李云鴿 喬一娜 張力 陳禮光 何天友 倪樂 鄭郁善

摘要?[目的]以厚樸/雷公藤（處理①）、杉木/雷公藤（處理②）、馬尾松/雷公藤（處理③）為3種套種模式，雷公藤純林為CK對(duì)照組，建立不同套種模式下雷公藤甲素的HPLC測(cè)定方法，并對(duì)不同套種模式下雷公藤不同部位甲素的含量進(jìn)行比較。[方法]采用高效液相色譜法（HPLC），色譜柱為SinoChrom ODS-BP（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相為甲醇-水（體積比45∶55）;流速1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)218 nm;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量20 μL。[結(jié)果]該方法能在8 min左右實(shí)現(xiàn)雷公藤甲素的快速分離，雷公藤甲素濃度在1.55～248.00 μg/mL與峰面積線性關(guān)系良好（R2=0.999 7），平均加樣回收率為99.6%，RSD為1.85%（n=6）。[結(jié)論]該方法易操作、分析速度快、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確率高，可作為雷公藤甲素含量的測(cè)定方法。不同套種模式下雷公藤甲素總含量從高到低依次為處理①、CK、處理②、處理③，雷公藤不同部位的雷公藤甲素含量從高到低依次為根、葉、莖，說明厚樸林下套種雷公藤的模式可提高雷公藤甲素的含量，因此可作為優(yōu)質(zhì)林藥間作模式廣泛推廣。

關(guān)鍵詞?套種;雷公藤甲素;含量測(cè)定;高效液相色譜法

中圖分類號(hào)?R?284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2019）23-0219-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.23.063

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Determination of Triptolide in Different Parts of Tripterygium wilfordii in Different Interplanting Patterns by HPLC

LI Yun?ge1， QIAO Yi?na2， ZHANG Li1 et al

（1.College of Landscape Architecture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002; 2.College of Forestry， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002）

Abstract?[Objective] There were three interplanting patterns of Magnolia officinalis/ Tripterygium wilfordii （Treatment 1）， Cunninghamia lanceolata/ Tripterygium wilfordii （Treatment 2）， Pinus massoniana/ Tripterygium wilfordii （Treatment 3）， and the pure forest of Tripterygium wilfordii was CK control group. HPLC method for the determination of triptolide in different interplanting patterns was established， and compared triptolide content in different parts of Tripterygium wilfordii. [Method]High performance liquid chromatography method was used， a SinoChrom ODS?BP 5 μm column （4.6 mm×250 mm）was used at 40 ℃; mobile phase was methanol?water（volume ratio 45：55）; the flow rate was 1. 0 mL/min; the detection wavelength was 218 nm; the injection volume was 20 μL. [Result]The method could achieve rapid separation of triptolide in about 8 minutes. A good linear was obtained within the range of 1.55-248.00 μg/mL（R2=0.999 7）， the average recovery was 99.6%（RSD=1.85%， n=6）.[Conclusion]The method is easy to operate， has fast analysis speed， good reproducibility and high accuracy， and can be used as a method for determining the content of triptolide. The order of total content of triptolide in different interplanting patterns is treatment 1>CK>treatment 2>treatment 3， and the order of triptolide in different parts of Tripterygium wilfordii is root>leaf>stem. It shows that the model of Tripterygium wilfordii under Magnolia officinalis can increase the content of triptolide， so it can be widely promoted as a high quality forest medicine interplanting pattern.

Key words?Intercropping;Triptolide;Content determination;High performance liquid chromatography

雷公藤（Tripterygium wilfordii），是衛(wèi)矛科常見的有毒蜜源植物，是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中常用的中草藥之一。雷公藤甲素，又名雷公藤內(nèi)酯醇（triptolide，T10），外觀呈白色針狀結(jié)晶體，是雷公藤中含量最高、活性和毒性最強(qiáng)的二萜類原生化合物[1]，常作為需求量大的雷公藤片、雷公藤多苷片的主要成分[2]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素及其衍生物可通過多靶點(diǎn)多途徑改善多種疾病，具有抗炎、免疫抑制、抗腫瘤、抗生育、抗病毒、神經(jīng)組織保護(hù)等作用[3-4]。因其在科研的廣泛應(yīng)用和長(zhǎng)期無序采挖致使野生資源急劇減少，供不應(yīng)求[5]，即使雷公藤甲素可生物合成，但其存在合成路線長(zhǎng)、獲得率低、反應(yīng)條件不易創(chuàng)造等局限性，所以從植物中提取雷公藤甲素依然是首要途徑[6]。

