程永樂(lè) 路曉培 蔣瑩 李國(guó)光 陳有君 霍烽 李立民

摘要?采用平板對(duì)峙法從土壤中篩選并鑒定一株馬鈴薯黑痣病的生防菌，并對(duì)該菌株發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，H13菌株的最優(yōu)培養(yǎng)基組成：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，葡萄糖8 g/L，蔗糖6 g/L，干酪素6 g/L，硫酸鎂1 g/L;最佳培養(yǎng)條件為初始pH 7.2，發(fā)酵時(shí)間35 h，接種量300 μL種子液，轉(zhuǎn)速180 r/min，發(fā)酵溫度28 ℃。

關(guān)鍵詞?生防菌;發(fā)酵條件;培養(yǎng)基

中圖分類號(hào)?S?435.42文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2019）23-0153-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.23.044

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Screening of an Antagonistic Strain of Potato Black Nevoid Disease and Optimization of Fermentation Conditions

CHENG Yong?le，LU Xiao?pei，JIANG Ying et al

（College of Life Sciences， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot， Inner Mongolia 010018）

Abstract?A biocontrol strain of potato black nevoid disease was screened and identified by plate confrontation method， and the fermentation medium and fermentation conditions of the strain were optimized. The results showed that the optimum culture medium of strain H13 was tryptone 10 g/L， yeast extract 5 g/L， sodium chloride 10 g/L， glucose 8 g/L， sucrose 6 g/L， casein 6 g/L， magnesium sulfate 1 g/L. The optimum culture conditions were as follow： the initial pH value of 7.2， the fermentation time of 35 h， the inoculum size of 300 μL seed solution， the rotating speed of 180 r/min， and the fermentation temperature of 28 ℃.

Key words?Biocontrol bacteria; Fermentation conditions;Culture medium

馬鈴薯黑痣病是由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起的一種土傳性真菌病害，該病害既可通過(guò)土壤傳播，也可通過(guò)帶病種薯傳播[1]，在世界各國(guó)馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)均普遍發(fā)生，嚴(yán)重影響馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)[2]。目前，馬鈴薯黑痣病主要以化學(xué)防治為主，但化學(xué)農(nóng)藥污染環(huán)境，破壞生態(tài)，對(duì)食品安全產(chǎn)生了嚴(yán)重影響，因此篩選馬鈴薯土傳病的生防菌防治馬鈴薯黑痣病是有效途徑之一，且生防菌對(duì)生態(tài)、人類健康和環(huán)境安全[3]。筆者采用平板對(duì)峙法從土壤中篩選并鑒定一株馬鈴薯黑痣病的生防菌，并對(duì)該菌株發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1?材料與方法

1.1?菌株的分離與鑒定

利用分離芽孢桿菌的方法[4]分離菌株，用平板對(duì)峙法篩選具有拮抗效果的菌株，參考文獻(xiàn)[5]擴(kuò)增16S rRNA基因，PCR產(chǎn)物送至北京博邁德生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2?初始發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

選擇5種不同的發(fā)酵培養(yǎng)基，分別是1/2 R2A培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基、馬丁培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基，接種200 μL H13種子液，在28 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)40 h，測(cè)定發(fā)酵液的OD600，每種發(fā)酵培養(yǎng)基3次重復(fù)。

1.3?碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽的確定

分別加入濃度為0.2%、04%、0.6%、0.8%、1.0%的麥芽糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、葡萄糖、蛋白胨、干酪素、硫酸銨和磷酸氫二胺接種至50/100 mL三角瓶，加入濃度為0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%硫酸鎂、碳酸鈣和磷酸氫二鉀接種至50/100 mL三角瓶，確定最優(yōu)碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽。

1.4?發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

將篩選后得到的最佳碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽3個(gè)重要的培養(yǎng)因素按照正交試驗(yàn)[6-8]L9（34）設(shè)計(jì)，pH為7.0，在28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)40 h，以O(shè)D600作為指標(biāo)考察4因素3水平對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的影響，從而確定最佳培養(yǎng)基配方。

1.5?發(fā)酵條件的優(yōu)化

以優(yōu)化的培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，分別測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)間初始pH（4.3、5.5、5.8、7.2、7.7、8.0、86和9.2）、發(fā)酵溫度（20、25、28、30、35、40 ℃）、發(fā)酵時(shí)間（10、20、30、40、50、60、70 h）、搖床轉(zhuǎn)速（150、160、180、210、230 r/min）、初始接種量（50、100、150、200、250、300、350 μL），對(duì)H13菌株OD600的影響，以初始條件為基礎(chǔ)，每一因素的優(yōu)化均在前一因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上進(jìn)行。

綜上所述，H13的碳源為蔗糖和葡萄糖，最佳氮源為干酪素，最佳無(wú)機(jī)鹽為硫酸鎂;結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果顯示胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，葡萄糖8 g/L，蔗糖6 g/L，干酪素6 g/L，硫酸鎂1 g/L;最佳培養(yǎng)條件為初始pH 7.2，發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵時(shí)間35 h，轉(zhuǎn)速180 r/min，接種量300 μL。

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