝動脈到達時間(HAAT)、門靜脈到達時間(PVAT)被定義為相應ROI內注射時間點至強度達到基線值的10%以上的時間間隔[7]。

PSI是肝實質達峰強度與基礎強度的差值。PV-HAAT(即PVAT減去HAAT所得值)、HV-HAAT(即HVAT減去HAAT所得值)被計算出以減少人為以及血液循環(huán)時間不同所造成的影響。超聲造影分析的主要方法如圖1所示。

A—造影基礎圖像； B—造影劑到達肝動脈圖像(箭頭);C—造影劑到達門靜脈圖像(箭頭);D—造影劑到達肝靜脈圖像(箭頭)圖1 肝纖維化F3期兔的超聲造影圖(肝動脈、門靜脈和肝靜脈到達時間分別為4、5、7秒)Fig.1 The arrival time of hepatic artery(portal vein and hepatic vein was 4 seconds,5 seconds,7 seconds for New Zealand rabbit of cirrhosis,respectively)

1.4 兔術中游離門靜脈壓力(FPP)測量方法

兔完成CEUS檢測后，消毒后經上腹部肋骨下緣切口進腹，游離韌帶后選擇一支較粗的大網膜上的靜脈進行FPP測量，充分暴露并游離好該靜脈，然后將一根靜脈輸液管內注滿生理鹽水并與靜脈留置針相連，同時夾閉輸液管末端，將靜脈留置針刺入已游離好的靜脈并進行固定，將輸液管垂直提起，并開放輸液管的末端，至輸液管中液體自然下落并處于穩(wěn)定狀態(tài)時，選取腰椎前緣水平為“0”點，進行液面高度測量，所測量的高度值就是門靜脈自由壓(cmH2O)。

1.5 兔肝纖維化病理分期診斷方法

兔Masson染色后的切片均由病理科主治醫(yī)師及以上職稱的醫(yī)生獨立盲法閱片診斷，分期標準依據Metavir分期法[9](2000年全國病毒性肝炎病理診斷標準)。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行數據分析。不同肝纖維化病理分期組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，各組均數間的比較采用最小顯著差值法(Least-Significant Difference，LSD)。采用Spearman相關、Pearson相關性分析檢驗SWV、SWV1、HVAT、HV-HAAT與LF病理分期以及FPP的相關性。。利用曲線下面積(Area Under the Curve，AUC)驗證ARFI技術和CEUS技術參數診斷門靜脈壓力的效果。以P<0.05為統(tǒng)計學檢驗水準。

2 結果

2.1 兔肝纖維化病理學分期結果

病理檢查結果示：對照組兔肝臟病理學檢查均正常；36只實驗組最終造模成功32只，肝纖維化分期為F1期6只、F2期10只、F3期8只、F4期8只，伴有或不伴炎癥壞死，造模成功率為88.89%(32/36)，各分期病理如圖2所示。

A—對照組；B—F1期；C—F2期；D—F3期；E—F4期；Masson染色(×40)圖2 兔肝纖維化病理分期Masson染色病理表現(×40)Fig.2 Pathological fibrosis staging in rabbits’liver tissue by Masson staining with a magnification(×40)

2.2 聲脈沖輻射力彈性成像技術(ARFI)評估兔門靜脈壓力結果

實驗組及對照組的肝纖維化各分期彈性參數SWV、SWV1檢測結果見表1，各組間彈性參數比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.001)(表1)。

表1 兔纖維化各分期彈性參數(SWV、SWV1)組間比較結果Tab.1 The value of SWV and SWV1 in different stages of liver fibrosis

注：a、b、c、d、e分別表示與對照組、實驗組F1期、F2期、F3期、F4期比較，差異有統(tǒng)計學意義，P<0.05。

與肝纖維化病理分期及實際所測門靜脈壓力值為標準進行對照，研究彈性成像參數對于判斷肝纖維化程度及門靜脈壓力的相關性。各纖維化分期FPP測量所得值差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖3)。

注：a、b、c、d分別表示與對照組、實驗組F1期、F2期、F3期比較，差異有統(tǒng)計學意義，P<0.05。圖3 各纖維化病理分期兔游離門靜脈壓的比較Fig.3 The copmparison of FPP in different stages of liver fibrosis

Spearman相關分析顯示SWV、SWV1、FPP均與LF分期相關，相關系數分別為0.935、0.921、0.940(P<0.001)(表2)。SWV、SWV1與FPP的Pearson相關系數分別為0.857、0.947，均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)(表2)。FPP和SWV、SWV1的線性相關關系(圖4)。

表2 SWV、SWV1、HVAT、HV-HAAT、LF分期與FPP的相關性Tab.2 The correlation among the SWV,SWV1,HVAT,HV-HAAT,stages of LF and FPP