林藥間作套種模式是復(fù)合農(nóng)林業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，既能提高林地利用率又可保證藥用植物資源的合理化種植，可調(diào)整林分結(jié)構(gòu)，增加林分內(nèi)生物多樣性，改善土壤條件，提高單位面積的生物總產(chǎn)量[7-10]，其在實(shí)現(xiàn)土地經(jīng)濟(jì)效益最大化的同時(shí)兼顧生態(tài)效益[11]。目前，有關(guān)雷公藤的研究多集中于其活性成分在臨床醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用，如Yang等[12]研究了甘草酸與雷公藤甲素聯(lián)合使用以減輕臟器毒性，王爍陽等[13]利用雷公藤甲素改善內(nèi)毒血癥大鼠心血管功能損傷，僅張亮等[14]、李漢保等[15]研究了雷公藤不同部位的雷公藤甲素含量差異較大。但針對(duì)雷公藤生態(tài)栽培模式影響雷公藤甲素含量的研究較少，因此筆者以套種在厚樸、杉木、馬尾松林下的雷公藤及雷公藤純林作為試驗(yàn)對(duì)象，建立雷公藤甲素含量的測(cè)定方法，并對(duì)不同套種模式下的雷公藤不同部位甲素含量進(jìn)行對(duì)比分析，以期為雷公藤甲素的提取與分離及雷公藤優(yōu)質(zhì)套種經(jīng)營(yíng)模式提供科學(xué)依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料與地點(diǎn)

試驗(yàn)中均以6年生雷公藤作為試材，馬尾松、厚樸、杉木均是同年栽植，長(zhǎng)勢(shì)良好。

設(shè)置4個(gè)處理：雷公藤純林（CK）為對(duì)照組、厚樸和雷公藤套種（處理①）、杉木和雷公藤套種（處理②）、馬尾松和雷公藤套種（處理③），樣地規(guī)模均為20 m×20 m，3次重復(fù)。

試驗(yàn)地點(diǎn)為福建省三明市泰寧縣杉城鎮(zhèn)邱洪村（玉溪工區(qū)）雷公藤種植基地，位于26°56′N、117°09′E，亞熱帶季風(fēng)氣候，年均氣溫15.5～17.2 ℃，最高氣溫38.9 ℃，最低氣溫-10.6 ℃，年平均相對(duì)濕度84%，年平均降水量1 725～1 913 mm，壤土肥力中等，年平均無霜期214～252 d。

1.2?雷公藤甲素測(cè)定方法

1.2.1?色譜條件。

色譜柱為SinoChrom ODS-BP（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相為甲醇-水（體積比45∶55）;流速：1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：218 nm;柱溫：40 ℃;進(jìn)樣量：20 μL。

1.2.2?對(duì)照品溶液的制備。

精密稱取24.80 mg雷公藤甲素標(biāo)準(zhǔn)品，置于50.00 mL容量瓶，用甲醇溶解并定容于刻度線，充分搖勻，配成每1 mL含0.496 mg的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。

1.2.3?供試品溶液的制備。

分別將采自5、7、9月的雷公藤根、莖、葉烘干、研磨、過篩（60目），各取2.00 g于三角瓶中，72 mL甲醇浸提12 h，過濾，蒸餾，加25 mL三氯甲烷萃取3次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，加少量洗脫液（甲醇∶乙酸乙酯∶乙醚=1∶2∶1）洗脫，超聲，溶解殘?jiān)?。加入中性氧化鋁于層析柱，待溶液經(jīng)過層析柱，等量洗脫液洗脫2次，層析完畢，蒸干溶液，甲醇定容至10 mL，濾膜過濾，濾液作為供試品溶液備用。

1.2.4

陰性對(duì)照品溶液的制備。取按處方量除去雷公藤甲素制備樣品，并按“1.2.3”供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

2?方法學(xué)考察

2.1?專屬性考察

在檢測(cè)波長(zhǎng)218 nm、柱溫40 ℃、進(jìn)樣量20 μL、流動(dòng)相為甲醇-水（45∶55）的高效液相色譜條件下，分

別精密吸取對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照品溶液、供試品溶液各20 μL，按“1.2.1”色譜條件進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果表明（圖1～

3），陰性對(duì)照溶液在雷公藤甲素標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰保留時(shí)間段

未出現(xiàn)色譜峰，表明陰性對(duì)照無干擾;且分離度達(dá)到10.17，理論塔板數(shù)不低于1 800，符合要求，表明此方法的專屬性較強(qiáng)。

2.2?線性關(guān)系考察

分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.031 25、0.062 50、0.125 00、1.250 00、2.500 00、5.000 00 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度，搖勻。

