海 艷, 李 妍, 方治豪, 王凱濤, 任毓忠

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點實驗室，新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意義】大花金雞菊(Coreopsisgrandiflora)別稱大花波斯菊，屬菊科(Compositae)金雞菊屬(Coreopsis)植物，原產(chǎn)美洲的觀賞植物，我國大部分地區(qū)均有栽培，花期較長，其花富含蜜源，并可提取色素。該屬植物的主要化學(xué)成分具有降脂、降壓、降糖、抗氧化及抗炎作用等,也使其應(yīng)用于藥用、食用、工業(yè)用途中[1]。目前，白粉病是大花金雞菊的主要病害之一，白粉病菌主要感染金雞菊的葉片、莖稈和花器，發(fā)生嚴重時整個植株被白粉覆蓋，導(dǎo)致葉片和植株早衰，甚至枯萎死亡，影響金雞菊觀賞價值和生長[2]?！厩叭搜芯窟M展】已報道的能夠感染菊科植物的白粉病菌主要有單囊殼屬的Podosphaeraxanthii和P.fusca，戈洛文白粉菌屬的Govoinomycescichoracearum，白粉菌屬的Erysiphearcuata，以及內(nèi)絲白粉菌屬的Leveillulalactucae等[3-8]，Garibaldi等報道了P.fusca是意大利引起金雞菊白粉病的病原菌，但研究內(nèi)容主要以病原形態(tài)特征的描述及病原鑒定為主，關(guān)于病害在不同地區(qū)發(fā)生規(guī)律及具體防治措施的研究鮮有涉及。尤其在新疆，金雞菊作為新近引進的觀賞花卉，病害的研究不夠深入。【本研究切入點】2018年5～8月，新疆石河子市區(qū)金雞菊上嚴重發(fā)生白粉病，但目前新疆對金雞菊白粉病的研究較少，關(guān)于病害在當?shù)氐陌l(fā)生規(guī)律未見報道。研究新疆石河子地區(qū)大花金雞菊白粉病的病原種類?！緮M解決的關(guān)鍵問題】鑒定石河子地區(qū)金雞菊白粉病的病原，系統(tǒng)研究病害在石河子市區(qū)的發(fā)生規(guī)律，為白粉病菌的系統(tǒng)進化及病害防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗所用的金雞菊白粉病標本于2018年5～8月采自新疆石河子市區(qū)明珠河公園內(nèi)，采集田間表現(xiàn)明顯白粉病癥狀的樣本帶回室內(nèi)鑒定。

1.2 方 法

1.2.1 田間癥狀觀察

從田間病害發(fā)生初期開始，每隔一段時間觀察田間病害的癥狀變化及病害發(fā)生情況，包括發(fā)病部位、病斑的顏色、大小、病株的生長狀況以及閉囊殼的產(chǎn)生等。

1.2.2 病菌形態(tài)學(xué)鑒定

將新鮮采集的病樣帶回室內(nèi)采用膠帶粘帖法觀察和測量病菌無性時代的特征；將新鮮病葉用透明膠帶在病斑上粘貼后，水做浮載劑，用顯微鏡(MOTIC BA300)觀察和測量菌絲體的形態(tài)、分生孢子梗的形狀、大小，分生孢子的著生方式、形態(tài)、大小等。待病株上產(chǎn)生黑色小點的閉囊殼后，用解剖針挑取閉囊殼，顯微觀察并測量閉囊殼的形狀、大小，附屬絲的形態(tài)、數(shù)量、長度，閉囊殼內(nèi)子囊的數(shù)量、形態(tài)、大小以及子囊內(nèi)子囊孢子的數(shù)量、形態(tài)、大小等[6,7]。依據(jù)觀察和測定結(jié)果，參照白粉病菌鑒定特征，確定引起新疆大花金雞菊白粉病的病原[8-10]。

1.2.3 病菌 rDNA-ITS區(qū)序列的擴增1.2.3.1 病菌基因組DNA的提取和PCR擴增

將新鮮發(fā)病的葉片采集后，室內(nèi)用干凈的毛筆將葉片上的病菌收集后，用BioFlux公司真菌基因組DNA提取試劑盒，提取大花金雞菊白粉病病原菌基因組DNA。ITS區(qū)通用引物為 ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')、ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'')由上海生工生物工程有限公司合成，PCR擴增 ITS 區(qū)片段，電泳觀察目標片段的大小[11,12]。