注：*表示采用Spearman相關系數分析。

圖4 SWV、SWV1與FPP之間相關性的散點圖Fig.4 The scatter plot of the SWV,SWV1 and FPP

2.3 超聲造影技術(CEUS)評估兔門靜脈壓力結果

應用CEUS技術，通過監(jiān)測造影劑在肝內的循環(huán)時間獲取肝臟血流動力學參數：肝動脈灌注時間、門靜脈灌注時間、肝靜脈灌注時間、肝實質峰值強度等。本次研究共記錄并分析了HVAT、HV-HAAT、HAAT、PAVT、PSI等超聲造影參數，結果可見不同纖維化程度組間HVAT、 HV-HAAT 參數差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.001)，而HAAT、PVAT未見差異(表3)。與肝纖維化病理分期及實際所測門靜脈壓力值為標準進行對照，研究造影參數對于判斷門靜脈壓力的相關性。Spearman相關分析顯示HVAT、HV-HAAT與LF分期相關，相關系數分別為0.986、-0.842(P<0.001)(表2)。HVAT、HV-HAAT與FPP的Pearson相關系數分別為-0.587、-0.652，均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，(表2)。FPP和HVAT、HV-HAAT的線性相關關系如圖5所示。

表3 不同肝纖維化程度兔的CEUS參數比較Tab.3 The comparison of CEUS parameters of different liver fibrosis degree

注：a、b、c、d、e分別表示與對照組、實驗組F1期、F2期、F3期、F4期比較，差異有統(tǒng)計學意義，P<0.05。

圖5 HVAT、HV-HAAT與FPP之間相關性的散點圖Fig.5 The scatter plot of the HVAT,HV-HAAT and FPP

3 討論

PHT是慢性肝臟疾病和肝硬化的一個嚴重并發(fā)癥，肝病患者門靜脈壓力的改變常常伴隨著較多異常的臨床表現。因此，準確評估PHT對評估患者疾病狀態(tài)和預后至關重要[10-11]，肝靜脈壓力梯度(HVPG)、術中游離門靜脈壓(FPP)的測量是評價門脈高壓是否存在和嚴重程度的金標準，但HVPG的測量并不是在所有的中心都可以開展，而且這種技術是侵入性的，有些患者并不愿意接受。更為重要的，臨床上需要用可重復的檢測方法來監(jiān)測療效。ARFI技術可以用于肝臟硬度參數SWV和SWV1的測量，CEUS技術可以用于肝血管和肝組織的血流灌注參數的測量。因此，探討ARFI、CEUS技術評價門靜脈壓力具有一定的臨床意義。

本研究結果顯示新西蘭大白兔經ARFI技術檢測彈性參數SWV與肝纖維化程度正相關(P<0.001)。在超聲造影中，隨著肝纖維化的加重，僅HVAT、HV-HAAT兩個參數在評價肝硬化(F=4)時差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且隨著肝纖維化的加重逐漸減少，其余參數(HAAT、PVAT、PSI)在本次研究中未發(fā)現統(tǒng)計學差異。HVAT、HV-HAAT發(fā)生變化的主要理論基礎是肝纖維化過程中假小葉形成以及門靜脈的壓力增高，由于動靜脈分流和毛細血管動脈化，導致HV-HAAT在嚴重纖維化(F≥3)時明顯縮短。Augustin等[12]報道，隨著肝纖維化的加劇，門靜脈壓力越來越高，肝臟硬度也逐漸增大。有研究表明，慢性肝病患者的門靜脈高壓的嚴重程度與一些CEUS參數密切相關，如HVAT、HV-HAAT[13-14]，提示CEUS可能用于門靜脈壓力的評估。本次研究通過分析上述參數與FPP的相關性，旨在尋找可以有效、無創(chuàng)監(jiān)測肝纖維化過程中患者門靜脈壓力的新方法。本次實驗采用導管法測量兔FPP，結果表明，雖然病理纖維化分期組間FPP僅在F4期與其他各期時間有統(tǒng)計學差異，但是可以看出隨著肝纖維化的加重，FPP也逐漸增大。這與Zhai L等[15]一項關于CEUS技術評估犬肝纖維化過程中門靜脈壓力改變的研究結果相似。本研究進一步驗證了SWV、SWV1、HVAT、HV-HAAT及LF分期與FPP均具有相關性(r=0.857、0.947、-0.587、-0.652、0.940，P均<0.001)，隨著SWV、SWV1的增高，FPP逐漸增加，提示肝臟質地變硬，剪切波傳播速度變快；而隨著HVAT、HV-HATT的增高，FPP呈現逐漸減小的趨勢。

綜上所述，彈性成像ARFI技術、超聲造影技術參數與兔門靜脈壓力具有較好的相關性，是評價兔門脈高壓的潛在技術。