在“1.2.1”的色譜條件下，吸取各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別進(jìn)樣20 μL，測(cè)得峰面積，以溶液濃度（x）對(duì)峰面積（y）做線性回歸，得出線性回歸方程y=0.011 6 x+1.359 6（R2=0.999 7），說明雷公藤甲素濃度在1.55～248.00 μg/mL線性關(guān)系良好。

2.3?精密度試驗(yàn)

吸取496 μg/mL雷公藤甲素對(duì)照品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，計(jì)算雷公藤甲素峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.04%，表明儀器精密度良好。

2.4?穩(wěn)定性試驗(yàn)

吸取“1.2.3”配制的雷公藤甲素供試品溶液，在室溫下放置0、2、4、8、12、14、18、24 h分別測(cè)定一次，計(jì)算雷公藤甲素峰面積的RSD為0.96%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5?重復(fù)性試驗(yàn)

取同時(shí)期制備的供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，計(jì)算雷公藤甲素峰面積的RSD為0.96%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.6?加樣回收率試驗(yàn)

分別精確稱量雷公藤供試樣品2.00 g，平行6份，按相同質(zhì)量濃度精確加入0.496 mg/mL雷公藤甲素對(duì)照品溶液，相同的方法測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)平均加樣回收率為99.6%，RSD為1.85%。

2.7?樣品測(cè)定

按“1.2.3”方法制得雷公藤不同部位的供試樣品溶液，再依“1.2.1”色譜條件進(jìn)樣20 μL，計(jì)算含量，結(jié)果詳見表1。從表1可以看出，5、7、9月不同套種模式下雷公藤不同部位甲素含量從高到低依次為根、葉、莖。處理①、處理②、處理③、CK對(duì)照組3個(gè)月的甲素總含量分別為9.754 6、6.754 5、5.196 1、7.526 7 μg/mL，處理①的甲素含量最高，相比CK對(duì)照組高出29.61%，處理②和處理③的甲素含量較CK對(duì)照組分別降低10.26%、30.97%。同時(shí)還可看出，9月份4種處理的甲素含量均升高到最高，其中處理①的甲素含量極高（4.492 7 μg/mL），幾乎為處理②和處理③的2倍。雷公藤在5—9月進(jìn)入生長(zhǎng)期尤其是快速生長(zhǎng)期，次生代謝較快，代謝產(chǎn)物甲素逐漸積累，于9月份甲素含量達(dá)到最高。

3?討論與結(jié)論

在200～450 nm處對(duì)雷公藤甲素進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在218 nm處有最大吸收，因此選定218 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。選用甲醇-水（體積比45∶55）為流動(dòng)相，能使雷公藤甲素與其他活性成分保持穩(wěn)定的游離狀態(tài)，峰形對(duì)稱。通過對(duì)多次均衡進(jìn)樣后的峰面積進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)進(jìn)樣量為20 μL時(shí)，峰面積沒有明顯的變大或變小，較為穩(wěn)定。

樣品溶液的出峰時(shí)間較對(duì)照品出峰時(shí)間推遲了約0.4 min，且出現(xiàn)了不同程度的雜質(zhì)峰，原因可能是樣品溶液的制備過程中混有少量雜質(zhì)，污染了色譜柱，使柱效降低，但對(duì)雷公藤甲素含量及出峰面積沒有影響。

試驗(yàn)結(jié)果表明，不同套種模式下雷公藤甲素含量差異較大，相比雷公藤純林，厚樸林下套種的雷公藤甲素含量提高了29.61%，而杉木、馬尾松林下套種的雷公藤甲素含量則分別降低了10.26%、30.97%;根據(jù)樣品溶液的出峰現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)同種處理下，雷公藤根對(duì)應(yīng)的峰最高、面積最大，葉次之，莖出峰面積最小，因此雷公藤不同部位甲素含量從高到低依次為根、葉、莖。孫乙銘等[16]測(cè)定了不同采收年限雷公藤不同部位的甲素含量發(fā)現(xiàn)根皮甲素含量最高、葉片次之，這與該研究的結(jié)果基本一致。涂育和等[17]測(cè)定了林下套種雷公藤的厚樸林的胸徑和樹高，發(fā)現(xiàn)其比厚樸純林分別高出了14.55%和7.43%。厚樸林下套種雷公藤，雷公藤的生長(zhǎng)表現(xiàn)出了較高的優(yōu)越性，然而厚樸也具有較高的藥用價(jià)值，多作為中藥制劑應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)，但現(xiàn)階段僅對(duì)套種模式中厚樸的形態(tài)特征有少量研究，雷公藤對(duì)厚樸的藥用成分是否有影響需進(jìn)一步研究。

下雷公藤不同部位甲素含量

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