1.2.3.2 病菌rDNA-ITS區(qū)序列

將PCR擴增后的目標片段送交上海生工生物工程有限公司進行測序，測序后的結(jié)果在NCBI 的 GenBank 核酸數(shù)據(jù)庫中進行 BLAST，獲得與該序列同源性較高的ITS區(qū)序列，同時通過查閱資料，下載已報道的能引起金雞菊屬或菊科其他植物白粉病的病菌ITS區(qū)序列，用Mega6.0 軟件進行序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.2.3.3 發(fā)病規(guī)律的調(diào)查

從2018年4月18日田間出現(xiàn)病害開始，每隔7 d定點觀察白粉病在金雞菊上的擴展蔓延情況至2018年7月31日，統(tǒng)計田間的發(fā)病率及病情指數(shù)，病害分級標準以整株葉片平均病斑覆蓋率為基礎(chǔ)，分級標準如下：

0級:白粉病病斑葉片覆蓋率0%; 1級: 白粉病病斑葉片覆蓋率0%～25%; 2級:白粉病病斑葉片覆蓋率25%～50%; 3級:白粉病病斑葉片覆蓋率50%～75%; 4級: 白粉病病斑葉片覆蓋率75%～100%。

圖1 大花金雞菊白粉病癥狀
Fig.1 Symptoms of powdery mildew onCoreopsisgrandiflora

2 結(jié)果與分析

2.1 金雞菊發(fā)病癥狀

金雞菊白粉病菌主要侵染葉片正面，也可侵染葉片背面，發(fā)病初期寄主葉片正面出現(xiàn)白色圓形或無定形絮狀斑片(圖1-A)，隨后逐漸擴大并連成片狀白粉斑(圖1-B)，由于菌絲體在寄主表面蔓延并且產(chǎn)生分生孢子和分生孢子梗，而寄主葉片受害部位不會迅速死亡，表現(xiàn)出褪綠、變黃；在莖稈、花器上產(chǎn)生白色圓形或無定形斑片逐漸加重形成霉層，后期在葉背面霉層上產(chǎn)生大量的黑色小點，即病菌的閉囊殼(圖1-C)，往往在寄主生長后期產(chǎn)生，同時葉正面霉層上分布少量閉囊殼。病菌嚴重時，白粉斑布滿莖稈(圖1-D)、花器(圖1-E)、整個葉片，更為嚴重時可導(dǎo)致整個植株死亡。圖1

2.2 白粉病菌形態(tài)

將發(fā)病葉片在解剖鏡下觀察，閉囊殼呈散生分布；在顯微鏡下進行形態(tài)觀察，大花金雞菊白粉病菌的分生孢子梗直或稍彎曲，無分枝，長度為68.3～97.6 μm(圖2-A)，有2～5個分隔，分生孢子串生，橢圓形、長橢圓形、圓筒形(圖2-B)，大小為24.4～34.2 μm×14.6～22.0 μm，2～4個分生孢子串生在分生孢子梗上。閉囊殼深棕色、球形或近球形、成熟閉囊殼表面布滿凹凸不平的紋路，直徑為96.3～139.0 μm(圖2-C)，閉囊殼上著生9～15根附屬絲，附屬絲菌絲狀，附屬絲長度為73.2～112.2 μm，閉囊殼內(nèi)只有1個子囊(圖2-D)，子囊為雙層壁，橢圓形、無色且有柄，大小為68.3～131.7 μm×56.1～80.5 μm (圖2-E)，子囊內(nèi)含8個子囊孢子，子囊孢子形狀橢圓形，大小為14.6～26.8 μm×12.2～21.7 μm。其與棕絲單囊殼P.fusca的特征基本一致，引起新疆石河子市區(qū)大花金雞菊白粉病的病原確定為棕絲單囊殼P.fusca。圖2

A:分生孢子梗; B:分生孢子; C:閉囊殼和附屬絲; D:閉囊殼內(nèi)單子囊; E:子囊和子囊孢子

A:Conidiophores; B:Conidia; C:Chasmothecia and Appressoria; D: Chasmothecia containing single asci; E:Asci and Ascospores

圖2 大花金雞菊白粉病菌病原
Fig. 2 Morphological characteristics of powdery mildew onCoreopsisgrandiflora

2.3 rDNA-ITS序列的擴增

通過真菌核糖體 ITS 區(qū)通用引物 ITS1 和 ITS4，以大花金雞菊白粉病菌DNA 為模板，PCR擴增大花金雞菊白粉病菌DNA的 ITS 區(qū)，在35個循環(huán)后經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測得到563 bp的目的片段。在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中，對大花金雞菊白粉病菌進行BLASTn同源序列搜索，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，發(fā)現(xiàn)目的序列(Corecpsis-2)與來自中國大花金雞菊、佩蘭、朝天委陵菜及黃金菊白粉病菌P.fusca( 登錄號分別為KM225763、JX546297、KR049083和EU424056)的親緣關(guān)系最近，聚在同一個分支，同源性達到100%，而與來自中國的河西菊上的 Leveillula lactucae( 登錄號HQ821500) 親緣關(guān)系最遠，同源性僅為88.1%；與寄生于菊科植物上的其他白粉病菌的親緣關(guān)系相對較遠。將引起新疆石河子地區(qū)大花金雞菊白粉病的病菌確定為棕絲單囊殼P.fusca。 圖3

2.4 發(fā)病規(guī)律

研究表明,大花金雞菊白粉病在石河子地區(qū)從4月中旬開始發(fā)生并在下部葉片上出現(xiàn)癥狀，隨后病情指數(shù)迅速上升，至6月下旬達到病害的盛發(fā)期，白粉病菌開始為害莖稈、花器，并在6月上旬在被害部位出現(xiàn)閉囊殼，6月底至7月上旬逐漸趨于平穩(wěn)，7月上旬后隨著花期的結(jié)束病情指數(shù)開始下降，之后金雞菊平茬后病害逐漸消退，葉片上病斑面積及閉囊殼數(shù)量明顯開始減少，完成金雞菊白粉病的季節(jié)流行過程。圖4

圖3 根據(jù)ITS序列構(gòu)建的病原菌系統(tǒng)進化樹
Fig. 3 Phylogenetic analysis based on rDNA ITS sequences

圖4 大花金雞菊白粉病發(fā)病規(guī)律
Fig. 4 Occurrence regularity ofCoreopsisgrandiflora

3 討 論

棕絲單囊殼白粉菌(P.fusca)是造成菊科植物白粉病常見的病原之一，在世界各地廣泛分布，趙震宇等[8]報道，該病菌在新疆的主要寄主有小蓬屬(Nanophyton)、飛蓬(Erigeron.spp)、千里光屬(Senecio)、蒲公英屬(Taraxacum)、蒼耳(Xanthium)、牛蒡(Arctium)、紅花(Carthamus)、向日葵(Helianthus)、薊屬(Cirsium)等多種菊科植物[8]。該病菌的侵染可能與地區(qū)和寄主密切相關(guān)。已報道的引起金雞菊屬花卉白粉病的病原有Erysiphearcuata、P.xanthii和P.fusca[13-15]；金雞菊作為新疆近幾年才引進的花卉品種，對其病原的研究較少，研究中發(fā)現(xiàn)的引起石河子市區(qū)大花金雞菊白粉病的病原形態(tài)學(xué)特征和rDNA-ITS序列分析都與P.fusca幾乎完全一致，由此將引起石河子地區(qū)大花金雞菊白粉病的病原菌確定為棕絲單囊殼P.fusca。

白粉病是一種多循環(huán)病害，以休眠菌絲、閉囊殼或分生孢子在花卉病株或病殘體上越冬，分生孢子借風、雨、昆蟲等傳播引起病害的多次再侵染造成病害的大面積流行。由于棕絲單囊殼的寄主范圍較廣，石河子大花金雞菊白粉病的來源可能有兩種，一是來源于疫區(qū)種苗的調(diào)運，病菌隨種苗傳入；二是來源于當?shù)氐木?，即病菌借風、雨、昆蟲等從附近的其他菊科花卉、雜草等傳播到金雞菊上，造成金雞菊白粉病的發(fā)生和危害。

關(guān)于各種植物白粉病的防治關(guān)鍵是對病害發(fā)生規(guī)律的系統(tǒng)調(diào)查和研究，在病害發(fā)生初期使用藥劑防治依然是目前白粉病防治的關(guān)鍵措施。研究對大花金雞菊白粉病在石河子市區(qū)的發(fā)生規(guī)律進行了系統(tǒng)的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該病害在石河子從4月中旬開始發(fā)生，5～6月是病害的急速增長期，7月后隨著大花金雞菊的開花結(jié)束和休眠病害衰退。對于石河子地區(qū)大花金雞菊白粉病的防治，要在4月中上旬的病害始發(fā)期進行。關(guān)于病菌在石河子市區(qū)的主要越冬場所及菌態(tài)、病害的防治措施等將開展進一步的研究。

4 結(jié) 論

經(jīng)白粉菌形態(tài)特征觀察結(jié)合核糖體 ITS 區(qū)分析，確定引起石河子市大花金雞菊白粉病的病原菌為P.fusca，大花金雞菊白粉病在石河子地區(qū)從4月中旬開始表現(xiàn)癥狀達到始發(fā)期；至6月中旬達到病菌的盛發(fā)期；7月上旬病情指數(shù)開始下降達到病菌的衰退期，完成病害的整個季節(jié)流行。